王發(fā)英，吳查青，毛菊華，余秋花，王偉影

(麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院，浙江 麗水 323000)

天麻膠囊是由天麻、羌活、獨活、杜仲(鹽炒)、牛膝、粉萆薢、附子(制)、當(dāng)歸、地黃、玄參等10味藥材組成，具有祛風(fēng)除濕、疏經(jīng)通絡(luò)、活血止痛等功效，臨床用于肢體拘攣、手足麻木、腰腿酸痛[1]。天麻和羌活為處方中主要藥物，天麻具有息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)之功效，其主要有效成分為天麻素[2-4]。羌活具有解表散寒，祛風(fēng)除濕，止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，羌活具有抑制癌細(xì)胞增殖、抗氧化、抗炎、抗心律失常、免疫抑制等作用[5]。香豆素、烯炔、酚酸和酚酸酯類化合物是羌活中的主要成分類型，香豆素類異歐前胡素和羌活醇是《中國藥典》中的指標(biāo)性成分，具有較強(qiáng)的抗炎活性；紫花前胡苷為鎮(zhèn)痛抗炎的有效單體化合物[6]。酚酸酯類的阿魏酸苯乙醇酯是羌活中抗氧化和抗血栓的主要活性成分[7]。通過國家局網(wǎng)站批準(zhǔn)文號查詢，全國范圍內(nèi)天麻膠囊的生產(chǎn)企業(yè)共130家，批準(zhǔn)文號133個。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0500-91-2004。本文擬通過法定標(biāo)準(zhǔn)與含量測定(天麻素、羌活醇、異歐前胡素、紫花前胡苷和阿魏酸苯乙醇酯)對市售天麻膠囊進(jìn)行質(zhì)量調(diào)研，為天麻膠囊的質(zhì)量評價與臨床應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；XS105DU、XS104電子天平，瑞士梅特勒公司；DL-360D智能超聲波清洗器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀，默克。

1.2 試 劑

天麻素對照品(批號：110807-202010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.5%)、羌活醇對照品(批號：111820-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、異歐前胡素對照品(批號：110827-201812，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)、紫花前胡苷對照品(批號：11821-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；阿魏酸苯乙醇酯對照品(批號：010037-202009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購自上海鴻永生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，默克)，磷酸(色譜純，麥克林)，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

天麻膠囊，市場隨機(jī)購入40批次，涉及18家生產(chǎn)企業(yè)。樣品信息見表1。

表1 天麻膠囊基本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗

現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0500-91-2004，檢驗項目包括性狀、薄層鑒別、高效液相鑒別、裝量差異、水分、微生物限度。按照法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗，40批樣品均符合所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，合格率為100%。

2.2 含量測定 天麻素

2.2.1 色譜條件[8-9]

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液(3∶97)；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

取天麻素對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含1.020 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取天麻膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，浸泡過夜，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備

以相同的處方比例制得不含天麻的樣品。按“2.2.3”項下的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可見，在該色譜條件下，天麻素與相鄰雜質(zhì)峰均達(dá)到良好分離，分離度大于1.5，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按天麻素計算均在10 000以上。

圖1 HPLC圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項下的對照品溶液1 mL，分別置于5 mL、10 mL、20 mL、50 mL、100 mL的量瓶中，加50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積(Y)對濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=175 53X+6.362 4，r=1.000 0。結(jié)果表明天麻素在10.20～204.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算峰面積RSD為0.86%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗

取同一廠家同一批號的天麻膠囊6份，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備并依法測定，結(jié)果供試品中天麻素含量為0.24 mg/粒，RSD為1.65%。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗

取同一天麻膠囊供試品溶液，分別于0、8、16、24、36、48 h進(jìn)樣，進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算峰面積RSD為1.06%，表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 回收率試驗

取已知含量的天麻膠囊(編號1)，共6份，各取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，均精密加入“2.2.2”項下的對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算天麻素的含量，計算回收率，結(jié)果其回收率平均值98.92%，RSD=1.07%(n=6)。

2.2.11 樣品含量測定

取表1中的40批樣品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算天麻素的含量，結(jié)果見表2。

表2 天麻膠囊中天麻素、紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素的測定結(jié)果(n=2)

2.3 含量測定(羌活醇、異歐前胡素、紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯)

2.3.1 色譜條件[10-12]

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本島津公司)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫：0～25 min，15% A；25～45 min，38%～50% A；45～55 min，50%～75% A；55～70 min，75%～85% A；70～80 min，85% A；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 混合對照品貯備液的配制

精密稱取紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素對照品適量，分別加70%甲醇制成每1 mL含1 690.0 μg，1 562.0 μg，1 360.0 μg，1 305.0 μg溶液，作為對照品貯備液，分別精密量取各對照品儲備液適量，置同一10 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素分別為422.5 μg，312.4 μg，272.0 μg，261.0 μg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的配制

取天麻膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，浸泡過夜，超聲處理40 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備

以相同的處方比例制得不含羌活的樣品。按“2.3.3”項下的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖2。由圖2可見，在該色譜條件下，紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素與其他成分可達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，陰性無干擾，理論塔板數(shù)均在30 000以上，具有良好的分離效果。

圖2 HPLC色譜圖 A-對照品B-供試品C-陰性對照

2.3.6 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液1.0 mL，分別置于5 mL、10 mL、50 mL、100 mL的量瓶中，加70%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，以峰面積(Y)對濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得紫花前胡苷回歸方程為Y=42.257 8X+2.546 2，r=0.999 9，阿魏酸苯乙醇酯回歸方程為Y=27.115 3X+1.224 8，r=0.999 6，羌活醇回歸方程為Y=25.852 9X-2.435 9，r=0.999 9，異歐前胡素回歸方程為Y=30.919 5X-1.886 6，r=0.999 9。結(jié)果表明：紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素分別在4.225～422.5 μg/mL、3.124～312.4 μg/mL、2.720～272.0 μg/mL、2.610～261.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別為1.22%，0.65%，1.52%，0.87%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗

取同一廠家同一批號的天麻膠囊6份，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制備并依法測定，結(jié)果供試品中紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素含量為0.321 8 mg/粒、0.877 5 mg/粒、0.131 0 mg/粒、0.555 3 mg/粒，RSD分別為1.33%、0.98%、1.56%、1.84%。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗

取同一天麻膠囊供試品溶液，分別于0、8、16、24、36、48 h進(jìn)樣，進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別為1.36%，1.44%，1.56%，1.81%，表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 回收率試驗

取已知含量的天麻膠囊(編號20)，共6份，各取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，均精密加入紫花前胡苷對照品儲備液(1 690.0 μg/mL)0.2 mL、阿魏酸苯乙醇酯對照品儲備液(1 562.0 μg/mL)0.5 mL、羌活醇對照品儲備液(1 360.0 μg/mL)0.1 mL、異歐前胡素對照品儲備液(1 305.0 μg/mL)0.5 mL，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素的含量，計算回收率，結(jié)果其回收率平均值依次為紫花前胡苷100.12%(RSD=1.38%，n=6)、阿魏酸苯乙醇酯99.02%(RSD=1.16%，n=6)、羌活醇98.89%(RSD=1.64%，n=6)、異歐前胡素99.45%(RSD=1.05%，n=6)。

2.3.11 樣品含量測定

取表1中的40批樣品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇、異歐前胡素的含量，結(jié)果見表2。

3 討 論

3.1 按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗結(jié)果

按照現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗，40批樣品均符合所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

在檢驗過程中，性狀描述內(nèi)容物為棕色顆粒，結(jié)果有個別樣品顏色過深，顏色較深的樣品用棕色描述欠妥。發(fā)現(xiàn)薄層色譜鑒別獨活和當(dāng)歸的專屬性不足，易被羌活的斑點干擾，不能鑒別出是否含有獨活和當(dāng)歸，因此該方法需要改進(jìn)。

在檢驗完成后發(fā)現(xiàn)，原來粉狀的膠囊內(nèi)容物開始出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，不過鋁塑袋沒有開封的樣品，狀態(tài)完好，說明包裝可靠，打開包裝后，要及時服用。

3.2 天麻素的含量測定

40批樣品中每粒含天麻素為0.019～0.323 mg，平均值為0.167 mg，最大值與最小值相差17倍?！吨袊幍洹?020年版一部，天麻項下含量測定項下規(guī)定，天麻素和對羥基苯甲醇總量應(yīng)不得少于0.25%；按照處方，每粒膠囊或片中含有天麻細(xì)粉約0.06 g，則規(guī)定天麻素含量應(yīng)不得低于0.10 mg，參考其他制法類似和天麻處方用量類似的制劑，確定每粒含天麻素應(yīng)不得低于0.10 mg，結(jié)果有4批樣品低于天麻素含量限度要求。

3.3 紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇和異歐前胡素的含量測定

羌活為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTingexH.T.Chang或?qū)捜~羌活NotopterygiumfranchetiiH.deBoiss.的干燥根及根莖，羌活油潤，有棕色油點，氣味更為濃烈，寬葉羌活顏色較淺，氣味較淡。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[13-15]，均指明羌活中羌活醇與異歐前胡素的比值大于1，在寬葉羌活中比值小于1。根據(jù)含量測定結(jié)果表，18個廠家40批樣品中只有3個廠家計8批樣品使用了質(zhì)量更好的羌活。

《中國藥典》2020版一部羌活含量測定項下規(guī)定，羌活醇和異歐前胡素的總量應(yīng)不得少于0.40%；按照處方，每粒膠囊中含有羌活細(xì)粉0.05 g，按照轉(zhuǎn)移率實驗的結(jié)果，天麻膠囊中羌活醇和異歐前胡素應(yīng)不得少于0.2 mg/粒，則有20批樣品不合格，不合格率為50%。

40批樣品中每粒含紫花前胡苷為0.003～0.408 mg，平均值為0.183 mg，最大值與最小值相差136倍，表明不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品中紫花前胡苷含量差別極大；未檢出羌活醇的有11批，其中4批未檢出異歐前胡素，2批未檢出阿魏酸苯乙醇酯；另外有1批未檢出阿魏酸苯乙醇酯；其中羌活醇、異歐前胡素、阿魏酸苯乙醇酯均為檢出的樣品有2批。眾多廠家的樣品中沒有羌活醇或許并非都是提取未完全的影響，本研究收集到的羌活飲片中，產(chǎn)于甘肅蘭州和甘肅天水的寬葉羌活飲片羌活醇幾乎未檢出，因此有理由相信11批發(fā)現(xiàn)羌活醇含量為零的天麻膠囊中，或許使用了不合格的原料。

4 結(jié) 論

按照所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)檢驗，40批天麻膠囊的合格率為100%，顯示市售天麻膠囊的質(zhì)量情況較好。但是，項目組通過對40批樣品的天麻素、紫花前胡苷、阿魏酸苯乙醇酯、羌活醇和異歐前胡素含量的測定，發(fā)現(xiàn)不同生產(chǎn)企業(yè)的天麻膠囊質(zhì)量差異甚大，產(chǎn)品穩(wěn)定性、均一性較差。為了更好控制天麻膠囊的質(zhì)量，建議盡快提升該品種的法定標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立的天麻素、羌活醇、異歐前胡素、紫花前胡苷和阿魏酸苯乙醇酯指標(biāo)成分含量測定的HPLC法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)升級提供參考依據(jù)。