楊坤，胡鋒，閔慧，梅求安，許明軍

腦卒中是世界上第二大最常見的死因，每年有600萬人死于卒中。急性缺血性卒中是最常見的卒中形式[1-2]。臨床上，卒中的治療僅限于恢復血流的干預措施-藥物或機械溶栓。然而，實際上只有11%的卒中患者實際上接受了組織型纖溶酶原激活劑，而在這些患者中，有一半未能表現(xiàn)出臨床改善。因此，迫切需要確定新的、更有效的缺血再灌注相關方法治療神經(jīng)元損傷[3-4]。tau是一種與微管組裝相關的蛋白質(zhì)，參與維持神經(jīng)元形態(tài)以及軸突和樹突狀過程的形成[5]，為了使tau正常發(fā)揮作用，它需要在特定殘基處被磷酸化。在腦缺血和血管再灌注期間，tau傾向于過度磷酸化，從而導致其聚集，這種現(xiàn)象通常與神經(jīng)變性和細胞死亡相關[6]。tau的病理性積累是一組被歸類為tau病的神經(jīng)退行性疾病的特征[7]。在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中觀察到tau病理學，這可能與缺血性卒中后的腦血管損傷有關，并且可能在卒中中發(fā)揮關鍵作用[8-10]。證據(jù)表明，電針通過各種信號通路減少細胞凋亡，對多器官系統(tǒng)的缺血性損傷發(fā)揮保護作用[11-12],電針通過改善神經(jīng)退行性疾病的認知功能來提供神經(jīng)保護作用[13],電針通過各種途徑減輕炎癥反應來治療腦缺血性損傷[14]。眾所周知，體育鍛煉可能有助于預防和治療卒中。嚙齒動物的跑輪運動可以模仿人類的身體“活躍”生活方式。電針聯(lián)合跑輪訓練既可以發(fā)揮電針的穴位刺激效應，同時可以通過跑輪促進大腦機能恢復。因此，本課題研究電針聯(lián)合跑輪訓練對大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠海馬對腦中動脈閉塞大鼠tau蛋白及磷酸化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只成年雄性SD大鼠(16周齡，質(zhì)量350～450g)購自南京模型動物中心。大鼠都在標準的塑料籠子中飼養(yǎng)，在特定的無病原體條件下以12h的明暗循環(huán)。飼養(yǎng)室的溫度保持在20～25°C，濕度穩(wěn)定在50%～60%。MCAO模型：大鼠急性局灶性腦缺血是由腔內(nèi)MCAO引起的。用于大鼠的4mm遠端尼龍單絲(長30mm，直徑0.16mm)部分涂有直徑為0.21～0.22mm的硅樹脂(澳大利亞)，11mm遠端單絲(長50mm，直徑0.23mm)段涂有用于大鼠的0.28～0.30mm直徑的硅膠。MCAO是通過將單絲通過頸總動脈插入左頸內(nèi)動脈，在頸動脈分叉處前進20～21mm直到感覺到輕微的阻力。在假手術動物中，閉塞細絲僅插入頸動脈分叉上方5mm處。

1.2 方法 在適應1周后，大鼠被隨機分為3組各10只，對照組進行了假手術處理，并安置于沒有跑輪的消毒后的聚丙烯籠中；MCAO組如前所述進行MCAO手術處理后置于消毒后的聚丙烯籠中；觀察組大鼠進行MCAO手術后的第7天，被飼養(yǎng)在帶有直徑12cm跑輪的聚丙烯籠中，每天使用跑輪12h，運動干預持續(xù)時間為10周，同時每天早上8點對該組大鼠進行電針治療，將針直徑0.3mm灸針插入大鼠右肢的外關和足三里穴位約3mm處，用電針治療儀進行電刺激，型號為G6805-II。對大鼠施用連續(xù)波電針治療(20Hz，1mA)30min，每天1次，連續(xù)3周。

1.3 評定指標

1.3.1 組織收集和保存 所有大鼠均采集樣本，取材時間點為大鼠在行為測試后第2天，禁食過夜。將血樣保存在冰上，直到將樣品在4°C下以3000g離心10min。將大腦迅速從顱骨中取出并用冰冷的PBS清洗，立即將左側(cè)海馬和額葉、頂葉-顳葉皮層從全腦中分離出，并儲存在-80℃冰箱。見圖1。

圖1 大鼠腦的大體病理圖

1.3.2 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)染色 TUNEL用于原位染色DNA末端以檢測基因組DNA片段。腦組織切片在暗室中用100μL末端脫氧轉(zhuǎn)移酶反應混合物覆蓋2h。在熒光顯微鏡(DM6000B，徠卡公司，德國)下檢測到同側(cè)丘腦的熒光信號。

1.3.3 莫里斯水迷宮(Morris water maze，MWM)測試 3組干預后進行MWM測試。3組在連續(xù)5d的定向?qū)Ш綔y試中，將小鼠置于充滿水(24±1°C)的圓形水池(直徑：120cm，高度：40cm)中以找到一個隱藏的平臺(水面以下1.0cm)。小鼠在80s內(nèi)找到平臺則試驗終止，讓小鼠在平臺上休息10s。否則，如果80s后沒有找到平臺，則人工引導小鼠到平臺20s進行學習。為了評估空間學習記憶功能，記錄小鼠潛伏期時間及探測試驗時間。

1.3.4 Nissl染色 腹腔注射10%水合氯醛后，從大鼠中分離腦組織并在4°C下在4% PFA中保存3d。將組織進行石蠟包埋并切成30μm厚的切片用于免疫熒光顯微鏡檢查。腦切片用于尼氏染色和免疫熒光。Nissl染色切片經(jīng)受0.1%甲酚紫(默克公司，美國)以評估缺血體積和完整神經(jīng)元的數(shù)量。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡 通過免疫印跡法測定丘腦中tau、p-Tauser396、p-Tause404和凋亡相關蛋白的水平。在深度麻醉下，用50ml冰冷的0.9%鹽水對大鼠進行心內(nèi)灌注。立即在冰上分離左側(cè)丘腦并在細胞裂解緩沖液中勻漿。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上從每個樣品中分離出相同數(shù)量的蛋白質(zhì)，電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(默克公司，美國)上。在室溫下用5%脫脂牛奶的tris緩沖鹽水和0.2% Tween 20 (TBST)封閉膜90min，與兔抗大鼠β-肌動蛋白多克隆抗體(1:1200，Sigma公司)在4°C下孵育過夜，小鼠抗大鼠tau抗體(1:1000，Millipore公司，美國)和 兔抗大鼠p-tau-396單克隆抗體、兔抗大鼠凋亡蛋白Bcl2相關X蛋白(Bcl2 Associated X Protein，Bax)多克隆抗體、兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)多克隆抗體和兔抗大鼠B細胞淋巴瘤/白血病-xl基因(B cell lymphoma/leukemia - XL gene，Bcl-xL)多克隆抗體(1:1000，Abcam 公司，美國)和 小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1:1000)。二抗是抗小鼠 IgG(1:2000，上海碧云天公司)或抗兔 IgG(1:2000)。用 TBST 徹底洗滌后，將膜與 HRP 偶聯(lián)的二抗(1:1000, 7042P2, CST，美國)一起孵育。使用增強的化學發(fā)光試劑盒在放射自顯影膠片上觀察免疫反應性。

1.3.6 免疫組織化學 切片用85℃ 0.01 M 檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)預處理3min，用3%過氧化氫處理15min，在0.1M PBS中沖洗3次。用5%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白在室溫下封閉2h后，將切片與一抗在4°C下孵育過夜，在相同的PBS中沖洗3次。使用小鼠-兔ABC試劑盒(PK-6200)檢測信號。使用了以下一抗：小鼠抗NeuN(1:1000，Abcam 公司，美國)、小鼠抗tau(1:500，Abcam 公司，美國)、兔抗p-Tauser396 -p-Tause404(1:500，ab30665, 英國劍橋?qū)嶒炇?和兔抗 CD68(1:100，Abcam公司，美國)。在4°C下24h。使用熒光顯微鏡分析組織。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色凋亡分析 通過TUNEL染色分析大鼠腦組織中神經(jīng)細胞凋亡，MCAO組TUNEL染色陽性細胞凋亡率較對照組升高(P<0.05)，觀察組TUNEL染色陽性細胞凋亡率較MCAO組降低(P<0.05)。見圖2，表1。

表1 3組大鼠丘腦中TUNEL陽性細胞凋亡情況比較

圖2 TUNEL分析(注：標尺為綠色在右下側(cè)，為100μm)

2.2 MWM行為測試 通過MWM測量大鼠的認知功能，MCAO組發(fā)現(xiàn)隱藏平臺的潛伏期較對照組增加(P<0.05)，探測試驗時間減少(P<0.05)，觀察組發(fā)現(xiàn)隱藏平臺的潛伏期時間較MCAO組減少(P<0.05)，探測試驗時間增加(P<0.05)。見表2。

表2 3組MWM行為測試結(jié)果比較

2.3 凋亡蛋白表達分析 MCAO組Bax蛋白表達較對照組升高(P<0.05)，觀察組Bax蛋白表達較MCAO組降低(P<0.05)，MCAO組Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達較對照組降低(P<0.05)，觀察組Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達較MCAO組升高(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 3組蛋白印跡分析凋亡蛋白表達比較

表3 3組凋亡蛋白表達比較

2.4 大鼠神經(jīng)損傷情況 通過尼氏染色和免疫熒光染色分析大鼠丘腦組織中神經(jīng)元損傷情況，MCAO組完整神經(jīng)元數(shù)量較對照組減少(P<0.05)，觀察組完整神經(jīng)元數(shù)量較MCAO增多(P<0.05)，MCAO組CD68的平均光密度較對照組升高(P<0.05)，觀察組CD68的平均光密度較MCAO組降低(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 3組尼氏和免疫熒光染色情況比較

表4 3組尼氏染色和免疫熒光染色結(jié)果比較

2.5 tau磷酸化水平 通過免疫組織化學檢測大鼠海馬中p-Tau絲氨酸396/404的磷酸化蛋白水平，MCAO組p-Tauser396和p-Tause404磷酸化表達較對照組升高(P<0.05)，觀察組p-Tauser396和p-Tause404磷酸化表達較MCAO組降低(P<0.05)。見圖5，表5。

圖5 3組p-Tau396/404磷酸化表達比較

表5 3組p-Tau396/404磷酸化水平比較

2.6 tau蛋白 通過蛋白印跡分析大鼠海馬中tau蛋白的變化，MCAO組p-Tauser396、p-Tause404和總tau蛋白表達較對照組升高(P<0.05)，觀察組p-Tauser396、p-Tause404和總tau蛋白表達較MCAO組降低(P<0.05)。見圖6，表6。

圖6 3組蛋白印跡分析tau蛋白表達比較

表6 3組tau蛋白表達情況比較

3 討論

tau蛋白是一種微管相關蛋白，是細胞骨架的重要組成部分，是確保微管系統(tǒng)完整性和穩(wěn)定性的關鍵[15]。大腦皮層和海馬中由過度磷酸化的tau蛋白組成的細胞外Aβ斑塊和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)是卒中后腦部的典型病理變化。tau過度磷酸化導致的NFT沉積被認為是卒中后腦損傷的早期病理標志[16]。微管相關蛋白tau在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的軸突中高度表達。其與微管的結(jié)合可以維持微管的穩(wěn)定性，這對于維持正常的軸突質(zhì)運輸和突觸可塑性具有重要意義[17]。過度磷酸化tau蛋白的聚集或其降解紊亂有助于NFT在神經(jīng)元中的沉積。NFTs在神經(jīng)元樹突棘的沉積介導Aβ的神經(jīng)毒性，導致樹突棘的缺失和形態(tài)改變，直接導致神經(jīng)元突觸功能受損。隨著全球老齡化的加速，卒中的患病率正在增加。因此，為這種破壞性疾病找到一種有效的治療方法至關重要且緊迫。預防tau過度磷酸化和自噬降解缺陷導致的神經(jīng)原纖維纏結(jié)積累可能是一種有前途的卒中后干預策略[18]。因此，本研究對tau蛋白和tau相關蛋白表達進行了測試。

電針是在傳統(tǒng)針灸和電療的基礎上，作為預防和治療卒中的工具[19]。電刺激針療法能有效改善缺血性腦卒中患者上肢運動功能，與單純手法針刺相比，效果更好。研究顯示，缺血性卒中的電針治療可能是從影響神經(jīng)遞質(zhì)與基因表達，血流變、干預蛋白或其他超微結(jié)構等方面來體現(xiàn)其療效的。此外，已有文獻表明，其機制可能是通過抑制炎癥反應，對血清蛋白的改變，改善腦血流，保護神經(jīng)元等方面實現(xiàn)。臨床上，電針治療通常通過卒中患者的外關和足三里穴位進行。多項實驗研究表明，在穴位外關或足三里處進行電針刺激可為腦缺血大鼠提供神經(jīng)保護作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)炎癥反應中發(fā)揮重要的功能作用。星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活與神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病引起的神經(jīng)炎癥密切相關。研究表明，針灸可通過多種途徑對卒中產(chǎn)生保護作用，如減輕神經(jīng)炎癥、抑制Aβ蛋白沉積和tau過度磷酸化、增強葡萄糖腦代謝、減少氧化應激和抑制神經(jīng)元凋亡[20]。來自臨床試驗和動物研究的越來越多的證據(jù)表明，針灸可能是治療卒中后認知功能障礙的潛在方法。

本研究表明，如果在MCAO的早期和癥狀前階段開始跑輪運動，可能會觀察到跑輪運動對MCAO病理學的保護和有益作用。筆者分析認為，在卒中患者死后的大腦、血漿和腦脊液中存在不同程度的代謝紊亂。代謝特征受損與認知評分、海馬體積和皮質(zhì)厚度以及總tau和p-tau生物標志物相關，有氧運動對tau磷酸化和相關tau激酶具有保護作用。此外，運動可以改變參與多種代謝途徑的代謝物的平均濃度。

本研究還表明，MCAO大鼠記憶缺陷會導致行為表現(xiàn)受損，這表明MCAO模型組中受損的空間記憶使使用標記點找到平臺變得更加困難，并表明該模型是成功的。然而，大鼠進行電針聯(lián)合跑輪訓練后導致逃逸潛伏期顯著降低，這表明電針聯(lián)合跑臺訓練能夠改善MCAO大鼠的認知能力并改善了記憶缺陷。同時，電針聯(lián)合跑輪訓練通過增強MCAO大鼠的學習和記憶能力有效地改善了MWM性能。筆者分析認為，電針聯(lián)合跑輪訓練治療是可以減輕tau過度磷酸化導致的記憶缺陷和神經(jīng)損傷，MCAO大鼠認知功能的改善可能與其tau磷酸化和tau蛋白水平有關，包括絲氨酸396和404在內(nèi)的多個位點的異常磷酸化。因此，電針與跑臺訓練兩種療法聯(lián)合應用能改善局灶性腦缺血后大鼠神經(jīng)功能，同時減小腦梗死體積，減少細胞凋亡率，減輕局灶性腦缺血引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。電針聯(lián)合跑輪運動導致MCAO大鼠海馬和皮質(zhì)中p-Tauser396和404的減少，即tau磷酸化的減少可能是MCAO大鼠認知功能改善的部分原因。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，電針聯(lián)合跑輪訓練可通過抑制tau過度磷酸化和tau蛋白表達減少MCAO大鼠腦神經(jīng)損傷并改善學習和記憶能力。