徐堅(jiān)旺,江海都,陳泰國(guó),熊忠臣,韋 霄,柴勝豐**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西桂林 541006;2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541004)

石斛屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)植物第二大屬。在中國(guó),石斛屬植物種類超過(guò)80種,主要分布于云南、廣西、貴州、四川、廣東等省區(qū)[1]。石斛被譽(yù)為九大仙草之首,種類繁多,分布地區(qū)廣。不同種類的石斛花朵具有不同的外部形態(tài)、花朵結(jié)構(gòu)、顏色以及揮發(fā)性氣味,且花期長(zhǎng),觀賞性強(qiáng),深受國(guó)人喜愛(ài)[2]。部分石斛除了觀賞價(jià)值,還具有較高的藥用價(jià)值,有抗癌[3]、抗氧化[4]等功效。植物的花香具有提高觀賞價(jià)值、幫助繁育、抵御侵害等作用。研究人員從植物花朵中分析出的各種揮發(fā)性物質(zhì),促進(jìn)了精油、護(hù)膚品等衍生產(chǎn)品的開發(fā)。呂素華等[5]采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù),從鐵皮石斛(D.officinale)花朵中共分析出的51個(gè)揮發(fā)性成分以萜烯類、脂肪族類和芳香族類為主。王元成等[6]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)分析了細(xì)葉石斛(D.hancockii)和翅梗石斛(D.trigonopus)花朵的賦香成分,共發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性成分87個(gè),細(xì)葉石斛花朵中含有52個(gè),翅梗石斛花朵中含有35個(gè),且主要成分種類皆為萜烯類,二者共有的主要成分為羅勒烯和β-石竹烯。

傳統(tǒng)的植物揮發(fā)油成分提取方法主要有水蒸氣蒸餾法(SD)、索氏提取法等[7],傳統(tǒng)方法成本低,但耗材過(guò)多,提取效率低。固相微萃取法(SPME)是將取樣、濃縮、進(jìn)樣一體化,可結(jié)合其他檢測(cè)儀器聯(lián)合使用,具有檢測(cè)快速、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[8,9]。宋小蒙等[10]分別采用SPME和SD兩種方法提取金釵石斛(D.nobile)花朵揮發(fā)性成分,發(fā)現(xiàn)兩種方法雖然共鑒定出69種化合物,但兩者相差較大,其中采用SPME方法分析出63種化合物,而采用SD法僅分析出24種化合物。因此,本研究使用SPME法結(jié)合GC-MS技術(shù),測(cè)定并分析羅河石斛(D.lohohense)、球花石斛(D.thyrsiflorum)、喇叭唇石斛(D.lituiflorum)、紫瓣石斛(D.parishii)、黃石斛(D.catenatum)和始興石斛(D.shixingense)花朵的揮發(fā)性成分,擬為香型石斛的繁育及其精油、化妝品等衍生產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為栽培于廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所石斛種質(zhì)資源圃的羅河石斛、球花石斛、喇叭唇石斛、紫瓣石斛、黃石斛和始興石斛。

1.2 儀器

手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器(美國(guó)SUPELCO公司),50 mL棕色螺紋取樣瓶,氣相色譜-質(zhì)譜儀GC-MS (6890N-5975B,美國(guó)Agilent公司),水浴鍋(上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 GC-MS分析

根據(jù)不同石斛的花期,在2022年5月上旬10:00-12:00,摘取6種石斛正在盛開的花朵,平均每種采摘5朵,放入50 mL棕色螺紋取樣瓶中保存,插入提前處理好的50/30 μm PDMS/CAR/DVB 纖維頭,設(shè)置溫度為40 ℃,頂空萃取30 min。萃取結(jié)束,將纖維頭拿出,使用GC-MS進(jìn)行分析。每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

色譜條件:HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);流速1 mL·min-1;載氣為高純度氦氣(99.99%),不分流模式。程序升溫:進(jìn)樣口溫度250 ℃,起始柱溫35 ℃保持2 min,先以5 ℃·min-1升至80 ℃,再以8 ℃·min-1升至180 ℃,最后以8 ℃·min-1升至250 ℃。

質(zhì)譜條件:進(jìn)樣口溫度維持在250 ℃,離子源溫度為230 ℃,電離方式為EI,電子能量70 eV,GC-MS傳輸線溫度為250 ℃,掃描范圍為30-500 amu。

1.4 鑒定方法

通過(guò)SPME法結(jié)合GC-MS技術(shù)得到6種石斛花朵的總離子流色譜圖,將色譜圖中各個(gè)波峰進(jìn)行解析,得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖,最后使用軟件Xcalibur1.2和美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST98)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中的物質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),用離子流峰面積歸一化法計(jì)算所檢測(cè)出的揮發(fā)性成分的相對(duì)含量總占比。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種石斛花朵中揮發(fā)性成分類別比較

根據(jù)6種石斛花朵中揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果,共鑒別出106種揮發(fā)性物質(zhì),其主要成分的種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類(表1)。由表1可知,不同種類石斛花朵揮發(fā)性成分的類別均不相同,6種石斛花朵的揮發(fā)性成分均含有萜烯類和烷烴類,羅河石斛和喇叭唇石斛萜烯類成分的相對(duì)含量較高,分別是88.68%和87.64%。球花石斛和黃石斛烷烴類成分的相對(duì)含量較高,分別為72.38%和40.47%。紫瓣石斛和黃石斛的烷烴類和酯類成分相對(duì)含量較高,紫瓣石斛的含量分別為31.42%、41.73%,黃石斛的含量分別為40.47%、39.19%。始興石斛與其他5種石斛不同,其組分中的醇類與烷烴類成分相對(duì)含量較高,分別為44.61%、32.57%。

表1 6種石斛的揮發(fā)性成分類別

球花石斛花朵的揮發(fā)性成分含有20種物質(zhì),其中有14種烷烴類成分,3種萜烯類成分,1種酮類,2種醇類,除烷烴類成分外,萜烯類、酮類、醇類的相對(duì)含量分別為17.45%、5.36%、4.83%。羅河石斛的揮發(fā)性成分含有18種物質(zhì),其中有11種萜烯類成分,4種烷烴類成分,1種芳香族化合物,1種酯類成分,1種含氮化合物,除萜烯類成分外,其余揮發(fā)性成分種類相對(duì)含量分別為7.48%、1.67%、1.29%、0.88%。喇叭唇石斛的揮發(fā)性成分所含物質(zhì)最多,有45種,其中有20種萜烯類成分,10種烷烴類成分,7種芳香族化合物,4種酯類成分,3種酮類,1種醇類,除萜烯類成分外,其余揮發(fā)性成分種類相對(duì)含量相對(duì)較少,分別為3.47%、3.98%、4.42%、0.36%、0.13%。紫瓣石斛含有13種組分,其中2種酯類和2種烷烴類成分相對(duì)含量較高,分別為41.73%和31.42%,其余種類成分相對(duì)含量較低,1種萜烯類成分,3種芳香族化合物,3種含氮化合物,2種酮類,分別為3.21%、4.39%、4.90%、14.34%。黃石斛含有21種組分,其中5種烷烴類和2種酯類成分相對(duì)含量較高,分別為40.47%和39.19%,其余種類相對(duì)含量較低,3種萜烯類成分,1種芳香族化合物,6種含氮化合物,2種酮類,1種醇類,分別為5.17%、1.32%、11.13%、1.64%、1.10%。始興石斛的揮發(fā)性成分含有11種物質(zhì),其中3種烷烴類和3種醇類成分相對(duì)含量較高,分別為32.57%和44.61%,其余種類相對(duì)含量較低,4種萜烯類成分,1種酮類成分,相對(duì)含量分別為15.35%、7.48%。結(jié)果表明,不同種類的石斛花朵中揮發(fā)性成分類別和相對(duì)含量均存在差異,所含類別數(shù)量和相對(duì)含量并無(wú)明顯的關(guān)系。

2.2 6種石斛花朵揮發(fā)性成分分析

表2統(tǒng)計(jì)了采用SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)從6種石斛花朵中所檢測(cè)出化合物匹配度≥80的揮發(fā)性成分。由表2可知,在6種石斛花朵中共檢測(cè)出106種揮發(fā)性物質(zhì)。6種石斛花朵中均含有十甲基環(huán)戊硅氧烷,其在羅河石斛、喇叭唇石斛中相對(duì)含量較低,分別為1.35%、0.96%;在球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛中相對(duì)含量均較高,分別為22.04%、25.86%、20.58%、21.66%,十甲基環(huán)戊硅氧烷是球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛的主要揮發(fā)性成分之一。羅河石斛與喇叭唇石斛的揮發(fā)性成分以萜烯類為主,α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在羅河石斛中相對(duì)含量較高,分別為26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%;喇叭唇石斛有45個(gè)揮發(fā)性成分,羅勒烯和佛術(shù)烯是其主要成分,二者的相對(duì)含量分別為73.98%和5.66%。紫瓣石斛和黃石斛揮發(fā)性成分的主要成分為酯類和烷烴類,{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯為紫瓣石斛揮發(fā)性成分的主要成分,相對(duì)含量為41.40%;對(duì)甲苯甲酸十八烷基酯為黃石斛揮發(fā)性成分的主要部分,相對(duì)含量為37.96%。始興石斛較其他5種石斛不同,3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇為始興石斛揮發(fā)性成分的主要組成部分,其相對(duì)含量為39.86%。八甲基環(huán)四硅氧烷在球花石斛、黃石斛中均被檢測(cè)到,但相對(duì)含量較少,分別為1.72%、2.26%;石竹烯在球花石斛和喇叭唇石斛中均有被檢測(cè)到,相對(duì)含量分別為6.59%、2.61%;α-蓽澄茄油烯在紫瓣石斛和黃石斛中均被檢測(cè)到,相對(duì)含量較少,分別為3.21%和1.37%;桉樹醇在黃石斛和始興石斛中均被檢測(cè)到,相對(duì)含量較少,分別為1.10%和2.56%;(1R)-(+)-α-蒎烯在球花石斛和羅河石斛中均有存在,但在球花石斛中相對(duì)含量較多,為9.12%,羅河石斛中相對(duì)含量較少,為0.93%;羅勒烯在喇叭唇石斛為主要成分,但在黃石斛中相對(duì)含量較少,僅為1.46%;α-蒎烯在羅河石斛和始興石斛均有存在,但在羅河石斛中含量較高,在始興石斛中含量較低,僅為6.52%;β-月桂烯和D-檸檬烯在羅河石斛和喇叭唇石斛中均被檢測(cè)到,但其在羅河石斛中含量相對(duì)較高,分別為9.31%和13.77%,在喇叭唇石斛中僅分別為0.21%、0.10%。

表2 6種石斛花揮發(fā)性成分分析

除各石斛揮發(fā)性成分的共同組分之外,還存在個(gè)別的特殊揮發(fā)性成分。1,3,5,7,9-五乙基環(huán)戊硅氧烷僅在喇叭唇石斛中被檢測(cè)到,其相對(duì)含量較少,為0.17%;3,3-二甲基己烷僅在球花石斛中被檢測(cè)到相對(duì)含量為9.07%;β-水芹烯僅在羅河石斛中被檢測(cè)到,且相對(duì)含量較高,為22.96%。2-十三酮僅在紫瓣石斛中被檢測(cè)到,相對(duì)含量為10.78%;1,3,5,7,9-五乙基環(huán)五硅氧烷僅在黃石斛中被檢測(cè)到,相對(duì)含量為11.13%。

3 討論

3.1 6種石斛花朵中主要賦香成分

花香是由花朵自然產(chǎn)生的一種芳香物質(zhì),屬于植物釋放的次級(jí)代謝產(chǎn)物。不同的花香含有不同的揮發(fā)性物質(zhì),其中相對(duì)含量較高且香氣值(釋放濃度/嗅感閾值)較大的揮發(fā)性物質(zhì),可推測(cè)其為香味的主要賦香成分[11,12]。研究報(bào)道,十甲基環(huán)戊硅氧烷以及硅氧烷化合物被廣泛用于化妝品、精油等個(gè)人洗護(hù)產(chǎn)品中的芳香劑、除臭劑等[13-15]。α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯、石竹烯、羅勒烯、佛術(shù)烯等物質(zhì)為香味的主要賦香成分,可提供豐富的香氣[16,17]。羅勒烯具有植物香味并伴有橙花油氣息,甜香味強(qiáng)烈,常被作為各種精油產(chǎn)品的香味添加劑[18];D-檸檬烯為單環(huán)單萜烯,似甜橙清新香味,有抗炎、抗菌等藥理作用[19,20],香氣閾值為10 g/m3[21];月桂烯具有清淡的香脂氣味,有抗炎、抗氧化等藥理作用[22,23],香氣閾值為13-15 g/m3[21];石竹烯為辛香、木香和溫和的丁香香味,讓人心曠神怡,具有平喘、消痰等藥理作用[24-27]。各種酯類物質(zhì)也是花香的重要組成部分,例如苯甲酸甲酯具有清新的甜香味[28],水楊酸甲酯具有特殊草藥氣味,且有消炎、止痛等藥理作用[29]。

α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在羅河石斛中相對(duì)含量較高,分別為26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%,α-蒎烯、β-水芹烯可能是羅河石斛的主要賦香成分,D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯為次要賦香成分。十甲基環(huán)戊硅氧烷、(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯在球花石斛中相對(duì)含量較高,分別為22.04%、9.12%、6.59%,其中十甲基環(huán)戊硅氧烷可能是球花石斛的主要賦香成分之一,(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯可能是其次要賦香成分。羅勒烯在喇叭唇石斛中的相對(duì)含量高達(dá)73.98%,這一成分可能是其獨(dú)特的賦香成分。紫瓣石斛、黃石斛和始興石斛均被檢測(cè)出獨(dú)特的揮發(fā)性成分,{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯在紫瓣石斛中相對(duì)含量為41.40%,可能是其特征香氣成分;黃石斛中對(duì)甲苯甲酸十八烷基酯的相對(duì)含量為37.96%,可能是其主要獨(dú)特的香氣成分;3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇是始興石斛中的特征性成分,相對(duì)含量為39.86%,可能是其主要賦香成分之一。

3.2 6種石斛花朵中揮發(fā)性成分差異分析

本研究主要采用SPME法結(jié)合GC-MS技術(shù)分析了6種石斛花朵的揮發(fā)性成分種類及其相對(duì)含量,共鑒別出106種揮發(fā)性物質(zhì),主要成分種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類。6種石斛花朵中揮發(fā)性成分檢測(cè)數(shù)量為11-45種,個(gè)別石斛存在較大差異。始興石斛鑒別出11種成分,含有獨(dú)特的揮發(fā)性成分,其主要成分為醇類,而這類物質(zhì)在其他5種石斛中含量極小或者未被檢測(cè)出來(lái)。喇叭唇石斛揮發(fā)性成分較其他石斛復(fù)雜,具體體現(xiàn)在揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量較多,共鑒定出45種香氣成分,同時(shí)含有6類揮發(fā)性成分,其主要成分為萜烯類。黃石斛所含揮發(fā)性成分類別最多,有7類揮發(fā)性成分,但其香氣成分只有21種,其主要成分為烷烴類和酯類。球花石斛主要的揮發(fā)性成分為烷烴類,羅河石斛和喇叭唇石斛較為相近,主要的揮發(fā)性成分為萜烯類。紫瓣石斛和黃石斛均以烷烴類和酯類為主。6種石斛的揮發(fā)性成分差異較大,僅十甲基環(huán)戊硅氧烷為其共有成分,且每種石斛主要香氣成分皆不相同。十甲基環(huán)戊硅氧烷在球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛中含量均較高,但在羅河石斛和喇叭唇石斛中含量極小。曹樺等[30]對(duì)4種香花型石斛盛花期花朵的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定和分析,共鑒定出揮發(fā)性成分80種,其中共有揮發(fā)性成分僅有2種,4種香花型石斛的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量具有明顯差異,均含有其特征香氣成分。王元成等[31]采用SPME法結(jié)合GC-MS技術(shù)研究5種石斛花朵的揮發(fā)性成分,共鑒定出110個(gè)成分,花香成分以萜烯類化合物為主,其中羅勒烯、D-檸檬烯、芳樟醇相對(duì)含量較高;檢測(cè)的棒節(jié)石斛(D.findlayanum)的獨(dú)有成分有14個(gè),5種石斛花朵之間的揮發(fā)性成分存在明顯差異。顏沛沛等[32]研究1 d內(nèi)6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)報(bào)春石斛(D.polyanthum)花朵中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量變化,發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯在下午時(shí)間段的相對(duì)含量較高,但是王元成等[31]在上午采樣中,并未發(fā)現(xiàn)此成分,其余主要成分大致相同。李崇暉等[33]研究鼓槌石斛(D.chrysotoxum)和細(xì)葉石斛(D.hancockii)花朵中3-蒈烯的相對(duì)含量均最高,均未檢測(cè)到順式-β-羅勒烯,(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量極低,石竹烯在細(xì)葉石斛中未被檢測(cè)出。夏科等[34]檢測(cè)到的鼓槌石斛中順式-β-羅勒烯和(1R)-(+)-α-蒎烯含量較高,但并未檢測(cè)到3-蒈烯,細(xì)葉石斛中順式-β-羅勒烯和石竹烯相對(duì)含量較高。李崇暉等[33]與夏科等[34]對(duì)相同種的石斛的香氣成分檢測(cè)結(jié)果存在差異。

這些研究結(jié)果表明,石斛屬不同種之間的花朵揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量和含量均存在差異,甚至相同種石斛揮發(fā)性成分檢測(cè)也可能存在差異,原因可能是石斛種植地域和生長(zhǎng)環(huán)境因子的不同,也可能是對(duì)石斛花朵揮發(fā)性成分提取的方法不同,還可能是石斛花朵中揮發(fā)性成分以及含量會(huì)隨著開花時(shí)間的變化而變化,不同的采樣時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分存在差異。

4 結(jié)論

本研究采用SPME法結(jié)合GC-MS技術(shù),分析了6種石斛花朵的揮發(fā)性成分種類及其相對(duì)含量。共鑒別出106種揮發(fā)性物質(zhì),主要成分種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類。6種石斛花朵的揮發(fā)性成分均含有萜烯類和烷烴類,并且這兩類成分均為6種石斛花朵的主要揮發(fā)性成分。6種石斛均含有十甲基環(huán)戊硅氧烷,但相對(duì)含量存在差異。球花石斛主要賦香成分為十甲基環(huán)戊硅氧烷;羅河石斛主要特征香氣成分為α-蒎烯、β-水芹烯;喇叭唇石斛的獨(dú)特香氣成分為羅勒烯;紫瓣石斛的主要賦香成分為{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯和十甲基環(huán)戊硅氧烷;黃石斛的主要特征香氣成分為對(duì)甲苯甲酸十八烷基酯和十甲基環(huán)戊硅氧烷;始興石斛的獨(dú)特香氣成分為3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇和十甲基環(huán)戊硅氧烷。不同種類的石斛花朵揮發(fā)性成分不同,主要成分的組成和相對(duì)含量存在較大差異,研究結(jié)果對(duì)香型石斛種類的選育及其衍生產(chǎn)品的開發(fā)具有重要參考價(jià)值。