潘李潑,唐健民,陳泰國,朱舒靖,鄒 蓉,韋 霄**

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣西桂林 541006;2．廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林 541006;3．桂林醫(yī)學(xué)院,廣西桂林 541199)

光合作用是植物最基本且最重要的生理代謝之一,光合作用的強弱對植物的生長和物質(zhì)積累代謝具有十分重要的影響[1]。自身因素和生態(tài)因素是影響光合作用的主要因素,植物光合作用的強弱既受自身葉片結(jié)構(gòu)的影響,也受環(huán)境因子的限制[2]。葉片是植物進行光合作用的主要場所,是與外界接觸最多的區(qū)域,也是對環(huán)境因子變化較為敏感且反應(yīng)較大的器官[3]。植物在不同的生長時期對外界環(huán)境因子的需求不同,表現(xiàn)出不同的光合特性,且光合作用對植物整個生活史的生理代謝都具有重要影響[4]。因此,了解植物不同時期的光合特性,對拯救瀕危植物具有重要意義。

單性木蘭(Kmeriaseptentrionalis)隸屬于木蘭科(Magnoliaceae)單性木蘭屬(Kmeria),是我國特有的珍稀瀕危植物和國家一級重點保護野生植物,具有極高的科學(xué)研究價值。目前僅分布于廣西河池市環(huán)江毛南族自治縣和羅城仫佬族自治縣、貴州黔南布依族苗族自治州荔波縣、云南文山壯族苗族自治州麻栗坡縣和馬關(guān)縣等喀斯特石灰?guī)r山地中,多數(shù)呈零散分布,僅于廣西木論國家級自然保護區(qū)內(nèi)有成片分布[5]。單性木蘭有著通直的樹干和橢圓形的聚合果,是材質(zhì)優(yōu)良的木材,且具有一定的觀賞價值,其花、葉和枝條還可以提煉香油。單性木蘭作為喀斯特環(huán)境特有植物,養(yǎng)分、水分和光照等環(huán)境因子是限制其種群擴散的主要原因。光合作用是植物生長發(fā)育和賴以生存的基礎(chǔ),而葉片結(jié)構(gòu)則是影響植物光合速率的一個重要因素。目前已經(jīng)開展了單性木蘭的種子貯藏與萌發(fā)[6,7]、組織培養(yǎng)[8]、群落凋落物持水特性[9]、提取工藝[10,11]等研究,同時也對其在干旱脅迫[12]、溫度脅迫和鈣脅迫[13]等方面進行了探索,但對單性木蘭光合作用的研究主要集中在植物間的比較或者是改變外界環(huán)境因子而產(chǎn)生的變化差異上,而關(guān)于其葉片結(jié)構(gòu)與光合功能之間關(guān)聯(lián)性的研究較少。鑒于此,本研究以單性木蘭幼苗和成年植株為試驗材料,分析其幼苗與成年植株葉片結(jié)構(gòu)和光合特性的差異情況,并借助相關(guān)性分析和冗余分析探究其葉片結(jié)構(gòu)與光合生理內(nèi)在的聯(lián)系,以期為單性木蘭的引種栽培提供科學(xué)理論依據(jù),為大規(guī)模培育種植提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣西河池市環(huán)江毛南族自治縣,地處云貴高原東南麓,居廣西壯族自治區(qū)西北部、河池市東北部。地理位置為北緯24°44′-25°33′,東經(jīng)107°51′-108°43′。屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候,年平均氣溫20.3 ℃,年平均降水量1 399.7 mm,年平均雨日為137-187 d,年降水量約80%集中在4-8月份;冬短夏長,平均無霜期293-366 d。土壤為赤紅壤。

1.2 材料

以野生單性木蘭幼苗和成年植株為試驗對象,幼苗與成年植株皆生長狀況良好且無病蟲害。選取幼苗和成年植株各3株,幼苗選擇林下幼苗,要求長勢基本一致,每株選擇位置朝向相同、大小基本一致且長勢旺盛的葉片,進行重復(fù)測定。

1.3 方法

1.3.1 光合-光響應(yīng)曲線測定

采用便攜式光合儀(Li-6400XT,北京力高泰科技有限公司)LED紅藍光源葉室測定葉片的凈光合速率(Pn),測定時間為2022年9月下旬晴朗天氣的9:00-11:00,測定時選取健康、無病蟲害的完整葉片,測量前將待測葉片在600 μmol·m-2·s-1光照強度下誘導(dǎo)15 min。使用開放氣路,空氣流速設(shè)為500 mL·min-1,葉片溫度為28 ℃。設(shè)定的光照強度梯度分別為1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1,測定時每一個光照強度下停留120-200 s。以光量子通量密度(PFD)為橫軸,凈光合速率為縱軸繪制光合-光響應(yīng)曲線。

1.3.2 光響應(yīng)參數(shù)測定與計算

測定方法同1.3.1節(jié),以光量子通量密度為橫軸,分別以氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)為縱軸繪制光合-光響應(yīng)曲線。采用葉子飄[14]的光合計算軟件4.1.1的雙曲線修正模型對光合-光響應(yīng)曲線進行擬合,并計算表觀量子效率(AQY)、最大凈光合速率(Pmax)、光飽和點(LSP)、光補償點(LCP)和暗呼吸速率(Rd)等參數(shù)。

1.3.3 葉綠素含量測定

從進行光合測定的植株上采集成熟度、葉片位置、葉片大小一致的葉片進行生理指標(biāo)的測定。取0.2 g完整葉片,用95%的乙醇浸泡24 h。用紫外可見分光光度計(Alpha 1502,上海譜元儀器有限公司)分別在470、649、665 nm的波長下測定吸光值(A),參考李合生[15]的方法計算葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、類胡蘿卜素(Car)的含量,以及葉綠素a與葉綠素b的比值(Chla/Chlb)、類胡蘿卜素與總?cè)~綠素的比值[Car/Chl (a+b)]。計算公式如下:

葉綠素a濃度(Ca,mg·L-1)=13.95A665-

6.88A649,

(1)

葉綠素b濃度(Cb,mg·L-1)=24.96A649-

7.32A655,

(2)

類胡蘿卜素濃度(Cxc,mg·L-1)=

(3)

1.3.4 葉片結(jié)構(gòu)解剖

將新鮮葉片沿著橫截面切成4小塊,然后立即放入2.5%的戊二醛固定液中固定,固定后用乙醇進行梯度脫水(分別為30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次,100%乙醇2次,15 min/次),在臨界點干燥脫水并鍍金,在真空電子掃描鏡(ZEISS EVO18,德國卡爾蔡司公司)下觀察、拍照。再使用Axio Vision SE64 Rel.4.9.1掃描電鏡配套軟件,測定葉片厚度(Leaf Thickness,LT)、上表皮厚度(Upper Epidermal Thickness,UET)、下表皮厚度(Lower Epidermal Thickness,LET)、柵欄組織厚度(Palisade Parenchyma Thickness,PPT)、海綿組織厚度(Spongy Parenchyma Thickness,SPT)、氣孔面積(Stomatal Area,SA)、氣孔縱軸長度(Stomata Length,SL)、氣孔橫軸長度(Stomata Width,SW),并計算出柵海比(PPT/SPT)和氣孔密度(Stomatal Density,SD)。其中,氣孔密度=視野氣孔個數(shù)(個)/視野面積(mm2)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2016對光合-光響應(yīng)曲線、葉綠素含量、葉片結(jié)構(gòu)等參數(shù)進行初步分析。使用Origin 2021軟件繪制圖表,利用SPSS Statistics 26進行單因素方差分析,采用Canoco 5.0進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單性木蘭幼苗與成年植株光合-光響應(yīng)曲線比較

單性木蘭幼苗和成年植株光合-光響應(yīng)曲線變化趨勢基本一致,均呈先急劇升高后趨于平緩的趨勢,但最大凈光合速率存在明顯差異(圖1)。在各光量子通量密度下單性木蘭成年植株的凈光合速率整體都要高于幼苗。由表1可知,成年植株和幼苗的光飽和點分別為915.291 1 μmol·m-2·s-1和693.840 6 μmol·m-2·s-1,當(dāng)光量子通量密度超過光飽和點后,凈光合速率不再升高。成年植株光飽和點顯著高于幼苗,可見其對強光的利用能力遠高于幼苗,而幼苗對弱光的利用能力較好。

表1 單性木蘭幼苗與成年株光響應(yīng)參數(shù)比較

圖1 單性木蘭幼苗和成年植株的光合-光響應(yīng)曲線

2.2 單性木蘭幼苗和成年植株光響應(yīng)參數(shù)比較

單性木蘭成年植株的表觀量子效率、最大凈光合速率、光飽和點和暗呼吸速率均高于幼苗,僅光補償點低于幼苗(表1)。單性木蘭幼苗及成年植株的最大凈光合速率和光飽和點有顯著性差異,而表觀量子效率、光補償點和暗呼吸速率無顯著性差異(表1)。

2.3 單性木蘭幼苗與成年植株的Gs、Tr、Ci光合-光響應(yīng)曲線

單性木蘭幼苗與成年植株的Gs、Tr、Ci光合-光響應(yīng)曲線如圖2所示。由圖2(a)可以看出,單性木蘭幼苗和成年植株的Gs光合-光響應(yīng)曲線的變化趨勢相似。當(dāng)光量子通量密度為0-400 μmol·m-2·s-1時,幼苗和成年植株的Gs光合-光響應(yīng)曲線斜率較大,說明隨著光量子通量密度的增加,Gs上升幅度較大;當(dāng)光量子通量密度為400-800 μmol·m-2·s-1時,Gs達到最大;當(dāng)光量子通量密度超過800 μmol·m-2·s-1后,Gs整體呈下降趨勢[圖2(a)]。

圖2 Gs、Tr和Ci的光合-光響應(yīng)曲線

由圖2(b)可以看出,在0-1 800 μmol·m-2·s-1的光量子通量密度下,單性木蘭成年植株的蒸騰速率均高于幼苗。成年植株在0-1 800 μmol·m-2·s-1的光量子通量密度下,蒸騰速率和光合輻射成正比。幼苗在光量子通量密度為0-800 μmol·m-2·s-1時,蒸騰速率隨著光量子通量密度的增強而升高;而當(dāng)光量子通量密度超過800 μmol·m-2·s-1時,蒸騰速率開始下降[圖2(b)]。

由圖2(c)可以看出,在0-1 800 μmol·m-2·s-1的光量子通量密度下,單性木蘭幼苗的Ci值均高于成年植株。在0 μmol·m-2·s-1光量子通量密度下,單性木蘭幼苗和成年植株的Ci最大;在0-100 μmol·m-2·s-1的光量子通量密度下,響應(yīng)曲線的斜率最大,Ci值急劇下降;在100-1 200 μmol·m-2·s-1光量子通量密度下,Ci變化趨于平緩。在1 200-1 800 μmol·m-2·s-1光量子通量密度下,成年植株的Ci值緩慢升高,而幼苗的Ci值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[圖2(c)]。

2.4 單性木蘭幼苗與成年植株葉片葉綠素含量比較

單性木蘭幼苗和成年植株葉綠素含量的測定結(jié)果如表2所示。成年植株的Chla、Chlb和Car含量均高于幼苗。單性木蘭幼苗和成年植株之間的Chla、Chlb、Car、Chl(a+b)、Chla/Chlb和Car/Chl(a+b)均存在顯著性差異。

表2 單性木蘭幼苗與成年植株葉片的葉綠素含量

2.5 單性木蘭幼苗和成年植株葉片結(jié)構(gòu)形態(tài)特征

由單性木蘭幼苗和成年植株的葉片橫切結(jié)構(gòu)(圖3)可以看出,葉片主要由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮構(gòu)成。成年植株葉片上表皮細胞排列規(guī)整,相較于幼苗葉片,其葉肉細胞排列更緊致。在相同的放大倍數(shù)下,成年植株葉片正片有更清晰的葉脈分布。

圖3 單性木蘭幼苗和成年植株的葉片結(jié)構(gòu)

2.6 單性木蘭幼苗和成年植株葉片各組織性狀的比較

由表3可知,單性木蘭幼苗葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉片厚度以及柵海比均高于成年植株。單性木蘭幼苗和成年植株的葉片厚度和柵欄組織厚度存在顯著性差異,而上表皮厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度和柵海比無顯著性差異。

表3 單性木蘭幼苗和成年植株葉片各組織厚度比較

2.7 單性木蘭幼苗和成年植株葉片氣孔參數(shù)比較

單性木蘭幼苗和成年植株氣孔參數(shù)結(jié)果如表4所示。由表4可知,幼苗的各項氣孔參數(shù)都要高于成年植株。單性木蘭幼苗和成年植株的氣孔面積、橫軸長度和氣孔密度存在顯著性差異,而縱軸長度無顯著性差異。

表4 單性木蘭幼苗與成年植株氣孔參數(shù)比較

2.8 單性木蘭幼苗、成年植株葉片結(jié)構(gòu)與光合生理的相關(guān)性分析

圖4為單性木蘭幼苗、成年植株葉片結(jié)構(gòu)和光合生理的相關(guān)性分析熱圖。由圖4可知,幼苗和成年植株葉片結(jié)構(gòu)參數(shù)和光合生理參數(shù)之間存在較強的相關(guān)性,其中Chla、Chlb、Car、Car/Chl(a+b)、Chla/Chlb、Chl(a+b)與Pmax、LSP均存在顯著性相關(guān);PPT、SA與Chla、Chlb、Car、Car/Chl(a+b)、Chla/Chlb、Chl(a+b)均存在顯著性相關(guān);AQY、Pmax、LSP、LCP與PPT、PPT/SPT均存在顯著性相關(guān)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

為進一步從單性木蘭多個葉片結(jié)構(gòu)變量中優(yōu)選出對光合生理變化影響最大的指標(biāo),利用冗余分析(RDA)以14個葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)作為解釋變量,5個光合生理指標(biāo)作為響應(yīng)變量,對兩個變量組進行排序分析。由于降趨勢對應(yīng)分析得到的梯度長度小于3,因此選擇RDA模型。通過Canoco 5.0軟件對這些變量進行分析,結(jié)果顯示第1軸和第2軸的解釋變量分別為77.28%和17.31%,前兩軸共解釋了單性木蘭幼苗和成年植株光合生理94.59%的變異。

由圖5可知,PPT、PPT/SPT、LET、SD和Car等5個葉片結(jié)構(gòu)性狀的箭頭較長,表明它們能較好地解釋單性木蘭幼苗和成年植株光合生理的變異。Pmax與SD、Car的箭頭夾角較小(銳角),表明正相關(guān)性較強;而與PPT、PPT/SPT、LET的夾角較大(鈍角),表明負相關(guān)性較強。LCP與SPT、LT、Chla/Chl(a+b)、PPT、PPT/SPT、UET、LET均呈正相關(guān),而與Car/Chl(a+b)、SA、Chlb、Chla、Chl(a+b)、SD和Car均呈負相關(guān);AQY、LSP、Pmax、Rd與Car/Chl(a+b)、SA、Chlb、Chla、Chl(a+b)、SD和Car呈正相關(guān),與SPT、LT、Chla/Chl(a+b)、PPT、PPT/SPT、UET和LET呈負相關(guān)。由此可見,RDA和熱圖分析結(jié)果具有一致性。

圖5 單性木蘭幼苗、成年植株葉片結(jié)構(gòu)和光合生理的RDA圖

3 討論

葉片是植物進行光合作用的主要器官,也是對環(huán)境變化較為敏感且反應(yīng)較大的器官[3]。葉片是植物生理和外界環(huán)境聯(lián)系的橋梁,植物可以通過調(diào)整葉片性狀以應(yīng)對不同的生境,這是植物為了適應(yīng)外界環(huán)境變化的一種生存策略[16]。葉綠素是存在于高等植物體內(nèi)的、能進行光合作用的一類綠色色素,其含量的高低能反映出植物光合作用的潛力[17,18]。本研究結(jié)果表明,成年植株葉片中的葉綠素含量顯著高于幼苗,且在各光量子通量密度下凈光合速率也高于幼苗,說明葉綠素含量可以有效地反映植物的光合能力,這與尚三娟等[19]的研究結(jié)果一致。

AQY是反映植物光能利用效率的指標(biāo)[20],本研究中單性木蘭幼苗和成年植株的AQY分別為0.087 6、0.102 6 mol·mol-1,高于大部分植物[21],表明其對弱光的利用能力較強。王冉等[22]對12種珍稀樹種光合生理特性進行研究,結(jié)果表明單性木蘭對強光和弱光均具有較強的利用能力,較小的光補償點和較大的光飽和點使其對光照強度的耐受范圍較廣,這也為其遷地保護的成功提供了重要保障。單性木蘭幼苗和成年植株光合速率存在差異,可能與成年植株葉片上表皮更薄有關(guān),薄的上表皮有利于光輻射透過葉表皮達到葉肉組織,從而提高光合能力。植物葉片結(jié)構(gòu)與光合作用緊密相關(guān),本研究中葉片SA、SD與AQY、LSP存在顯著正相關(guān)性,SD與Pmax存在顯著正相關(guān)性,說明氣孔密度與植物葉片的最大光合速率密切相關(guān)[23],SA和SD的增加能提高植物葉片對強光的利用能力和最大凈光合速率,SD的增加還會提高葉片對光能的利用效率。PPT/SPT是反映植物葉片柵欄組織發(fā)育程度的一個指標(biāo),柵欄組織的發(fā)達程度與其比值大小有關(guān)[24]。董夢宇等[25]研究結(jié)果顯示,PPT/SPT對光合生理的影響最為顯著,與本研究中葉片結(jié)構(gòu)與光合生理的相關(guān)性分析結(jié)果存在相似之處。

本研究還發(fā)現(xiàn),單性木蘭成年植株LSP與Pmax顯著高于幼苗。光合速率的大小直接影響著植物對有機物質(zhì)的積累。在相關(guān)性分析中,Pmax與VET呈負相關(guān),與葉綠素呈正相關(guān),可見成年植株葉片中更高的光合色素和較薄的上表皮是造成光合速率差異的主要原因。程晶[26]在研究中指出,適度遮陰有利于單性木蘭生物量的積累,低光照具有較高的表型可塑性。因此,在單性木蘭的引種栽培中,建議對其進行遮陰處理,隨著植株的生長可適當(dāng)減小遮陰度,直至無需遮陰。

4 結(jié)論

本研究對單性木蘭幼苗與成年植株的葉片結(jié)構(gòu)及光合生理進行基礎(chǔ)性研究,結(jié)果表明單性木蘭幼苗與成年植株的光合-光響應(yīng)曲線變化趨勢基本一致,在達到光飽和點后,成年植株的凈光合速率是幼苗的2倍左右。幼苗與成年植株的總?cè)~綠素、類胡蘿卜素、葉片厚度、氣孔面積和氣孔密度均存在顯著性差異。類胡蘿卜素、葉綠素與光合生理特性之間具有很強的相關(guān)性,而氣孔面積和氣孔密度對光合生理特性的影響最為顯著。總體而言,單性木蘭葉片結(jié)構(gòu)、色素與光合速率存在較高的相關(guān)性,同時在野外還表現(xiàn)出較強的光能利用能力,本研究可為單性木蘭的引種栽培提供理論依據(jù)。