鄧麗麗,唐健民,鄒 蓉,楊一山,陳泰國(guó),2,韋 霄**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林 541006;2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541199)

蘇鐵類植物是現(xiàn)存種子植物中最原始的類群,是地球上古老的孑遺植物[1-3]。蘇鐵屬(Cycas)植物目前已發(fā)現(xiàn)120種[2],我國(guó)共有蘇鐵屬植物25種[4],均被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物,其中8種為瀕危物種[5]。廣西作為蘇鐵植物的主要分布區(qū)之一,區(qū)內(nèi)大多數(shù)蘇鐵屬物種都被列入極小種群野生植物(PSESP)[6,7]。叉葉蘇鐵[Cycasbifida(Dyer) K.D.Hill]主要分布于中國(guó)廣西以及越南北部,葉呈叉狀二回羽狀深裂[8,9]。叉葉蘇鐵被用作蘇鐵科植物的現(xiàn)代地理分布、系統(tǒng)演化的研究對(duì)象,對(duì)研究中國(guó)與東南亞熱帶植物的區(qū)系地理、古植物和古氣候以及與動(dòng)物的協(xié)同進(jìn)化具有重要的價(jià)值[10]。此外,現(xiàn)代蘇鐵類植物的稀有性和高觀賞性,使其成為收藏家非常追捧的植物[8]。

物種的遺傳多樣性取決于基因突變、基因流動(dòng)、遺傳漂變及自然選擇等引起的核苷酸序列變異[11,12],物種基因組間存在的差異對(duì)物種的進(jìn)化和保護(hù)具有重要意義[13]。目前,多種分子標(biāo)記方法被用于群體遺傳多樣性分析,如Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)標(biāo)記[14]、Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)標(biāo)記[15]、Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP)標(biāo)記[16]和Genic Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeat (EST-SSR)標(biāo)記[17]等。與其他分子標(biāo)記相比,Simple Sequence Repeat (SSR)標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記類型,能準(zhǔn)確估計(jì)遺傳多樣性。SSR標(biāo)記因其具有數(shù)量大、分布廣泛均勻、靈活性高、多態(tài)性豐富、成本低、易推廣以及重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用[18,19]。SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析,使用SSR標(biāo)記方法對(duì)叉葉蘇鐵遺傳多樣性進(jìn)行分析,能準(zhǔn)確地估計(jì)叉葉蘇鐵DNA水平上真實(shí)的遺傳變異,從而揭示叉葉蘇鐵的遺傳多樣性和遺傳變異,為叉葉蘇鐵的資源保護(hù)和選育提供參考[20,21]。

目前,業(yè)界僅有關(guān)于叉葉蘇鐵的形態(tài)[22]、分類[23]、種群結(jié)構(gòu)[24]等方面的少量研究。龔奕青[25]對(duì)廣西龍州和憑祥的3個(gè)叉葉蘇鐵種群開展了遺傳分化和譜系地理研究,而廣西崇左市作為叉葉蘇鐵的主要分布區(qū),對(duì)該區(qū)域內(nèi)叉葉蘇鐵種群的遺傳多樣性研究還未開展。叉葉蘇鐵野生種群少,人為盜采嚴(yán)重,野生生境遭受破壞,該物種的遺傳多樣性遭受嚴(yán)重威脅,急需對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行保護(hù)。遷地保護(hù)是保護(hù)野生物種種群延續(xù)的有效方法[26],桂林植物園已對(duì)崇左市左州鎮(zhèn)排乳屯叉葉蘇鐵進(jìn)行了遷地保護(hù)。但是,遷地保護(hù)種群的建立根本上是人為建立的小型獨(dú)立種群,存在采樣不全、重復(fù)引進(jìn)、資源不清或種植條件差等問題,因此遷地保護(hù)的瀕危植物同樣面臨遺傳多樣性下降或滅絕的危險(xiǎn)[27]。綜上所述,本研究采用SSR標(biāo)記方法,選擇廣西崇左規(guī)模較大的叉葉蘇鐵野生種群和桂林植物園的遷地保護(hù)種群為研究對(duì)象,探究叉葉蘇鐵野生種群和遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性豐富度和遺傳結(jié)構(gòu),為廣西崇左叉葉蘇鐵的遺傳多樣性保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2022年對(duì)廣西崇左市4個(gè)叉葉蘇鐵野生種群和1個(gè)遷地保護(hù)種群進(jìn)行采樣(表1),其中YCLL、MB和MALL 3個(gè)種群為位于保護(hù)區(qū)外的野外種群,PR種群為白頭葉猴保護(hù)區(qū)內(nèi)的野生種群,ZWS種群為桂林植物園的遷地保護(hù)種群。5個(gè)種群共采集叉葉蘇鐵樣品109份,采集時(shí)選擇完整無病蟲害的叉葉蘇鐵葉片,放置于裝有變色硅膠的密封袋中干燥保存,對(duì)每份樣品做好標(biāo)簽,并對(duì)采樣點(diǎn)進(jìn)行GPS定位。植物樣品由廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所韋霄研究員鑒定為叉葉蘇鐵[Cyas bifida (Dyer) K.D.Hill]。

表1 叉葉蘇鐵種群的采樣信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和檢測(cè)

使用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對(duì)叉葉蘇鐵葉片進(jìn)行DNA提取,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度,并用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量,將合格的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 引物篩選

本研究從全基因組序列中篩選得到96對(duì)引物,一共篩選出6對(duì)擴(kuò)增成功、峰形良好的引物(表2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京合成部合成。

表2 SSR引物信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

在Veriti 384 PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)體系(10 μL):DNA(～20 ng)1.0 μL,2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL,ddH2O 3.0 μL,濃度10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,62-52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,10個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)下降1 ℃;95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25個(gè)循環(huán);72 ℃末端延伸20 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),參照ABI 3730xl上機(jī)操作流程進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出

使用GeneMarker分析軟件進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)的讀取,并導(dǎo)出Excel基因型原始數(shù)據(jù)和PDF分型峰圖文件。

1.3.2 遺傳多樣性及遺傳分化

使用軟件GenAlEx version 6.501計(jì)算SSR位點(diǎn)以及群體的各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo),包括觀測(cè)等位基因數(shù)(Number of Observed Alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Number of Effective Alleles,Ne)、Shannon信息指數(shù)(Shannon′s Information Index,I)、觀測(cè)雜合度(Observed Heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected Heterozygosity,He)、遺傳分化系數(shù)(Genetic Differentiation Coefficient,Fst)、固定系數(shù)(Fixed index,F)和基因流(Gene Flow,Nm),使用Powermarker v3.25計(jì)算所有位點(diǎn)多態(tài)性信息指數(shù)(Polymorphism Information Content,PIC)。

1.3.3 遺傳結(jié)構(gòu)及分子方差分析

利用Structure 2.3.4對(duì)109個(gè)叉葉蘇鐵樣本進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,設(shè)置K=1-20,Burn-in周期為10 000,MCMC (Markov Chain Monte Carlo)設(shè)為100 000,每個(gè)K值運(yùn)行20次,并利用在線工具Structure Harvester算出最佳DeltaK值(即為最佳群體分層情況)。根據(jù)最佳K值結(jié)果作圖,使用Clummp和Distruct軟件制圖。使用GenAlEx version 6.501進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)。

1.3.4 聚類分析和主坐標(biāo)分析

利用Powermarker v3.25軟件計(jì)算各群體間的遺傳距離,利用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means,UPGMA)進(jìn)行聚類分析,并繪制環(huán)狀聚類圖和樹狀聚類圖,使用GenAlEx version 6.501進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

由SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果(表3)可知,6對(duì)引物在109個(gè)樣本中共檢測(cè)出24個(gè)等位基因,其中,最小觀測(cè)等位基因數(shù)為3.000,最大觀測(cè)等位基因數(shù)為6.000,平均每個(gè)位點(diǎn)觀測(cè)等位基因數(shù)為4.000。有效等位基因數(shù)總數(shù)為12.461,平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)為2.077。Shannon信息指數(shù)為0.286(GZST013)-1.186(GZST088),平均值為0.846。觀測(cè)雜合度最大為0.679(GZST019),最小為0.000(GZST002),平均值為0.355。期望雜合度最小為0.130(GZST013),最大為0.642(GZST088),平均值為0.482。多態(tài)性信息指數(shù)為0.124(GZST013)-0.591(GZST088),平均值為0.418。6對(duì)引物中除GZST013不存在顯著性差異,其余5對(duì)引物均存在顯著性差異。綜合來看,引物GZST088的多態(tài)性較好。

表3 SSR引物的多態(tài)性

2.2 叉葉蘇鐵群體遺傳多樣性分析

2.2.1 群體間的遺傳多樣性分析

對(duì)叉葉蘇鐵群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析(表4),4個(gè)野生種群中,MALL的觀測(cè)等位基因數(shù)最高(3.333),PR的觀測(cè)等位基因數(shù)最低(2.500),平均值為2.875。YCLL的有效等位基因數(shù)最高(1.855),PR最低(1.662),平均值為1.796。Shannon信息指數(shù)平均值為0.637,MALL的最高(0.711)。觀測(cè)雜合度最高是MB(0.402),最低是PR(0.269),平均值為0.363。PR的期望雜合度最低(0.324),MALL最高(0.394),平均值為0.373。綜合來看,PR的各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值在4個(gè)野生種群中最低,遺傳多樣性水平最低。遷地保護(hù)種群(ZWS)的Shannon信息指數(shù)和期望雜合度值高于4個(gè)野生種群的平均值,但Shannon信息指數(shù)略低于MALL,而期望雜合度值略低于MALL和YCLL野生種群。

表4 叉葉蘇鐵群體間的遺傳多樣性

2.2.2 群體的遺傳分化

對(duì)5個(gè)叉葉蘇鐵種群的遺傳變異進(jìn)行AMOVA(圖1),結(jié)果表明叉葉蘇鐵種群間的遺傳變異占25%,個(gè)體間的遺傳變異占7%,而大多數(shù)的遺傳變異來源于個(gè)體內(nèi)(68%)。

圖1 叉葉蘇鐵群體間分子方差分析

對(duì)叉葉蘇鐵種群間的基因流和遺傳分化系數(shù)(表5)進(jìn)行分析,5個(gè)種群中YCLL與MB間的基因流最大(26.635)且遺傳分化系數(shù)最小(0.009),PR與MB間的基因流最小(0.952)且彼此間的遺傳分化系數(shù)最大(0.208),ZWS與4個(gè)野生種群間的遺傳分化系數(shù)和基因流分別為0.119-0.200和0.998-1.855。

表5 叉葉蘇鐵群體間的基因流(上三角)和遺傳分化系數(shù)(下三角)

2.2.3 叉葉蘇鐵群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

對(duì)叉葉蘇鐵5個(gè)種群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,根據(jù)最大似然原則,當(dāng)K=2時(shí),DeltaK最大(圖2)。對(duì)野生種群和遷地保護(hù)種群共109份叉葉蘇鐵樣品進(jìn)行Structure分析(圖3),本研究中的109份叉葉蘇鐵樣品按地理位置大致分為2種基因型,其中MALL、YCLL和MB 3個(gè)野生種群基因型相近,分為一類,而ZWS與PR更為接近,二者可分為一類。

圖2 最佳類群數(shù)(K)與推斷值(Delta K)的變化趨勢(shì)

圖3 叉葉蘇鐵的Structure分析(K=2)

2.2.4 叉葉蘇鐵的聚類分析和主坐標(biāo)分析

對(duì)109份叉葉蘇鐵樣品進(jìn)行UPGMA聚類分析[圖4(a)],109份樣品主要分為兩大類(類1和類2),類1包含了ZWS和PR的所有樣品,在類1中,多數(shù)樣品按地區(qū)分類,但各有2個(gè)和1個(gè)樣品穿插在彼此的分組中;類2包含MALL、YCLL和MB 3個(gè)野外種群的所有樣品,在類2中,3個(gè)種群的樣品相互穿插,也說明了這3個(gè)種群遺傳距離更近,存在較高的基因交流現(xiàn)象。

圖4 叉葉蘇鐵的UPGMA聚類結(jié)果

對(duì)5個(gè)叉葉蘇鐵種群進(jìn)行UPGMA聚類分析[圖4(b)],結(jié)果顯示5個(gè)種群可分為2個(gè)亞群,其中一個(gè)亞群包括ZWS和PR,這2個(gè)種群的遺傳距離較近;另一個(gè)亞群包括MALL、YCLL和MB 3個(gè)野外種群,在這個(gè)亞群中,YCLL和MB種群的遺傳距離最近。

對(duì)叉葉蘇鐵的109份樣品進(jìn)行PCoA(圖5),其中坐標(biāo)代表個(gè)體的位點(diǎn)遺傳變異在不同維度的差異程度。由圖5可知第一主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為27.42%,第二主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為17.92%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)到45.34%,可代表原始數(shù)據(jù)的主要信息。圖5中5個(gè)種群的109個(gè)樣本個(gè)體可以明顯分為2個(gè)組,其中MALL、YCLL和MB 3個(gè)野外種群的樣品距離更近,聚為一組;而ZWS和PR距離更近,為另一個(gè)組。

圖5 109個(gè)叉葉蘇鐵樣本的主坐標(biāo)分析

3 討論

3.1 叉葉蘇鐵遺傳多樣性

本研究使用6對(duì)引物對(duì)叉葉蘇鐵遺傳多樣性進(jìn)行了分析,6對(duì)引物中,僅GZST013位點(diǎn)的多態(tài)性信息指數(shù)(0.124)是低度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC≤0.25),其余5個(gè)位點(diǎn)均為中、高度多態(tài)性。遺傳多樣性能體現(xiàn)物種的進(jìn)化潛力以及環(huán)境適應(yīng)能力,物種的遺傳多樣性水平越高,適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng),反之越弱[28]。本研究叉葉蘇鐵野生種群遺傳多樣性分析結(jié)果顯示,Shannon信息指數(shù)平均值為0.637,期望雜合度的平均值為0.373,低于龔奕青[25]的研究結(jié)果(I=1.213,He=0.446);與其他同屬植物相比,叉葉蘇鐵期望雜合度平均值高于四川蘇鐵(C.szechuanensis,He=0.247)[29]和攀枝花蘇鐵(C.panzhihuaensis,He=0.328)[30],低于德保蘇鐵(C.debaoensis,He=0.484)[31]、多歧蘇鐵(C.multipinnata,He=0.497)[32]和臺(tái)灣蘇鐵(C.taiwaniana,He=0.703)[33]。總體來看,崇左市叉葉蘇鐵遺傳多樣性水平較低,4個(gè)野生種群中的MALL和YCLL 2個(gè)種群的遺傳多樣性較高,但PR的遺傳多樣性較低,由于種群間的遺傳多樣性不平衡,部分較低的遺傳多樣性會(huì)使得整體的遺傳多樣性水平降低。

大量研究結(jié)果表明遷地保護(hù)可作為保護(hù)野生物種居群延續(xù)的有效方法[26]。本研究中PR位于廣西崇左白頭葉猴國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)中,該種群的叉葉蘇鐵植株及其生境均已受到保護(hù)。由于遷地保護(hù)種群ZWS引種于野生種群PR,Structure分析結(jié)果也顯示,ZWS與PR遺傳距離非常近。在遷地保護(hù)種群和野生種群的比較中,ZWS期望雜合度值高于4個(gè)野生種群的平均值,但略低于MALL和YCLL野生種群;Shannon信息指數(shù)也高于4個(gè)野生種群的平均值但略低于野生種群MALL,說明桂林植物園對(duì)叉葉蘇鐵進(jìn)行遷地保護(hù)在一定程度上能有效地保護(hù)其遺傳多樣性。但還需要繼續(xù)開展其遷地保護(hù)的種質(zhì)資源的收集,特別加強(qiáng)對(duì)遺傳多樣性較高的MALL和YCLL種群資源的引種工作,以加強(qiáng)遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性水平,這對(duì)保護(hù)崇左市叉葉蘇鐵具有重要的指導(dǎo)意義。

3.2 叉葉蘇鐵遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

叉葉蘇鐵種群間的Fst平均值為0.134,ZWS與PR的遺傳分化水平達(dá)到中度(0.119),與另外3個(gè)野生種群間的Fst為0.165-0.200,達(dá)到高度分化水平[34],這可能是因?yàn)橐N保護(hù)地與4個(gè)野生種群地理距離較遠(yuǎn),基因交流頻率低而形成了一定程度的遺傳分化。MALL、MB和YCLL 3個(gè)野生種群間的Fst為0.009-0.042,種群間分化較小,但這3個(gè)種群與PR間的Fst為0.194-0.208,均大于0.15,達(dá)到高度分化水平[34],導(dǎo)致這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是MALL、MB和YCLL 3個(gè)野生種群間地理距離相對(duì)較近,存在基因交流的概率更大,從而使得這3個(gè)野生種群的遺傳分化小,遺傳距離更近。從Structure分析(圖3)來看,4個(gè)野生種群之間均存在相同的祖先,可能是經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)化加上人為砍伐和破壞導(dǎo)致了叉葉蘇鐵生境片段化,從而分化形成了2個(gè)分支,由于ZWS引種于PR,兩者的遺傳距離非常近,所以這兩個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)極其相似。UPGMA結(jié)果(圖4)也顯示ZWS和PR間的遺傳距離非常近,兩者最先匯聚成一支。PCoA分析結(jié)果(圖5)也支持以上結(jié)論,即109份叉葉蘇鐵樣品可大致分為2類,ZWS和PR 2個(gè)種群可分為一類;而MALL、MB和YCLL 3個(gè)野生種群距離更近,為另一類。本研究中叉葉蘇鐵種群間的遺傳變異占25%,種群內(nèi)的遺傳變異占75%,變異主要來源于種群內(nèi),種群水平的遺傳交流較低,發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能是:(1)由于叉葉蘇鐵種群數(shù)量減小,導(dǎo)致種群內(nèi)積累的遺傳變異少;(2)叉葉蘇鐵花粉無法遠(yuǎn)距離傳播,導(dǎo)致叉葉蘇鐵多為種群內(nèi)雜交,種群內(nèi)基因交流更為頻繁[35]。

4 結(jié)論

保護(hù)瀕危植物的棲息地是延長(zhǎng)該物種生命周期及恢復(fù)野生種群的主要方法之一,4個(gè)野生種群中,MALL的遺傳多樣性表現(xiàn)最高,應(yīng)作為野生種群的重點(diǎn)保護(hù)種群,由于叉葉蘇鐵種群少,建議在位于保護(hù)區(qū)外的MALL、MB和YCLL 3個(gè)野生種群的所在地均建立保護(hù)小區(qū),以此更好保護(hù)其完整的遺傳多樣性。同時(shí)對(duì)叉葉蘇鐵種群進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和小種群生存概率方面的研究工作。此外,還需繼續(xù)開展崇左市叉葉蘇鐵遷地保護(hù)的種質(zhì)資源收集工作,特別是加強(qiáng)MALL和YCLL種群資源的引種工作,以加強(qiáng)遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性水平。叉葉蘇鐵為極小種群植物,其種質(zhì)資源少,種群數(shù)量和個(gè)體都很少,需加強(qiáng)叉葉蘇鐵良種篩選、人工授粉、種苗培育、生物學(xué)特性、栽培技術(shù)方面的研究。最后,應(yīng)加強(qiáng)叉葉蘇鐵野外回歸引種工作,開展就地回歸和異地回歸試驗(yàn),擴(kuò)大叉葉蘇鐵種群數(shù)量,加大其遺傳交流,從而有效提高叉葉蘇鐵遺傳多樣性。