朱舒靖,鄒 蓉,柴勝豐,唐健民,唐鳳鸞,陳泰國(guó),3,韋 霄**

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣西桂林 541006;2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所,廣西桂林 541006;3.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541000)

蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)的所有植物已被列入《瀕危野生動(dòng)植物物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅰ和我國(guó)2021年版的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》,同時(shí)也是《中華人民共和國(guó)野生植物保護(hù)條例》的重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象,備受國(guó)際的關(guān)注與保護(hù)[1]。海倫兜蘭(Paphiopedilumhelenae)是蘭科兜蘭屬植物,為多年生常綠草本植物,葉色深綠,花色金黃,觀賞價(jià)值非常高,是雜交育種不可多得的種質(zhì)資源材料,其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值極高[2]。海倫兜蘭于1996年首次被報(bào)道,發(fā)現(xiàn)于越南北部高平省;而我國(guó)于2005年在廣西西部發(fā)現(xiàn)有分布,并于2007年正式報(bào)道,其種群數(shù)量非常少,首次報(bào)道時(shí)僅發(fā)現(xiàn)35株。海倫兜蘭為地生蘭花,主要生長(zhǎng)在石灰?guī)r地區(qū),分布地海拔較高,常常分布在近山頂處常綠闊葉林的懸崖石縫土壤中[3]。

自然種群之間和內(nèi)部的遺傳變異對(duì)物種的長(zhǎng)期生存尤為重要,尤其是瀕危物種。了解瀕危物種的遺傳多樣性與變異,有助于揭示其進(jìn)化機(jī)制和瀕危原因,對(duì)其保護(hù)和管理至關(guān)重要[4,5]。因此,對(duì)海倫兜蘭的遺傳多樣性與變異進(jìn)行系統(tǒng)的研究,可為其種質(zhì)資源、良種選育和保護(hù)策略等提供有效參考,避免海倫兜蘭植物種質(zhì)資源瀕臨滅絕。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)或微衛(wèi)星DNA是由1-6個(gè)單元核苷酸組成的重復(fù)的DNA序列,普遍存在于原核生物和真核生物的基因組中[6]。SSR標(biāo)記技術(shù)具有多等位基因、共顯性、信息量大、相對(duì)豐度高、成本低和試驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn),在植物遺傳分析方面具有廣泛的應(yīng)用前景[7]。目前,有眾多研究者通過(guò)SSR分子標(biāo)記對(duì)蘭科植物的遺傳多樣性進(jìn)行了研究,如春蘭品種與其園藝關(guān)系[8]、變異品種鑒定[9]、大花蕙蘭(Cymbidiumhybrid)遺傳多樣性[10]、中國(guó)蘭花的親緣關(guān)系與遺傳多樣性[11]等,而關(guān)于海倫兜蘭遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的研究尚未見報(bào)道。因此,本研究采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)海倫兜蘭遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估,并提出相應(yīng)的保護(hù)策略,以期為該種質(zhì)資源的有效保護(hù)與利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

海倫兜蘭采自廣西邦亮長(zhǎng)臂猿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的靖西市(JX)、靖西市四角山(SJS)居群,廣西弄崗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的三聯(lián)站(SLZ)、民強(qiáng)站(MQZ)居群以及廣西崇左市龍州縣下凍鎮(zhèn)春秀村(LZ)居群(表1),每個(gè)居群采集7-22個(gè)植株(每個(gè)植株間距離在2 m以上),每個(gè)植物選擇2片健康無(wú)病蟲害的葉片。將采集植株的新鮮葉片用變色硅膠干燥,共71份樣本。樣品由廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所韋霄研究員鑒定為海倫兜蘭(Paphiopedilumhelenae)。

表1 海倫兜蘭5個(gè)居群的詳細(xì)信息

1.2 DNA提取和EST-SSR分型

使用改良十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[12]提取樣品的DNA,并利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。本研究選取Xu等[13]利用亨利兜蘭(P.henryanum)開發(fā)的34對(duì)引物進(jìn)行引物篩選,其中大部分引物在兜蘭屬的7個(gè)物種中均具有良好的擴(kuò)增效果[13]。選取16個(gè)樣本進(jìn)行引物篩選驗(yàn)證,最終篩選出10對(duì)擴(kuò)增成功的、峰形良好的引物開展遺傳多樣性分析(表2)。PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系:1 μL模板DNA(30 ng/μL),10 μL 2×TaqPCR Marter Mix,正、反引物各0.5 μL (10 μmol/L),8 μL ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,51-58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存[14]。使用GeneMapper v4.1軟件在ABI 3730 xl DNA分析儀(Applied Biosystems,美國(guó))上讀取SSR基因型。

表2 SSR 引物信息 Table 2 SSR primer information

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性與遺傳分化

使用GeneAlEx v6.5.1[15]軟件計(jì)算所有位點(diǎn)和每個(gè)居群的觀測(cè)等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、基因流(Nm)、居群間遺傳分化系數(shù)(Fst)和多態(tài)位點(diǎn)百分比(PPB),利用PowerMarker[16]軟件計(jì)算所有位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。

1.3.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用3種方法分析群體間的遺傳結(jié)構(gòu):(1)使用主坐標(biāo)分析(PCoA)中的主坐標(biāo)成分來(lái)說(shuō)明個(gè)體間的遺傳距離;(2)利用GeneAlEx v6.5.1軟件進(jìn)行分子方差分析(AMOVA),研究居群間和居群內(nèi)的總遺傳變異;(3)使用Structure[17]對(duì)全部個(gè)體進(jìn)行貝葉斯聚類分析,設(shè)置K=1-20,Burn-in周期為10 000,MCMC (Markov Chain Monte Carlo)設(shè)為100 000,每個(gè)K值運(yùn)行10次,并利用在線工具Structure Harvester計(jì)算出最佳ΔK值,即為最佳群體分層情況,根據(jù)最佳K值作圖。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用PowerMarker軟件計(jì)算兩兩樣品之間的Nei′s遺傳距離,基于Nei′s遺傳距離矩陣,采用MAGA v6[18]的非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建所有個(gè)體的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR標(biāo)記多態(tài)性

利用10對(duì)引物對(duì)海倫兜蘭進(jìn)行多態(tài)性分析,結(jié)果見表3。由表3可知,71份樣品共檢測(cè)到31.8個(gè)觀測(cè)等位基因,觀測(cè)等位基因數(shù)為1.600 (DL034)-5.600 (DL020),平均每個(gè)位點(diǎn)存在3.180個(gè)等位基因;有效等位基因數(shù)為1.177(DL034)-4.101(DL020),平均值為2.191;香農(nóng)信息指數(shù)為0.208 (DL034)-1.510 (DL020),平均值為0.801;觀察雜合度為0.153 (DL034)-0.771(DL032),平均值為0.490;期望雜合度為0.124(DL034)-0.740 (DL020),平均值為0.451;EST-SSR基因多態(tài)性信息含量為0.154 (DL034)-0.817 (DL020),平均值為0.444。綜上,本研究使用的EST-SSR引物大部分多態(tài)性良好,可用于后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行遺傳信息分析,其中引物DL034多態(tài)性顯著低于其他引物。

表3 10對(duì)引物多態(tài)性分析

2.2 遺傳多樣性分析

海倫兜蘭5個(gè)居群的遺傳多樣性信息結(jié)果見表4。由表4可知,觀測(cè)等位基因數(shù)為2.900 (JX、MQZ)-3.600 (SLZ),平均值為3.180。有效等位基因數(shù)為2.020 (SLZ)-2.316 (JX),平均值為2.191。香農(nóng)信息指數(shù)為0.749(MQZ)-0.861(JX),平均值為0.801。觀測(cè)雜合度為0.404 (SLZ)-0.603 (LZ),平均值為0.490。期望雜合度為0.403 (SJS)-0.503 (JX),平均值為0.451。多態(tài)位點(diǎn)百分比為90%-100%,平均值為92%。綜上,海倫兜蘭的遺傳多樣性較豐富,其中靖西市(JX,I=0.861、He=0.503、PPB=90%)和龍州縣下凍鎮(zhèn)春秀村(LZ,I=0.855、He=0.501、PPB=100%)居群的遺傳多樣性較高,廣西邦亮長(zhǎng)臂猿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的靖西市四角山(SJS,I=0.773、He=0.403、PPB=90%)居群的遺傳多樣性相對(duì)較低。

表4 海倫兜蘭5個(gè)野生居群的遺傳多樣性水平

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)與分化

分子方差分析結(jié)果(表5)表明,海倫兜蘭居群間的遺傳變異僅占7%,而居群內(nèi)遺傳變異占93%,說(shuō)明海倫兜蘭的變異主要發(fā)生在居群內(nèi),居群內(nèi)遺傳分化程度較高,居群間遺傳分化程度較低。由表6可知,各居群間遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.022-0.127,遺傳分化程度不高。其中,SJS與LZ、SLZ以及SLZ與LZ居群之間的Fst值均小于0.05,表現(xiàn)出低遺傳分化,表明這些居群之間具有較近的親緣關(guān)系;而其他各個(gè)地區(qū)之間的遺傳分化系數(shù)均為0.050-0.150,表現(xiàn)出中等遺傳分化;SJS與JX的遺傳分化系數(shù)最高(0.127),表明這兩個(gè)居群間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。海倫兜蘭居群間Nm值為1.718-11.103,平均值為4.916,基因流水平較高。

表5 海倫兜蘭群體的分子方差分析

表6 海倫兜蘭5個(gè)居群間遺傳分化系數(shù)(Fst,對(duì)角線下方)和基因流(Nm,對(duì)角線上方)

利用Structure軟件中的貝葉斯聚類方法對(duì)海倫兜蘭群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)K=3時(shí),ΔK取得最大值,表明海倫兜蘭5個(gè)居群的基因型可分為3種(圖1),但這3種基因型在基因池中分布不均且不能按照基因型分布(圖2)。

圖1 海倫兜蘭各居群群體結(jié)構(gòu)分析的ΔK值分布

圖2 海倫兜蘭群體的遺傳結(jié)構(gòu)

2.4 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

基于Nei′s遺傳距離矩陣,采用UPGMA對(duì)71份海倫兜蘭樣品進(jìn)行聚類分析(圖3)。結(jié)果顯示,2份JX和1份MQZ聚為一支(Ⅰ);剩余的5份JX、11份LZ、11份MQZ、22份SLZ和12份SJS聚為一支(Ⅱ),Ⅱ支又劃分為Ⅱ-1、Ⅱ-2,其中Ⅱ-1包括4份LZ和1份SLZ,Ⅱ-2包括5份JX、8份LZ、11份MQZ、21份SLZ和12份SJS。LZ居群少數(shù)樣品與SLZ居群1份樣品親緣關(guān)系近,JX居群少數(shù)樣品與MQZ居群1份樣品親緣關(guān)系較近。主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示,第一主坐標(biāo)和第二主坐標(biāo)分別占總遺傳變異的15.57%和11.31%(圖4)。綜上可知,UPGMA聚類分析結(jié)果與PCoA主坐標(biāo)分析結(jié)果基本一致,即海倫兜蘭明顯劃分為3支,但未按照地理位置明顯劃分。

圖3 海倫兜蘭種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的進(jìn)化樹

圖4 海倫兜蘭群體主坐標(biāo)分析

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有靈活性高、成本低、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì),利用該技術(shù)來(lái)分析海倫兜蘭的遺傳多樣性,其結(jié)果更能反映DNA水平上真實(shí)的遺傳變異,為海倫兜蘭的品種選育與保護(hù)提供參考依據(jù)[19,20]。遺傳多樣性是物種進(jìn)化潛力和抵抗外界環(huán)境變化的一種體現(xiàn),物種遺傳多樣性越豐富,其適應(yīng)外界環(huán)境的能力越強(qiáng),反之則越弱[21]。本研究結(jié)果表明,海倫兜蘭的微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性,PIC平均值為0.444,比野生春蘭(Cymbidiumgoeringii)的多態(tài)性(PIC=0.805 0)低[22]。海倫兜蘭的PPB平均值為92%,高于硬葉兜蘭(P.micranthum,PPB=81.25%)[23]、貴州南部的8種野生兜蘭(PPB=80.26%)[24]和貴州北盤江流域6種兜蘭(PPB=84.54%)[25]的多態(tài)性平均水平。此外,海倫兜蘭的遺傳多樣性平均水平(He=0.451、I=0.801)低于蕙蘭(C.faberi,He=0.600 0、I=1.049 0)[26],高于帶葉兜蘭(P.hirsutissimum,He=0.420 5、I=0.742 5)[21]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale,He=0.344、I=0.508)[27],表明海倫兜蘭具有中等遺傳多樣性。

植物的遺傳多樣性通常取決于其繁育系統(tǒng)和生活型,稀有和特有物種的遺傳多樣性水平低于廣布物種,一般而言,分布廣、種子由動(dòng)物傳播的多年生草本植物具有較高的遺傳多樣性[28,29]。海倫兜蘭為地生型草本植物,分布范圍有限,種群數(shù)量極少[2],本研究結(jié)果顯示海倫兜蘭具有中等遺傳多樣性。SJS和SLZ居群遺傳多樣性相對(duì)較低,可能是由于棲息地遭受破壞、長(zhǎng)期保持小群體規(guī)模和群體破碎化導(dǎo)致遺傳多樣性喪失[1,3,30]。楊舒婷等[31]研究發(fā)現(xiàn),海拔越高,物種的遺傳多樣性也越高。海倫兜蘭對(duì)生境的要求極高,分布地區(qū)海拔較高,尤其是JX居群位于海拔790 m,人為干擾相對(duì)困難,因此保留較高的遺傳多樣性。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化

從遺傳結(jié)構(gòu)上來(lái)看,海倫兜蘭遺傳變異僅有7%來(lái)自居群間,絕大部分遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi),這與徐言等[21]研究發(fā)現(xiàn)的兜蘭屬植物遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)的研究結(jié)果一致。海倫兜蘭具有中等的遺傳多樣性,群體間遺傳變異較低,可能與海倫兜蘭具有艷麗的花色而實(shí)施欺騙性授粉策略以及具有沙塵狀的種子等特征有關(guān),這些特征增加了群體內(nèi)的基因交流頻率[32]。董麗敏等[33]研究表明,Fst值為0.00-0.05的群體,各亞群間分化可忽略不計(jì);Fst值為0.05-0.15時(shí),則被視為中度分化;Fst值為0.15-0.25時(shí),則被認(rèn)為是高度分化。本研究發(fā)現(xiàn),海倫兜蘭遺傳分化處于中等水平(Fst=0.071),低于六盤北野生兜蘭屬植物(Gst=0.536 9)[25]。此外,基因流是影響種群遺傳分化的重要因素之一[34]。海倫兜蘭的基因流較高(Nm=4.916),較高的基因流可以阻止由遺傳漂變引起的種群遺傳分化。種群間的基因流動(dòng)一般受到種子和花粉傳播的限制[35]。蘭花的典型特征是種群遺傳分化低,這通常歸因于蘭花多為塵埃狀種子,雖然大多數(shù)蘭花種子通常落在母株附近,但它可以依賴風(fēng)進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播[36]。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

本研究中UPGMA聚類樹、Structure和PCoA的分析結(jié)果基本一致,海倫兜蘭可分為3支,但并未嚴(yán)格按照地理位置劃分,這與秦惠珍等[37]對(duì)白花兜蘭(P.emersonii)的研究結(jié)果一致,說(shuō)明海倫兜蘭5個(gè)居群之間遺傳分化較小,親緣關(guān)系較近。JX居群與MQZ居群在地理位置上較SJS遠(yuǎn),但JX居群與MQZ居群的部分個(gè)體優(yōu)先聚集在一起;同理LZ部分個(gè)體優(yōu)先與SLZ居群部分個(gè)體聚集在一起,而不是與同一個(gè)保護(hù)區(qū)內(nèi)距離較近的MZQ居群聚集在一起。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是由于各居群間基因交流頻繁或是受到人為活動(dòng)的影響,如海倫兜蘭在公開后被非法大量采集,導(dǎo)致海倫兜蘭植株在不同地區(qū)之間遷移。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,海倫兜蘭的遺傳多樣性(He=0.451,I=0.801)處于中等水平;JX和LZ這兩個(gè)居群的遺傳多樣性較高,應(yīng)作為重點(diǎn)保護(hù)單元進(jìn)行保護(hù);絕大多數(shù)遺傳變異存在于居群內(nèi),僅有7%的遺傳變異存在于居群間,居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間的變異。目前,除龍州縣下凍鎮(zhèn)春秀村的LZ居群外,其他居群(JX、SJS、SLZ和MQZ)均在保護(hù)區(qū)內(nèi)。因此,對(duì)LZ居群,林業(yè)部門應(yīng)盡快建立保護(hù)小區(qū);而對(duì)JX、SJS、SLZ和MQZ居群應(yīng)加強(qiáng)保護(hù)區(qū)建設(shè),加大管護(hù)和巡護(hù)力度,避免生境破壞和人為采挖。此外,海倫兜蘭分布區(qū)狹窄,種群個(gè)體數(shù)量極少,抗干擾能力弱,為保護(hù)其遺傳多樣性,有必要開展人工授粉,促進(jìn)種群的有性繁殖,防止物種退化,建議從居群間選擇有代表性植株的子代進(jìn)行遷地保護(hù),最大限度地保護(hù)其種群的遺傳多樣性。