侯千姿，郭心怡，焦子悅，費(fèi)強(qiáng)，2

（1 西安交通大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049；2 陜西省能源化工過程強(qiáng)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710049）

作為一種溫室氣體，甲烷的全球變暖潛力值（20年期計(jì)算）是二氧化碳的86倍[1]，即每排放一個(gè)當(dāng)量的甲烷氣體，等同于排放86個(gè)當(dāng)量的二氧化碳?xì)怏w。目前多項(xiàng)科研成果都表明全球甲烷排放量和濃度正在快速增加[2?3]。在第26屆聯(lián)合國氣候變化大會(huì)期間，中美兩國共同發(fā)布了《中美關(guān)于在21 世紀(jì)20年代強(qiáng)化氣候行動(dòng)的格拉斯哥聯(lián)合宣言》，強(qiáng)調(diào)了甲烷排放治理的重要性和緊迫性。甲烷的有效減排在短期內(nèi)可延緩氣候變暖速率，而作為重要的資源和能源，甲烷的合理利用途徑也亟待拓展。

生物制造是利用生物體機(jī)能進(jìn)行物質(zhì)加工與合成的一種綠色生產(chǎn)方式[4]，有助于減少廢物排放和工業(yè)經(jīng)濟(jì)對生態(tài)環(huán)境的影響，是國家《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》確立的生物經(jīng)濟(jì)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向[5]。甲烷的生物轉(zhuǎn)化拓展了甲烷的綠色利用途徑，在生物制造中占據(jù)重要地位[6]。嗜甲烷菌能在好氧或厭氧的條件下，以甲烷作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長和代謝。相比于較難實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)的厭氧性嗜甲烷菌，好氧性嗜甲烷菌對全球甲烷消除的貢獻(xiàn)率高達(dá)10%～20%[7]，且易培養(yǎng)和適合基因操作。好氧性嗜甲烷菌主要分為γ?變形菌門（Ⅰ型和Ⅹ型）、α?變形菌門（Ⅱ型）和疣微菌門三類，利用體內(nèi)的甲烷單加氧化酶（Methane monooxygenase，MMO）實(shí)現(xiàn)甲烷的氧化，并進(jìn)一步通過單磷酸核酮糖循環(huán)（Ribulose monophosphate, RuMP）、絲氨酸循環(huán)（Serine cycle）或卡爾文循環(huán)（Calvin?Benson?Bassham cycle, CBB cycle）等關(guān)鍵代謝途徑實(shí)現(xiàn)碳同化[8]。

近年來，圍繞好氧性嗜甲烷菌開發(fā)和優(yōu)化了該菌株遺傳操作工具[9?10]，通過通量平衡分析（Flux balance analysis，F(xiàn)BA）和對代謝通路節(jié)點(diǎn)的理性改造已實(shí)現(xiàn)甲烷生物轉(zhuǎn)化合成單細(xì)胞蛋白、乳酸、黏康酸和2,3?丁二醇等化學(xué)品[11?15]。然而，如何調(diào)控和優(yōu)化甲烷轉(zhuǎn)化過程中的還原力和能量供給，已成為提高代謝通量的關(guān)鍵。本文圍繞底物水平磷酸化和氧化磷酸化兩個(gè)關(guān)鍵途徑分析了好氧性嗜甲烷菌的能量代謝網(wǎng)絡(luò)，然后重點(diǎn)論述了生物能供給及碳-氮代謝通量調(diào)控的相關(guān)研究進(jìn)展，最后探討和展望了好氧性嗜甲烷菌在能量代謝調(diào)控方面所面臨的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

1 好氧性嗜甲烷菌的能量代謝途徑

作為一種原核微生物，好氧性嗜甲烷菌可通過底物水平磷酸化和氧化磷酸化完成能量供給和代謝，其體內(nèi)同時(shí)存在己糖二磷酸（Embden?Meyerhof?Parnas，EMP）途徑和2?酮?3?脫氧?6?磷酸葡糖酸（Entner?Doudoroff，ED）途徑兩種糖酵解（Glycolysis）途徑[16]，以及一個(gè)完整的三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle, TCA）[17?20]。在底物水平磷酸化途徑中釋放的還原型輔酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和還原型黃素二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide, reduced，F(xiàn)ADH2）隨后經(jīng)氧化磷酸化作用，形成水分子并將釋放出的能量合成ATP[21]。好氧性嗜甲烷菌中各能量代謝途徑中每氧化一分子果糖?6?磷酸（Fructose?6?phosphate，F(xiàn)6P）所生成的還原力和ATP的分子數(shù)如表1所示。

表1 好氧性嗜甲烷菌能量代謝途徑的產(chǎn)能概況

1.1 底物水平磷酸化

1.1.1 糖酵解

不同于大多數(shù)以糖為碳源的微生物，好氧性嗜甲烷菌的糖酵解途徑是不完整的，其EMP途徑和ED途徑都沒有初始的糖磷酸化的參與，而是通過F6P與單磷酸核酮糖循環(huán)連接。依賴焦磷酸鹽（PPi）的EMP途徑是一種更有效的節(jié)能途徑，可以產(chǎn)生更多的凈ATP[24]（圖1）。F6P首先轉(zhuǎn)化為果糖?1,6?二磷酸（Fructose 1,6?bisphosphate，F(xiàn)BP），隨后經(jīng)醛縮酶裂解為3?磷酸甘油醛（Glyceraldehyde?3?phosphate，GAP）和磷酸二羥基丙酮（Dihydroxyacetone phosphate，DAP），后者可以異構(gòu)化為GAP，最終被轉(zhuǎn)化為丙酮酸（Pyruvate）。而在ED途徑中，F(xiàn)6P相繼通過葡萄糖?6?磷酸（Glucose?6?Phosphate，G6P）和6?磷酸葡糖酸（6?phosphogluconate, 6PG）轉(zhuǎn)化為2?酮?3?脫氧?6?磷酸葡萄糖酸（2?keto?3?deoxy?6?phosphogluconate，KDPG），接著經(jīng)KDPG醛縮酶裂解為GAP 和丙酮酸，其中GAP 可繼續(xù)進(jìn)入到EMP途徑的第二階段，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸[25]。

圖1 好氧性嗜甲烷菌的底物水平磷酸化途徑

在不同類型的好氧性嗜甲烷菌中，EMP 和ED途徑略有不同。Ⅰ型嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum20Z的轉(zhuǎn)錄組分析表明編碼糖酵解途徑酶的轉(zhuǎn)錄本豐度比ED途徑高2～10倍，細(xì)胞中75%的丙酮酸來自PPi介導(dǎo)的EMP途徑，而僅有25%來自ED 途徑[24]。13C 標(biāo)記[26]和基因組尺度代謝模型模擬[27]均表明EMP途徑在Ⅰ型嗜甲烷菌Methylomicrobium buryatense5GB1C 的代謝中起主導(dǎo)作用，其能量代謝分析表明，當(dāng)調(diào)小EMP與ED的通量比時(shí)，細(xì)菌生長速度會(huì)因能量失衡急劇下降。相比于EMP途徑，ED 途徑具有產(chǎn)能速率快的優(yōu)勢，對維持M.buryatense5GB1C的生長亦至關(guān)重要[16]，但其在維持M. buryatense5GB1C正常生長和功能代謝方面的機(jī)制尚未被解析。X 型嗜甲烷菌Methylococcus capsulatusstr. Bath的基因組代謝模型預(yù)測顯示ED途徑是主要的碳同化途徑，在0.37h-1的最優(yōu)生長條件下，ED與EMP的通量比率最高可達(dá)10.9∶1[28]。

1.1.2 TCA循環(huán)

TCA循環(huán)是微生物體內(nèi)高效的產(chǎn)能代謝通路，也是能量代謝的樞紐，好氧微生物中約95%的ATP來自TCA循環(huán)和氧化磷酸化[29]。由于好氧性嗜甲烷菌能夠從還原型一碳化合物的氧化過程中獲得能量，因此其TCA循環(huán)產(chǎn)生的能量被認(rèn)為主要用于生物合成[30]。

在Ⅰ和Ⅹ型嗜甲烷菌中，TCA循環(huán)與EMP和ED途徑的耦聯(lián)是通過后者的終產(chǎn)物丙酮酸氧化脫羧形成的乙酰輔酶A實(shí)現(xiàn)（圖1）。核心代謝物的13C標(biāo)記表明，當(dāng)M. buryatense5GB1以甲烷作為唯一的碳源和能源時(shí)，TCA循環(huán)約占蘋果酸從頭合成總通量的45%，這對于維持菌體生長至關(guān)重要[23]；當(dāng)以甲醇為碳源時(shí)，此時(shí)TCA循環(huán)主要在從頭生物合成過程中發(fā)揮重要作用[31]。此外，M.buryatense5GB1中存在將α?酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A 的α?酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體、α?酮戊二酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和α?酮戊二酸脫羧酶，編碼三種酶的基因表達(dá)水平與其他TCA循環(huán)基因相似[30]，但M. buryatense5GB1的TCA循環(huán)通量微弱，僅占細(xì)胞總能量產(chǎn)量的20%左右[26]。M. alcaliphilum20Z和Methylosinus trichosporiumOB3b中參與TCA循環(huán)的蘋果酸脫氫酶（Malatedehydrogenase，MDH）的體外酶動(dòng)力學(xué)分析表明，前者更傾向于催化蘋果酸鹽氧化生成草酰乙酸（Oxaloacetic acid，OAA）從而滿足其對耐鹽滲透保護(hù)劑天冬氨酸的需求，而后者對草酰乙酸的還原效果較好[32]。Ⅱ型嗜甲烷菌M. trichosporiumOB3b 是利用絲氨酸途徑形成C2和C3化合物作為初級(jí)中間代謝物實(shí)現(xiàn)甲烷的碳同化，通過草酰乙酸和蘋果酸（Malate）與TCA循環(huán)相耦聯(lián)，與I型嗜甲烷菌相比，有較高碳通量的TCA循環(huán)[25]。蘋果酸脫氫酶在不同類型好氧性嗜甲烷菌產(chǎn)生必要生物合成代謝物的特定途徑中很好地適應(yīng)了它的代謝作用。此外，兩種MDH的生化特性也反應(yīng)了在嗜甲烷菌中TCA 循環(huán)主要完成合成代謝功能[30,32]。而Ⅹ型嗜甲烷菌M. capsulatusBath的TCA循環(huán)并非在甲烷氧化條件下進(jìn)行，由于缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)，尚無法對其TCA循環(huán)進(jìn)行推測和分析[17]。

1.2 氧化磷酸化

目前認(rèn)為好氧性嗜甲烷菌的生物氧化模型由NADH脫氫酶、細(xì)胞色素bc1型復(fù)合體和氧依賴末端電子受體組成[33]。好氧性嗜甲烷菌利用可溶的細(xì)胞質(zhì)MMO（sMMO）或顆粒狀的膜相關(guān)MMO（pMMO）實(shí)現(xiàn)甲烷氧化。相比于sMMO，pMMO 對甲烷有著較高的親和力，同時(shí)參與甲烷轉(zhuǎn)化和輔酶再生過程。pMMO 可能通過醌池與細(xì)胞色素bc1復(fù)合體上的電子傳遞鏈耦合，電子經(jīng)過NADH脫氫酶和醌池傳遞至pMMO，但pMMO的生理電子供體尚未被解析[34?35]。pMMO催化的甲烷氧化過程存在三種可能的電子傳遞模式。① 氧化還原臂模式：NADH經(jīng)過電子傳遞鏈的復(fù)合體Ⅰ生成泛醌（UQH2）作為電子供體驅(qū)動(dòng)甲烷氧化，甲醇脫氫酶通過細(xì)胞色素c將電子直接傳遞至復(fù)合物Ⅳ，產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力和ATP；② 直接耦合模式：以細(xì)胞色素c作為甲烷氧化的電子供體，甲醇脫氫酶直接將電子傳遞給pMMO；③ 向上電子轉(zhuǎn)移模式：甲醇氧化產(chǎn)生的電子發(fā)生從細(xì)胞色素c到UQH2的反向電子流動(dòng)，部分驅(qū)動(dòng)甲烷氧化（圖2）[36?37]。

圖2 好氧性嗜甲烷菌的甲烷氧化過程的三種電子傳遞模式

目前，主要基于基因組尺度代謝模型的通量平衡分析研究好氧性嗜甲烷菌甲烷氧化過程，這為揭示不同類型好氧性嗜甲烷菌的電子傳遞機(jī)制提供了理論指導(dǎo)。Ⅰ型嗜甲烷菌M. buryatense5GB1 的甲烷氧化由甲醇氧化提供電子，來自NADH衍生的電子驅(qū)動(dòng)的甲烷氧化僅占20%，M. alcaliphilum20ZR以細(xì)胞色素c為甲烷氧化的電子供體時(shí)能夠獲得最優(yōu)的生長速率[19,38]。X型嗜甲烷菌M. capsulatusBath雖然能以直接耦合或向上電子轉(zhuǎn)移兩種模式驅(qū)動(dòng)甲烷氧化，但電子傳遞效率較低[39]。此外，Ⅱ型嗜甲烷菌Methylocystis hirsutaCSC1 和Methylocystissp.SC2 的甲烷氧化是與呼吸鏈中復(fù)合體I 相耦合的氧化還原臂模式[40]，該模式也有助于M. trichosporiumOB3b 和Methylocystis parvusOBBP 在甲烷氧化時(shí)獲得最高的氧氣/甲烷消耗比[36,41]。以上結(jié)果表明，好氧性嗜甲烷菌的甲烷氧化效率與天然電子傳遞速率相耦聯(lián)，但由于基因組尺度代謝模型存在局限性和不確定性，相關(guān)偶聯(lián)模式仍需整合代謝工程進(jìn)行探究。

2 好氧性嗜甲烷菌中能量供給與碳/氮代謝

2.1 能量供給與碳代謝

好氧性嗜甲烷菌利用甲烷和甲醇為碳源生長時(shí)，生長速率相似，但具有顯著的代謝差異。Fu等[31]利用代謝組學(xué)和13C 同位素標(biāo)記對M. buryatense5GB1在甲醇上生長的核心碳代謝進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與甲烷相比M. buryatense5GB1的TCA 循環(huán)是不完整的，其EMP與ED途徑的通量比減小，絲氨酸循環(huán)的碳通量和甲酸鹽的分泌顯著增加。Sugden等[42]比較了M. albumBG8以甲烷和甲醇為碳源生長的轉(zhuǎn)錄組和代謝組特征，結(jié)果表明，在甲醇培養(yǎng)下M. albumBG8 的ED 途徑和氧化戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）基因表達(dá)顯著上調(diào)，TCA循環(huán)的代謝物含量降低，NADH 脫氫酶基因表達(dá)顯著下調(diào)。Nguyen 等[43]研究發(fā)現(xiàn)在甲醇上生長時(shí)M. alcaliphilum20Z的RuMP途徑通量較甲烷顯著降低，四氫甲烷蝶呤途徑（Tetrahydromethanopterin，H4MPT）和四氫葉酸途徑（Tetrahydrofolate，H4F）通量顯著增加，部分絲氨酸循環(huán)的基因表達(dá)上調(diào)。以上研究表明，當(dāng)碳源由甲烷切換至甲醇時(shí)，好氧性嗜甲烷菌氧化甲醇產(chǎn)生的一個(gè)電子直接進(jìn)入電子傳遞鏈生成ATP，其通過調(diào)控與能量供給相關(guān)的碳代謝的通量分布和基因表達(dá)水平減少其他代謝途徑的NADH和ATP生成（如底物水平磷酸化途徑、甲酸脫氫酶和NADH 脫氫酶），維持胞內(nèi)的氧化還原的平衡[37]。此外，甲醛的同化和氧化可能是一個(gè)靈活的代謝節(jié)點(diǎn)（圖3），在甲醇培養(yǎng)下H4MPT 途徑和部分絲氨酸循環(huán)代謝活性的提高，不僅緩解了甲醛積累對好氧性嗜甲烷菌的毒性，還為C1底物高效轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A提供了一種替代策略[44]。

圖3 好氧性嗜甲烷菌的碳代謝

好氧性嗜甲烷菌轉(zhuǎn)化1mol甲烷消耗1.1～1.5mol的氧氣，同時(shí)需要2mol電子和2mol質(zhì)子的參與。因此，甲烷氧化效率與CH4/O2比以及能量供給水平相關(guān)。Hu 等[45]分析了不同CH4/O2的供氣比對M. buryatense5GB1生長和基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)CH4/O2供應(yīng)摩爾比為0.93時(shí)最有利于M. buryatense5GB1的生長，其胞內(nèi)的NADH/NAD+值比0.58 和5.24 高，丙酮酸濃度和pMMO 酶活性達(dá)到最高，EMP 途徑和TCA循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。在最佳CH4/O2比的培養(yǎng)條件下，好氧性嗜甲烷菌的底物水平磷酸化途徑基因的高效表達(dá)為pMMO 提供了充足的還原力，從而提高了甲烷的氧化效率和胞內(nèi)的碳通量，促進(jìn)細(xì)胞生長。Tentori 等[46]研究了在底物限制條件下M. albumBG8轉(zhuǎn)錄組水平的變化，發(fā)現(xiàn)在甲烷限制和氧限制下分別篩選到444 和282 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），這些DEGs 主要富集在能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換的代謝通路。Gilman 等[47]研究表明在氧脅迫下M. buryatense5GB1C調(diào)控與電子傳遞鏈和氧化還原反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平，保持發(fā)酵和呼吸代謝相結(jié)合的最佳代謝狀態(tài)。

基于好氧性嗜甲烷菌在不同碳源和CH4/O2比培養(yǎng)下轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組的研究，明確了其能量供應(yīng)與碳代謝通量的互作關(guān)系，為理性改造好氧性嗜甲烷菌的碳流和能量流生產(chǎn)高還原性化合物提供了豐富的基因靶點(diǎn)。

2.2 能量供給與氮代謝

好氧性嗜甲烷菌能利用硝酸鹽、氯化銨、尿素等氮源進(jìn)行生長[48]，在不同的氮源培養(yǎng)下其生物能供給具有不同特點(diǎn)。Sugden等[42]研究表明相比于硝酸鹽，以氯化銨為氮源時(shí)，M.albumBG8的氧化磷酸化和TCA循環(huán)途徑有較多轉(zhuǎn)錄本和代謝物，羥胺脫氫酶（haoAB）、多藥與毒物外排家族和ABC 型多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等外排泵相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。高水平的能量供給可能有助于菌株快速解除羥胺積累對細(xì)胞的毒性，促進(jìn)細(xì)胞的生長和代謝。

嗜甲烷菌有功能性完整的固氮系統(tǒng)，包括固氮結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因[19,49]（圖4）。Cui等[50]研究了自然濕地中挺水植物根部的固氮作用，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充CH4（體積分?jǐn)?shù)5%）能顯著促進(jìn)挺水植物根系固氮，后續(xù)基于cDNA的nifH基因測序分析表明，Methylosinus（Ⅱ型嗜甲烷菌）的固氮作用促進(jìn)了挺水植物根系中CH4氧化依賴的氮固定，驗(yàn)證了好氧性嗜甲烷菌在自然濕地中減少CH4排放和固定N2促進(jìn)植物生長的潛在作用。生物固氮是高耗能過程，一分子氮?dú)膺€原成兩個(gè)氨分子至少需要8個(gè)電子和16個(gè)ATP[51]，充沛的能量供給網(wǎng)絡(luò)是保障好氧性嗜甲烷菌高效固氮和維持正常生長代謝的必要條件。基于轉(zhuǎn)錄組測序的好氧性嗜甲烷菌的氮代謝特征分析表明其固氮能力與能量供給息息相關(guān)，也為全面了解好氧性嗜甲烷菌的固氮功能奠定了基礎(chǔ)。Guo 等[52]分析了轉(zhuǎn)錄因子NifA對M. buryatense5GB1固氮作用的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)與NifA 缺失突變體相比，野生菌株中編碼固氮酶結(jié)構(gòu)、固氮酶輔因子生物合成和電子傳遞的基因顯著上調(diào)，表明NifA不僅在固氮酶的組成和表達(dá)中發(fā)揮重要作用，還能調(diào)控能量供應(yīng)，從而促進(jìn)嗜甲烷菌對氮?dú)獾墓潭āu 等[45]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氧原子供應(yīng)比為0.93時(shí)，M. buryatense5GB1的生物固氮活性被激發(fā)，其與生物固氮和能量代謝相關(guān)的基因顯著上調(diào)。

圖4 好氧性嗜甲烷菌的氮代謝

目前，關(guān)于好氧性嗜甲烷菌固氮功能的研究相對較少，其固氮級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制、固氮體系與能量供給的匹配關(guān)系均需要深入研究，以實(shí)現(xiàn)好氧性嗜甲烷菌高效固定氮?dú)膺M(jìn)行生長和代謝。

3 結(jié)語

現(xiàn)階段，基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型、高通量組學(xué)分析技術(shù)和代謝工程改造等工具的相關(guān)研究初步探索了好氧性嗜甲烷菌的能量代謝與碳?氮代謝之間的協(xié)同調(diào)控。以上研究表明，圍繞好氧性嗜甲烷菌生物能的強(qiáng)化和再分配，建立能量供給與目標(biāo)代謝流的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)，為有效克服關(guān)鍵代謝瓶頸，提高好氧性嗜甲烷菌的甲烷氧化效率和固氮能力提供思路和方法。然而，目前好氧性嗜甲烷菌中pMMO的生理電子供體尚未確定，有關(guān)甲烷氧化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證至今也未見報(bào)道，難以通過人工策略有效地強(qiáng)化甲烷的氧化過程。此外，利用代謝工程方法驗(yàn)證基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型的碳?氮代謝通量平衡分析的研究相對較少。因此，強(qiáng)化好氧性嗜甲烷菌的能量供給網(wǎng)絡(luò)仍然面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。

未來，對于好氧性嗜甲烷菌的能量和還原力供給方面，可以研究胞內(nèi)底物水平磷酸化相關(guān)途徑的能量供給脈絡(luò)，優(yōu)化能量代謝路徑，強(qiáng)化產(chǎn)能效率。同時(shí)，借助胞外能量來源，構(gòu)建基于生物-光敏劑雜化系統(tǒng)的胞外人工電子傳遞路徑，為甲烷單加氧酶提供額外的電子，提高好氧性嗜甲烷菌的甲烷氧化效率。還可以補(bǔ)充以木質(zhì)纖維素為原料的生物質(zhì)糖輔助碳源，進(jìn)一步強(qiáng)化能量流與碳流。探究碳-氮代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)及生物能供給強(qiáng)化，為加快好氧性嗜甲烷菌實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化甲烷和氮?dú)馍a(chǎn)高附加值化學(xué)品提供了可行的研究策略。