向銳　孫藝萌　梁晨　師校欣　杜國強　王莉

關鍵詞：葡萄；PLATZ；生物信息學；種子發(fā)育；表達分析

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）01-0013-12

PLATZ（plant AT-rich sequence and zinc-binding protein）是一類新型的植物特異鋅指類轉(zhuǎn)錄因子，具有PLATZ保守結構域（PF04640）。豌豆（Pisum sati-vum） PLATZ1是第一個被報道的PLATZ蛋白，是植物特異性、鋅依賴DNA結合蛋白，可以非特異性地與富含A/T的堿基序列結合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，并具有C-X₂-H-X₁₁-C-X₂-C-X_（4-5）-C-X₂-C-X_（3-7）-H-X2-H（CHC₄H₂）和C-X₂）-C-X_（10-11））-C-X（10-11）-C這兩個高度保守的蛋白鋅指基序。

PLATZ家族鑒定分析已在擬南芥、水稻、玉米、蕪青、小麥和油橄欖等物種中開展，并發(fā)現(xiàn)一系列在植物脅迫響應及生長發(fā)育調(diào)控方面具有重要功能的PLATZ轉(zhuǎn)錄因子。首先，在植物非生物脅迫響應方面，擬南芥AtPLA TZ1和AtPLA T22參與調(diào)控營養(yǎng)組織和種子的脫水抗性；在擬南芥中過表達棉花GhPLATZ/基因能顯著增強萌發(fā)期和苗期的滲透脅迫耐受性。其次，在植物生長發(fā)育調(diào)控方面，異源表達水仙NtPLA TZ1基因能抑制煙草生長，沉默Nt-PLATZ1基因能促進煙草生長。玉米Fl3 （Zm-PLAT212）基因在玉米胚乳淀粉細胞中特異性表達，影響種子胚乳發(fā)育和養(yǎng)分儲藏；水稻PLATZ轉(zhuǎn)錄因子GL6通過調(diào)控幼穗和谷粒的細胞增殖，決定籽粒長度和小穗;數(shù)；由此可見PLATZ轉(zhuǎn)錄因子在包括種子發(fā)育在內(nèi)的多種生物學過程中有重要作用。

葡萄（Vitis vinifera L.）是世界上重要的果樹作物之一，果實及其加工品具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。目前關于葡萄PLATZ轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)研究未見有報道，特別是參與種子發(fā)育的報道。筆者在本研究中利用生物信息學方法對葡萄PLATZ家族成員進行了鑒定，分析了基因結構、同線性關系、染色體定位、進化關系、蛋白質(zhì)保守基序等，并對該家族成員在種子發(fā)育過程中與IAA處理下的表達模式進行了分析，為揭示葡萄PLATZ轉(zhuǎn)錄因子進化機制提供有用信息，為后續(xù)研究葡萄PLATZ家族基因的生物學功能奠定基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料和處理

本試驗于2021年4月-2021年10月在河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院生物技術實驗室進行。試驗材料為3個有核葡萄品種巨峰（Kyoho）、醉金香（Zui-jinxiang）、紅地球（Red Globe）和2個無核葡萄品種火焰無核（Flame Seedless）、克瑞森無核（Crimson Seedless），均種植保存于河北保定河北農(nóng)業(yè)大學（E115°29′，N38°51′）葡萄資源圃，年平均氣溫13.4℃，年平均日照2511 h，年平均降水量498.9 mm。分別對無核品種火焰無核、克瑞森無核及有核品種巨峰、醉金香于盛花后20、30、40、50 d收集胚珠。配制100μmol·L^-1IAA溶液均勻噴施于紅地球葡萄植株嫩葉，以無菌水噴施嫩葉為對照，于處理1、3、6h后收集嫩葉。每個處理設置3次生物學重復，收集的胚珠和葉片樣品立即放入液氮中，并存于-80℃冰箱中備用。

1.2葡萄PLATZ家族成員鑒定

通過Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tabl）獲取PLATZ家族蛋白保守結構域（PF04640）的隱馬爾可夫（HMM）文件，利用SPDEhmmersearch功能（HMMER 3.0）獲得候選蛋白，以所有候選蛋白序列作為查詢索引，使用國家生物技術信息中心（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLASTp程序默認設置下搜索葡萄基因組同源蛋白，將候選NCBI同源蛋白利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.genoscope.cn.fr）和葡萄基因組CRIBI生物技術網(wǎng)站（http：//genome s.cribi.unipd.it/）進一步進行同源比對篩選，并利用SMART （http：//smart.embl-heidelberg.de）和Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tabl）人為核對去除結構域不完整的蛋白，獲得最終鑒定的PLATZ成員，并依據(jù)基因染色體位置命名。利用Ex PASy數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protparam/）中的Prot Param功能對PLATZ蛋白質(zhì)的等電點、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)等基本信息進行分析。使用PSORT在線網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行葡萄PLATZ家族成員亞細胞定位預測。

1.3 PLATZ家族同線性分析

從植物基因組復制數(shù)據(jù)庫（http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/）下載葡萄PLATZ自身基因組間及葡萄與擬南芥基因組間的同線區(qū)域，并用Cir-cos 0.63 （http：//circos.ca/）繪圖。

1.4葡萄PLATZ家族基因結構、蛋白保守基序及系統(tǒng)進化樹分析

在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.genoscope.cns.fr）獲得葡萄基因組序列、CDS序列及蛋白序列。使用網(wǎng)站GSDS 2.0 （http：//gsds.gao-lab.org/in-dex.php）開展外顯子-內(nèi)含子分析。利用在線網(wǎng)站MEME （http：//meme-suite.org/）開展葡萄PLATZ家族蛋白保守基序分析，參數(shù)如下：高級選項默認，最大基序數(shù)7。使用SMART和Pfam數(shù)據(jù)庫對MEME基序進行注釋。利用TBtools軟件繪制motifs圖。利用MEGAX軟件對葡萄、擬南芥、水稻、玉米、番茄和大豆共6個物種的PLATZ蛋白序列開展Clust-al W多重序列比對，采用鄰接法（Neighbor-joining Tree）構建系統(tǒng)進化樹，bootstraps檢驗（n=1000）。

1.5葡萄PLATZ家族基因啟動子順式作用元件分析

使用SPDE軟件獲取VvPLA TZs上游2000 bp啟動子序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioin-formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子區(qū)域順式作用元件種類及數(shù)量。

1.6 VvPLATZ基因有核無核葡萄子代種子發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析

通過已發(fā)表轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（登陸號，PRJ-NA338255），分析VvPLA TZ基因在有核葡萄紅地球和無核葡萄森田尼無核雜交分離有核、無核子代種子發(fā)育的3個時期（盛花后24、30、39 d）的表達模式，所用材料、時期與已發(fā)表文獻[19]-致，用TB-tools軟件繪制基因表達熱圖。

1.7總RNA提取與qRT-PCR表達分析

RNA提取使用全能型植物RNA提取試劑盒（CWBIO，Beijing，China），并采用NanoDrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific，Shanghai，China）測定RNA的OD值，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品質(zhì)量。利用ScriptRTase （Trans Gen Biotech， Beijing，China）去除gDNA，使用UEIris Ⅱ RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis試劑盒（US Ever-bright Inc.）合成cDNA。用于qRT-PCR反應的特異性引物均用Primer 5軟件設計，其中VvPLAT24和Vv PLA T213的cDNA序列高度相似，因此共用一對引物，引物序列見表1，Actin（NC_012010）為內(nèi)參基因。反應體系20μL：上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，2×Fast Super EvaGreen qPCR Mastermix 10μL，ddH₃O 7μL。設置3次生物學重復和3次技術重復。qRT-PCR設備為LightCycler96（Roche，Shanghai，China），反應程序：95℃120 s；95℃5 s；59℃30 s，45個循環(huán)。依據(jù)2^-ΔΔCT法計算基因的相對表達量，并用Excel 2019進行整理及制圖，運用SPSS軟件進行顯著性分析。

2結果與分析

2.1葡萄PLATZ家族成員鑒定、亞細胞定位預測及同線性分析

從葡萄全基因組中鑒定出13個PLATZ家族成員，分別命名為VvPLA TZ1～VvPLAT213。由表2可知，葡萄VvPLA TZs基因不均勻地分布在9條染色體上，3個基因在1號染色體，9個基因分別位于2、3、6、8、11、15、16、18號染色體，VvPLAT213基因未知。家族成員氨基酸序列長度為115（ VvPLAT22）～306（VvPLAT212）aa，分子質(zhì)量最大為34 700.11 Da（VvPLAT212），最小為12 703.00 Da（VvPLA T22），等電點為8.20（VvPLAT21）～10.12（VvPLAT22），不穩(wěn)定系數(shù)為36.88（VvPLAT212）～71.24（VvPLAT28），脂肪系數(shù)為62.37（VvPLAT22）～85.96（VvPLA T213）。亞細胞定位預測結果表明，葡萄PLATZ家族13個成員中有9個定位于細胞核，2個定位于細胞質(zhì)，1個定位于葉綠體，1個定位于過氧化物酶體。

根據(jù)葡萄自身基因組及葡萄與擬南芥PLATZ家族同線性分析（圖1），發(fā)現(xiàn)葡萄基因組內(nèi)Vv PLAT25～VvPLA TZ11和VvPLA T27～VvPLAT28兩組并聯(lián)重復，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復。葡萄與擬南芥基因組之間PLATZ家族同線性分析發(fā)現(xiàn)，VvPLA T23與AT2G01818存在同線性區(qū)域。

2.2葡萄PLATZ家族基因結構及蛋白保守基序分析

為了更好地了解基因進化過程，對PLATZ家族成員的基因結構信息進行分析。系統(tǒng)進化樹分析（圖2-A）表明，A組PLATZ基因均含有5個外顯子，表現(xiàn)出一定結構保守性，其他組PLATZ同組基因外顯子一內(nèi)含子結構具有多樣性，例如B組PLATZ基因外顯子數(shù)目為2～7個不等（圖2-B）；C組PLATZ基因外顯子數(shù)目為3～6個不等，D組的VvPLA T22和VvPLA T23分別含有3個和5個外顯子。蛋白保守基序分析（圖2-C）表明，葡萄PLATZ家族整體上在蛋白保守基序分布模式和數(shù)量上呈現(xiàn)較強保守性，均含有PLATZ保守結構域。

2.3葡萄PLATZ家族系統(tǒng)進化分析

為了研究葡萄與其他物種PLATZ家族成員的進化關系，將源于葡萄（13個）、擬南芥（12個）、番茄（21個）、大豆（30個）、水稻（15個）和玉米（15個）的PLATZ蛋白序列開展系統(tǒng)進化樹分析（圖3），研究發(fā)現(xiàn)，來自不同物種的106個PLATZ家族成員可分為5個亞族（A～E），亞族A、B、C、D分別包含2、3、6和2個葡萄PLATZ成員，亞族E不包含任何葡萄PLATZ成員，表現(xiàn)出一定的進化遺失。與單子葉植物水稻與玉米相比，大部分葡萄PLATZ家族成員與雙子葉植物大豆、番茄和擬南芥PLATZ親緣關系更近，例如亞族A的VvPLAT25和SIPLAT219，亞族B的VvPLAT212和AtPLAT25、VvPLAT28和SI-PLAT220，以及亞族D的VvPLAT22和GmPLAT25具有較高的序列相似性，而單子葉植物水稻與玉米PLATZ成員相似性較高。這一現(xiàn)象與單子葉植物與雙子葉植物進化上的親緣關系一致，與單子葉植物相比，雙子葉植物之間起源于更近的祖先。

2.4葡萄PLATZ家族基因啟動子順式作用元件分析

不同類型的順式作用調(diào)控元件在基因啟動子區(qū)域的分布模式一定程度上能揭示基因潛在的生物學功能和調(diào)控差異。通過對葡萄PLATZ家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析（圖4），共鑒定出24種元件，按功能分為4類，激素響應類元件（茉莉酸甲酯、脫落酸、生長素、水楊酸、赤霉素）、光響應類元件、脅迫響應類元件（防御和脅迫、厭氧、干旱、低溫、傷口反應）、植物發(fā)育調(diào)控類元件（胚乳表達、分生組織表達、種子特異性調(diào)控、晝夜節(jié)律控制、玉米醇溶蛋白代謝）。

除VvPLA T26基因外，其余基因均有激素響應元件，包括茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif，TGACG-motif）、脫落酸響應元件（ABRE）、生長素響應元件（TGA-element、AuxRR-core）、水楊酸響應元件（TCA-element）和赤霉素響應元件（GARE-mo-tif、P-box、TATC-box）（圖4）。茉莉酸甲酯響應元件最為豐富（24個），脫落酸響應元件次之（23個），含有最多激素響應元件的基因為VvPLA T28（圖4），推測大多數(shù)VvPLA TZ基因在激素調(diào)控途徑中具有重要作用。

除VvPLATZ11和VvPLAT25以外，大多數(shù)葡萄PLATZ基因均含有脅迫響應順式元件，如厭氧誘導元件（ARE）、低溫響應元件（LTR）、干旱誘導元件（MBS）、傷口反應元件（WUN-motif）和防御與脅迫響應元件（TC-rich repeats）。此外，植物生長發(fā)育相關元件（CAT-box、circadian、GCN4_ motif、02-site及RY-elements）的存在表明PLATZ基因很可能參與葡萄生長發(fā)育。

2.5葡萄PLATZ家族基因在種子發(fā)育過程中的表達模式分析

利用已發(fā)表轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，開展VvPLATZs基因在雜交分離有核、無核子代種子發(fā)育表達模式分析（圖5-A），發(fā)現(xiàn)除VvPLAT22、VvPLAT25、VvPLATZ11、VvPLAT212外，其他VvPLATZ基因在有核、無核子代種子發(fā)育過程中RPKM表達量均較低或未檢測出。與有核子代相比，VvPLAT25、VvPLATZ11及VvPLAT212在無核子代種子發(fā)育過程中均顯著上調(diào)表達；而VvPLAT22在有核子代種子較無核子代上調(diào)表達?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，筆者在本研究中進一步選取8個基因在兩個有核葡萄（巨峰、醉金香）和兩個無核葡萄（火焰無核、克瑞森無核）中開展種子發(fā)育qRT-PCR分析，以驗證基因表達模式在多個品種中的廣譜性。結果表明（圖5-B），VvPLAT22和VvPLAT26在有核品種種子發(fā)育過程中表達量顯著高于無核品種，推測其可能在種子發(fā)育過程中發(fā)揮作用。與有核品種相比，VvPLAT25在兩個無核葡萄品種種子發(fā)育過程中表達量均顯著高于有核品種，暗示其可能與胚珠敗育有關。值得注意的是，VvPLAT22和VvPLAT25基因呈現(xiàn)的差異表達模式幾乎涵蓋整個發(fā)育時期，且差異變化倍數(shù)較大。VvPLAT24/13、VvPLATZ11和VvPLAT212在無核品種種子發(fā)育前期（20、30 d）表達量均顯著高于有核品種。以上qRT-PCR結果與轉(zhuǎn)錄組結果基本一致。

2.6 IAA處理后葡萄PLATZ家族基因表達模式分析

通過開展葡萄PLATZ家族基因在IAA處理下的表達模式分析（圖6），發(fā)現(xiàn)8個VvPLATZs均響應IAA處理，VvPLA T24/13在IAA處理后th響應且表達水平顯著大幅度上調(diào)，VvPLAT22、VvPLA T26和VvPLATZ10在IAA處理后6h表達水平顯著下調(diào)，VvPLAT25和VvPLA T212在IAA處理后3和6h表達水平顯著上調(diào)，且上調(diào)倍數(shù)較大。因此，推測VvPLAT24/13、VvPLA T25和VvPLA T212基因可能在IAA信號調(diào)節(jié)途徑中起重要作用。

3討論

PLATZ家族基因系統(tǒng)鑒定已在多種植物中開展，不同物種鑒定到的成員數(shù)各不相同。前人在擬南芥、水稻、小麥、番茄、油橄欖和蕪青中分別鑒定出12、15、49、21、29和24個PLATZ基因，筆者在葡萄全基因組中共鑒定出13個PLATZ家族基因，推測PLATZ家族基因在植物進化上具有多樣性。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，6個物種的PLATZ蛋白分為5個亞族，而亞族E不包含任何葡萄PLATZ成員，表現(xiàn)出一定的進化缺失，其余亞族雙子葉植物的PLATZ蛋白同源性更高，且VvPLATZ和SIPLATZ蛋白的親緣關系更密切，推測PLATZ基因在兩個物種分化前有共同的雙子葉祖先。

在進化上，基因復制事件后重復基因之間存在的功能保守和功能分化基本上取決于3種進化命運：缺失、亞功能化和新功能化。共線性分析結果表明，葡萄PLATZ家族存在兩組并聯(lián)重復基因，無串聯(lián)重復基因，這與Azim等在蕪青PLATZ基因家族的研究結果一致，表明并聯(lián)重復事件在葡萄PLATZ家族成員擴增過程中起主要作用。并聯(lián)重復基因VvPLAT25-VvPLATZ11表現(xiàn)出結構和功能的保守性：結構上，這對并聯(lián)重復基因均含5個外顯子，蛋白保守基序分布保持一致，啟動子順式作用元件均僅含光響應元件GTl-motif且無脅迫相關的元件；功能上，并聯(lián)重復基因VvPLAT25～VvPLATZ11表達模式相似，均在無核品種種子發(fā)育過程中較有核品種顯著高表達，且IAA處理后3h均顯著高表達。

PLATZ基因在胚乳發(fā)育等生物學過程中具有重要作用。前人分別在玉米、棉花和水稻中發(fā)現(xiàn)PLATZ基因?qū)ε呷榘l(fā)育、養(yǎng)分儲存、種子萌發(fā)、種子成熟等具有重要作用。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)VvPLAT22和VvPLAT26在有核葡萄種子發(fā)育過程中表達量顯著高于無核葡萄，推測這些基因與種子發(fā)育有關，而VvPLAT25在無核葡萄種子發(fā)育過程中表達量顯著高于有核葡萄，且VvPLAT25具有胚乳表達（GCN4_motif）和種子特異調(diào)控（RY-element）相關順式作用元件，推測該基因與胚珠敗育有關。目前鮮見果樹PLATZ基因響應激素處理的研究報道，本研究發(fā)現(xiàn)大部分葡萄PLA TZ基因響應IAA處理，且VvPLAT24/13、VvPLAT25及VvPLAT212響應幅度可觀，推測葡萄PLA TZ家族基因可能通過影響IAA途徑調(diào)控種子發(fā)育過程。本研究首次報道了葡萄PLATZ基因響應IAA處理，填補了此方面研究的空白。筆者在本研究中篩選出一些有核和無核葡萄種子發(fā)育差異表達基因，為后續(xù)無核分子育種提供基因資源，但這些候選基因的具體生物學功能及調(diào)控機制仍需要進一步研究。

4結論

在葡萄全基因組范圍內(nèi)共鑒定到13個PLATZ基因，通過生物信息學分析，將其分為4組，同組家族成員保守基序數(shù)目及類別具有保守性，基因結構分析表明除A組外葡萄PLATZ基因在進化上具有多樣性?；虮磉_分析顯示PLATZ基因在有核、無核葡萄種子發(fā)育不同時期表達模式存在差異且顯著響應IAA處理，推測其在葡萄種子發(fā)育過程中發(fā)揮作用。本研究加深了對葡萄PLATZ基因的認知，為進一步開展葡萄PLATZ基因功能研究奠定了理論基礎，有利于為葡萄無核分子育種提供優(yōu)質(zhì)基因資源。