劉一凡

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

李國(guó)良

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

王佑春*

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所

確保生物制品的質(zhì)量、安全性和有效性是生產(chǎn)企業(yè)的首要責(zé)任，而國(guó)家監(jiān)管機(jī)構(gòu)同樣需要建立相關(guān)程序確保生物制品符合質(zhì)量要求、有足夠的安全性和有效性[1]。作為特殊的生物制品，疫苗接種人體后可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，使人體獲得對(duì)相應(yīng)病原微生物的免疫力[2]，對(duì)防護(hù)個(gè)人免除相應(yīng)病原微生物的感染以及預(yù)防和控制傳染病傳播和流行至關(guān)重要。安全性和有效性是疫苗評(píng)價(jià)過(guò)程中兩個(gè)非常重要的指標(biāo)，尤其是疫苗的有效性。根據(jù)美國(guó)《聯(lián)邦法規(guī)匯編》（Code of Federal Regulations,CFR），有效性是指產(chǎn)品能夠產(chǎn)生其預(yù)期目的作用的特定能力或效能。它是通過(guò)使用該品種預(yù)期的給藥方法，采用合適的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法或者臨床對(duì)照研究數(shù)據(jù)獲得的[3]。

有效的疫苗接種人體后，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的免疫反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防機(jī)體感染相應(yīng)病原體或減輕疾病癥狀的效果。疫苗抗原具有與有效抗體結(jié)合或與有效淋巴細(xì)胞上的抗原受體密切結(jié)合的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，抗原物質(zhì)的這種特性為抗原性，即疫苗有效性評(píng)價(jià)中的有效抗原。有效抗原往往通過(guò)體外免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，即通常所說(shuō)的體外效價(jià)（in vitropotency）。作為免疫應(yīng)答的啟動(dòng)劑，疫苗抗原可以刺激動(dòng)物和人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)，這種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力就是免疫原性。免疫原性往往通過(guò)免疫動(dòng)物檢測(cè)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的水平，通常稱為體內(nèi)效價(jià)（in vivopotency）。作為反映有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，體外效價(jià)和體內(nèi)效價(jià)是疫苗檢測(cè)的主要指標(biāo)。但無(wú)論是體外效價(jià)還是體內(nèi)效價(jià)，都是檢測(cè)疫苗有效性的間接指標(biāo)；只有檢測(cè)其預(yù)防動(dòng)物或人體感染相應(yīng)病原體的能力或減輕相應(yīng)癥狀時(shí)，才是評(píng)價(jià)疫苗有效性的直接指標(biāo)。因此，在開(kāi)展疫苗臨床試驗(yàn)前，往往需要選擇合適的動(dòng)物模型進(jìn)行動(dòng)物感染病原體的保護(hù)試驗(yàn)。動(dòng)物模型顯示明顯的保護(hù)作用后方可開(kāi)展臨床試驗(yàn)，通過(guò)臨床試驗(yàn)來(lái)充分驗(yàn)證疫苗的有效性。本文將從疫苗抗原性、免疫原性、動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)效果和人體保護(hù)效果評(píng)價(jià)4 個(gè)維度來(lái)進(jìn)行討論。

1 疫苗抗原性檢測(cè)

疫苗抗原性即體外效價(jià)的檢測(cè)，是疫苗評(píng)價(jià)的重要一環(huán)。目前，疫苗抗原性檢測(cè)主要存在以下3 個(gè)瓶頸。首先，不同企業(yè)同一類疫苗的抗原性檢測(cè)結(jié)果缺乏可比性?，F(xiàn)今，對(duì)疫苗的抗原性檢測(cè)主要以中和抗體為基礎(chǔ)制備相應(yīng)的免疫方法進(jìn)行檢測(cè)，但不同企業(yè)選擇不同中和表位的抗體，無(wú)法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行可比性研究。即使選擇相同表位的抗體進(jìn)行檢測(cè)，但由于不同企業(yè)的生產(chǎn)工藝存在差異，檢測(cè)結(jié)果同樣缺乏可比性。其次，隨著多聯(lián)、多價(jià)疫苗的問(wèn)世，如多價(jià)人乳頭瘤病毒疫苗、多價(jià)肺炎疫苗、A 群C 群腦膜炎球菌b 型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗、無(wú)細(xì)胞百白破b 型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗、無(wú)細(xì)胞百白破脊髓灰質(zhì)炎b 型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗、百白破b 型流感嗜血桿菌和脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎六聯(lián)疫苗等，多價(jià)、多種抗原的聯(lián)合增加了疫苗抗原性檢測(cè)的復(fù)雜性。再次，在過(guò)去幾十年中，疫苗佐劑尤其是新型復(fù)雜佐劑得到了巨大發(fā)展。佐劑同疫苗抗原間存在相互作用，一定程度上增加了疫苗抗原性檢測(cè)的難度。

突破上述瓶頸，需要對(duì)檢測(cè)用的中和抗體進(jìn)行大量篩選，以此獲得針對(duì)主要且不易被破壞表位的抗體。這類抗體往往結(jié)合特殊或復(fù)雜的抗原表位，通過(guò)用這類抗體建立抗原的免疫檢測(cè)方法，可有效解決上述瓶頸問(wèn)題。下文將結(jié)合人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗和狂犬病疫苗有效抗原的檢測(cè)進(jìn)行具體說(shuō)明。

1.1 HPV16 疫苗有效抗原檢測(cè)

宮頸癌是影響全球女性健康的第四大惡性腫瘤。HPV16 作為宮頸癌最普遍的型別[4]，是引發(fā)宮頸癌的主要原因。由于HPV疫苗生產(chǎn)企業(yè)采用了不同的表達(dá)系統(tǒng)和生產(chǎn)工藝，在檢測(cè)過(guò)程中需要一種能夠識(shí)別優(yōu)勢(shì)中和表位并能與各種病毒樣顆粒產(chǎn)生反應(yīng)的單克隆抗體。通過(guò)大量篩選研究，篩選出5 種針對(duì)HPV16 的單克隆抗體（V5、8A9、5C10、4G12 和001），并以此建立HPV16 抗原的檢測(cè)方法，對(duì)5 種不同抗原分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，單克隆抗體001 的檢測(cè)值與蛋白定量最為接近，且離散程度最小。而且，不同疫苗產(chǎn)生的中和抗體滴度與單克隆抗體001 的量值相關(guān)性最好。中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步針對(duì)不同表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的病毒樣顆粒抗原開(kāi)展了方法適用性檢測(cè)，所有檢測(cè)值與蛋白定量相近，且各組之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)一步研究過(guò)程中，通過(guò)冷凍電子顯微鏡等技術(shù)對(duì)抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體001 結(jié)合于HPV L1蛋白的DE、FG 和HI 環(huán)區(qū)，位于五聚體的間隙[5]。單克隆抗體001 獨(dú)特的結(jié)合特點(diǎn)可以使多個(gè)抗體同時(shí)結(jié)合時(shí)不存在空間位阻，減少了檢測(cè)差異，使不同表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的抗原檢測(cè)結(jié)果更有可比性。綜上，單克隆抗體001可適用于不同表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的HPV16 疫苗有效抗原的檢測(cè)，且結(jié)果具有很好的可比性。

1.2 狂犬病疫苗有效抗原檢測(cè)

狂犬病病毒抗原含量是關(guān)系到狂犬病疫苗有效性的重要因素。糖蛋白是狂犬病病毒唯一能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體并與之結(jié)合的蛋白。世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦體外方法，即通過(guò)對(duì)糖蛋白定量進(jìn)行狂犬病疫苗的效力測(cè)定[6-7]。相比需要使用大量小鼠、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)操作人員技術(shù)要求高、檢測(cè)方法變異性大的NIH 體內(nèi)方法，體外方法可以有效減少檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量，具有易操作、方法穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)選擇不同的、具有中和活性的單克隆抗體，建立了多個(gè)檢測(cè)方法（表1）[8-14]，而且與NIH 體內(nèi)方法具有較好的相關(guān)性。但由于所使用的狂犬病病毒株、生產(chǎn)工藝、疫苗類型（人用疫苗或獸用疫苗、是否含有佐劑等）、所使用單克隆抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)存在差異等因素，目前尚未有統(tǒng)一的檢測(cè)方法可用于所有毒種生產(chǎn)的狂犬病疫苗抗原性檢測(cè)。

表1 已報(bào)道的狂犬病疫苗抗原性檢測(cè)方法

中檢院團(tuán)隊(duì)制備了大量的中和抗體，通過(guò)對(duì)狂犬病病毒的疫苗株和90 多個(gè)街毒的假病毒進(jìn)行檢測(cè)，篩選出4 個(gè)廣譜性好的單抗（06-2A12、07-4D8-1C1、05-2F10、14-4E8-1E3）。這4 個(gè)單抗不僅能夠中和各疫苗株，而且中和滴度高。通過(guò)方法的系列篩選和優(yōu)化，選取 07-4D8-1C1 和06-2A12 作為包被單抗，05-2F10-HRP 作為標(biāo)記單抗，可以高效檢出7 個(gè)廠家的疫苗株，且對(duì)7 個(gè)廠家疫苗的檢測(cè)靈敏度高，適用于所有疫苗株制備的疫苗。該方法對(duì)其他人用疫苗和輔料成分無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的專屬性。

2 疫苗免疫原性檢測(cè)

免疫原性也是疫苗有效性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[15]。對(duì)疫苗免疫原性的檢測(cè)通常是選擇合適的動(dòng)物模型，待完成疫苗免疫后，檢測(cè)動(dòng)物有效的免疫反應(yīng)。通常在檢測(cè)中和抗體的基礎(chǔ)上，可通過(guò)計(jì)算誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的半數(shù)有效量（ED50）、抗體滴度和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)等指標(biāo)進(jìn)行判定。傳統(tǒng)的中和抗體檢測(cè)方法如空斑減少中和試驗(yàn)（plague reduction neutralization test，PRNT）和細(xì)胞病變法（cytopathic effect，CPE）等都是建立在活病毒的基礎(chǔ)上?；畈《据^難獲得，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的生物安全等級(jí)要求較高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，對(duì)于操作人員的要求也較為嚴(yán)格，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀存在主觀性。因此，為應(yīng)對(duì)快速檢測(cè)的需求，研究人員建立了使用假病毒的中和抗體檢測(cè)方法，可以有效突破傳統(tǒng)方法的局限性。

假病毒技術(shù)可以模擬病毒的膜結(jié)構(gòu)，可以代替活病毒用于研究和檢測(cè)[16]。使用假病毒對(duì)中和抗體進(jìn)行檢測(cè)的原理在于：假病毒與活病毒有相同膜蛋白，可以有效模擬病毒感染細(xì)胞的過(guò)程；假病毒含有報(bào)告基因，可以有效檢測(cè)、示蹤中和抗體。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，使用假病毒進(jìn)行中和抗體檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①容易獲?。嚎稍趯?shí)驗(yàn)室內(nèi)合成基因、構(gòu)建病毒，避免了長(zhǎng)途轉(zhuǎn)運(yùn)病毒過(guò)程中存在的風(fēng)險(xiǎn)。②無(wú)需培養(yǎng)：可以通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，制備病毒。③安全性高：?jiǎn)屋喐腥究梢栽谏锇踩?jí)（BSL-2）條件下進(jìn)行。④周期短：通?？稍?4～72小時(shí)內(nèi)完成，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。⑤定量客觀：因其含有報(bào)告基因，可以對(duì)中和抗體進(jìn)行客觀定量[17]。

在建立使用假病毒對(duì)中和抗體進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，中檢院團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)胞敏感性、細(xì)胞量、病毒加入量、檢測(cè)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化研究；對(duì)分析檢測(cè)方法的專屬性、準(zhǔn)確性、耐用性和重復(fù)性等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行了驗(yàn)證。而且，為進(jìn)一步確認(rèn)方法的適用性，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果顯示基于假病毒的中和抗體檢測(cè)方法穩(wěn)定、可行，與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有很好的相關(guān)性[18]。

在此基礎(chǔ)上，中檢院團(tuán)隊(duì)建立了多型別病毒抗體自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多種病毒進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)機(jī)械臂，可進(jìn)行掃碼、開(kāi)蓋、樣品稀釋、自動(dòng)培養(yǎng)和檢測(cè)，可有效降低檢測(cè)成本、提高通量，進(jìn)一步提升檢測(cè)效率[19]。

體內(nèi)效價(jià)檢測(cè)通常需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且檢測(cè)方法的耐用性和重復(fù)性差[20]。相比體內(nèi)檢測(cè)，體外檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便性。近年來(lái)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)和疫苗生產(chǎn)企業(yè)在疫苗有效性評(píng)價(jià)指標(biāo)設(shè)置中均傾向于使用體外檢測(cè)方法。WHO 發(fā)布的非臨床[21]、批放行[22]等技術(shù)指導(dǎo)原則中均明確鼓勵(lì)使用3R 原則（替換、減少、優(yōu)化）；歐盟在2010年以立法的形式將3R 原則納入歐盟指令2010/63/EU[23]；美國(guó)和歐盟藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受對(duì)采用病毒樣顆粒制備的乙肝疫苗和HPV 疫苗開(kāi)展體外效力試驗(yàn)[20]；在新冠疫情期間，美國(guó)和歐盟對(duì)進(jìn)行體外效力試驗(yàn)的新冠mRNA 疫苗和病毒載體疫苗進(jìn)行了批產(chǎn)品放行[20]。我國(guó)同樣鼓勵(lì)使用體外方法，《中國(guó)藥典》（2020年版）規(guī)定：“應(yīng)盡可能采用準(zhǔn)確的理化分析方法或體外生物學(xué)方法取代動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行生物制品質(zhì)量檢定，以減少動(dòng)物的使用?！钡褂皿w外檢測(cè)方法需要進(jìn)行充分驗(yàn)證。

3 動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)效果的評(píng)價(jià)

動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)是疫苗研發(fā)中的必經(jīng)階段，只有在動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)中證明有效，才能進(jìn)入后續(xù)臨床試驗(yàn)。在動(dòng)物體內(nèi)開(kāi)展保護(hù)效果評(píng)價(jià)的關(guān)鍵在于是否有對(duì)病原易感的動(dòng)物模型，在進(jìn)行疫苗接種后是否能產(chǎn)生和人體相同或相近的免疫應(yīng)答。在構(gòu)建易感動(dòng)物模型時(shí)，通常需要采用基因編輯技術(shù)對(duì)特定的基因進(jìn)行改造，耗時(shí)長(zhǎng)、難度大。除此之外，另一瓶頸在于缺乏動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)效果與免疫反應(yīng)相關(guān)性的數(shù)據(jù)。本文將從以下3 個(gè)方面對(duì)開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)效果評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型構(gòu)建策略進(jìn)行探討。

3.1 對(duì)有明確病毒受體的基因修飾動(dòng)物的研發(fā)

有些病毒通過(guò)特定受體對(duì)人體進(jìn)行感染，然而諸如廣泛用于動(dòng)物研究的小鼠與人的受體存在差異，導(dǎo)致小鼠對(duì)于部分病毒并不易感。對(duì)于有明確病毒受體，人-鼠受體分子存在差異的病毒，通過(guò)基因修飾技術(shù)，將人的受體定點(diǎn)插入小鼠體內(nèi)或進(jìn)行置換，使得小鼠可以表達(dá)人的受體分子，從而變得對(duì)病原易感。目前，中檢院團(tuán)隊(duì)已成功構(gòu)建了表達(dá)腸道病毒71 型（EV71）[24]、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）[25]、新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[26]、脊 髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒等受體分子的小鼠模型。

本文將以EV71 為例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。在EV71 疫苗的研究開(kāi)發(fā)過(guò)程中，雖然相關(guān)單位建立了EV71 感染的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型和乳鼠模型，但使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型成本高、有倫理學(xué)限制，乳鼠模型對(duì)年齡要求較高，穩(wěn)定性差[24,27]。鑒于hSCARB2是人類體內(nèi)體外感染EV71 的關(guān)鍵受體[28]，中檢院團(tuán)隊(duì)利用胚胎干細(xì)胞靶向技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)hSCARB2 受體純C57BL/6 基因背景的敲入小鼠模型（以下簡(jiǎn)稱hSCARB2 小鼠）。在完成模型構(gòu)建后，對(duì)hSCARB2 小鼠模型進(jìn)行了感染驗(yàn)證。通過(guò)Q-PCR檢測(cè)小鼠感染后EV71 的分布，在后肢、口、腦、心臟、肺、肌肉等組織或器官中均檢測(cè)到病毒分布。借助增強(qiáng)綠色熒光蛋白和生物膜干涉技術(shù)，呈現(xiàn)了可視化的小鼠“手足口”模型，并發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)與熒光值具有明顯相關(guān)性，可作為判定是否感染的有效證據(jù)。感染后小鼠體重下降，感染后腦、后肢發(fā)生病理改變，并通過(guò)免疫組化檢測(cè)到病毒[24]。

隨后，采用 hSCARB2 小鼠對(duì)EV71 中和抗體的體內(nèi)保護(hù)效果進(jìn)行了檢測(cè)，建立了中和抗體和保護(hù)效力間的量效關(guān)系。接著，用完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)的EV71 疫苗對(duì)該系統(tǒng)評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)效果的能力進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證明：hSCARB2 小鼠模型能夠很好地評(píng)價(jià)EV71 疫苗的有效性，并初步建立有效性與抗體水平之間的關(guān)系[24]。

在以上研究的基礎(chǔ)上，采用顱內(nèi)及尾靜脈攻毒兩種方式，均觀察到EV71 疫苗能抵御致死性病毒攻擊，并且能觀察到接種疫苗后，小鼠腦、肌肉及肺中病毒載量顯著下降，建立了EV71 疫苗體內(nèi)效力的直接評(píng)價(jià)方法[28]。

綜上，hSCARB2 小鼠模型對(duì)于EV71 病毒株具有良好的易感性，可有效模擬人體感染EV71 后產(chǎn)生的臨床特征。運(yùn)用hSCARB2 小鼠模型進(jìn)行疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)，簡(jiǎn)單便捷、重復(fù)性強(qiáng)，能有效評(píng)估EV71 疫苗的保護(hù)效果，可作為有效的疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

3.2 免疫缺陷類基因修飾動(dòng)物的研發(fā)

有些病毒的受體不明確，無(wú)法對(duì)小鼠等動(dòng)物進(jìn)行基因修飾。但通過(guò)部分免疫缺陷可以使病毒敏感，如敲除特定基因，使T/B/NK 細(xì)胞缺陷，或敲除干擾素（interferon，IFN）或其他信號(hào)通路的基因。中檢院團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Rag1、Rag2、IFNRα/β、IFNRγ、IFNRαβ/γ、STAT1、STAT2、Sting 敲除的大、小鼠模型，可用于針對(duì)肺炎病毒、寨卡病毒、人類嗜T 淋巴細(xì)胞病毒-1（HTLV-1）和基孔肯亞病毒等病毒的研究。值得一提的是，敲除干擾素信號(hào)通路小鼠模型可支持30 多種病毒的感染，幾乎為開(kāi)展疫苗、抗體評(píng)價(jià)研究工作中的萬(wàn)能模型。但這類小鼠畢竟存在免疫缺陷，能否客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)疫苗的有效性還有待進(jìn)一步的評(píng)估。

3.3 假病毒感染動(dòng)物模型的建立

利用假病毒的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，選擇使用高滴度的假病毒、采用不同的接種方式（如腹腔注射、胸腔注射、靜脈注射等），先后構(gòu)建了針對(duì)埃博拉病毒、馬爾堡病毒、H7N9 禽流感病毒等系列病毒的小鼠模型。在用該體系對(duì)疫苗有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，如果產(chǎn)生保護(hù)效果，假病毒會(huì)被中和抗體所中和，從而阻止假病毒感染小鼠組織。假病毒采用發(fā)光標(biāo)記，使用活體成像系統(tǒng)可直觀顯示病毒感染的強(qiáng)弱變化，從而能對(duì)疫苗效力進(jìn)行直觀、可定量的評(píng)價(jià)[16]。通過(guò)建立假病毒感染動(dòng)物模型，不僅可以避免活病毒的使用，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，還可以更加直觀地檢測(cè)，對(duì)疫苗候選抗原的篩選提供了很大的便捷性。

4 人體保護(hù)效果的評(píng)價(jià)

雖然可以通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)的保護(hù)效果來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的有效性，但不可否認(rèn)的是動(dòng)物模型有時(shí)無(wú)法預(yù)測(cè)疫苗在人體內(nèi)的免疫原性和有效性[21]。因此，在真實(shí)世界中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，對(duì)于評(píng)價(jià)疫苗的有效性顯得尤為重要。不同疫苗的臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不一，通常有預(yù)防感染、減少發(fā)病和降低重癥等，但無(wú)論哪一種評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，其最終結(jié)果都在于證明疫苗的保護(hù)效果，并進(jìn)一步尋找保護(hù)效果與免疫指標(biāo)間的相互關(guān)系。

通常來(lái)說(shuō)，疫苗在上市前需要經(jīng)過(guò)Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)。有效性則是在大規(guī)模目標(biāo)人群的III 期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。本文將從疫苗保護(hù)效力和免疫學(xué)替代終點(diǎn)2 個(gè)方面進(jìn)行討論。

4.1 疫苗保護(hù)效力

疫苗保護(hù)效力（vaccine efficacy，VE）是指與安慰劑組相比，疫苗接種組疾病或感染減少的比例[29]。具體的計(jì)算公式為：疫苗保護(hù)效力=（一定觀察期內(nèi)安慰劑組感染率-疫苗組感染率）/安慰劑組感染率。通常在對(duì)照臨床試驗(yàn)中對(duì)疫苗保護(hù)效力進(jìn)行衡量，即通過(guò)比較疫苗組與安慰劑組的數(shù)據(jù)，看有多少人出現(xiàn)了“關(guān)注的結(jié)局（通常為感染或發(fā)?。?。如果一種疫苗效力很高，那么疫苗組中患病的人數(shù)會(huì)比安慰劑組少得多。此外，疫苗保護(hù)效力還可以通過(guò)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)（relative risk，RR）進(jìn)行計(jì)算[30]。

通過(guò)臨床試驗(yàn)對(duì)疫苗的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)是最理想的狀況，比如創(chuàng)新型疫苗、缺乏免疫原性替代終點(diǎn)或免疫原性替代終點(diǎn)不明確的疫苗。但開(kāi)展臨床試驗(yàn)需要對(duì)流行病學(xué)情況和疾病的發(fā)生率進(jìn)行充分考量。如果發(fā)病率太低，樣本量不足，不利于病例收集，臨床試驗(yàn)將難以開(kāi)展。例如，宮頸癌發(fā)病需要10 多年的時(shí)間，短期內(nèi)基本不可能發(fā)生感染后致癌的情況。若從接種HPV 疫苗開(kāi)始一直觀察到宮頸癌發(fā)生，這樣的臨床設(shè)計(jì)難以滿足疫苗研發(fā)的需求。還有一些疫苗，對(duì)應(yīng)疾病的發(fā)病率低，很難在有限的時(shí)間里收集有效病例，從而限制了對(duì)疫苗有效性評(píng)估的進(jìn)程。

4.2 免疫學(xué)替代終點(diǎn)

免疫學(xué)替代終點(diǎn)（surrogate of protection，SOP）的概念由WHO 提出，其定義為：由疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的，與接種疫苗后臨床終點(diǎn)事件（感染或發(fā)病）的發(fā)生相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)疫苗保護(hù)效果的免疫學(xué)反應(yīng)指標(biāo)（體液免疫或細(xì)胞免疫）。在以免疫學(xué)指標(biāo)為終點(diǎn)的臨床試驗(yàn)中，可以直接應(yīng)用已建立的免疫學(xué)替代終點(diǎn)，分析比較試驗(yàn)疫苗組和對(duì)照疫苗組的保護(hù)率，即計(jì)算免疫學(xué)反應(yīng)水平大于或等于免疫學(xué)替代終點(diǎn)水平受試者的百分比，以評(píng)價(jià)2 種疫苗保護(hù)效力的差異[31]。

經(jīng)過(guò)多年研究，對(duì)于部分疫苗有了深入的了解，明確了保護(hù)性免疫指標(biāo)與臨床終點(diǎn)的關(guān)系、免疫原性和臨床保護(hù)效力的相關(guān)性。這類疫苗含有相同抗原成分，往往不止一個(gè)生產(chǎn)廠家，在真實(shí)世界中得到了廣泛運(yùn)用，因此可以采用選擇免疫學(xué)替代終點(diǎn)，采用可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)疫苗的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)[31]。

在臨床研究過(guò)程中，達(dá)到免疫學(xué)替代終點(diǎn)的疫苗可產(chǎn)生最低保護(hù)水平，在一定程度上能證明疫苗的有效性。使用免疫學(xué)替代終點(diǎn)的臨床試驗(yàn)可以有效減少試驗(yàn)所需的樣本量，縮短隨訪時(shí)間，降低臨床試驗(yàn)的費(fèi)用，在一定程度上可以有效地推動(dòng)疫苗的研發(fā)進(jìn)程。但對(duì)于已建立免疫學(xué)替代終點(diǎn)的疫苗，仍需要在真實(shí)世界中進(jìn)行持續(xù)觀察，必要時(shí)甚至需要做出修正，確保其持續(xù)有效。

5 結(jié)語(yǔ)

有效性是疫苗很重要的技術(shù)指標(biāo)，貫穿疫苗的全生命周期。無(wú)論是早期研發(fā)過(guò)程中對(duì)于抗原含量或體外效價(jià)的測(cè)定，在動(dòng)物體內(nèi)開(kāi)展的體內(nèi)效價(jià)測(cè)定、保護(hù)效果評(píng)價(jià)，臨床試驗(yàn)，還是上市后的使用，都需要對(duì)疫苗有效性給予高度關(guān)注。目前，疫苗有效性檢測(cè)和評(píng)價(jià)仍然存在一些瓶頸，在具體開(kāi)展研究工作的時(shí)候需要根據(jù)不同疫苗的特性，具體問(wèn)題具體分析，在開(kāi)展充分研究的基礎(chǔ)上確定出具體的檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行充分驗(yàn)證，保障檢測(cè)方法客觀、準(zhǔn)確。