李 睿，方躍華，林雨虹

（1.福州市第一醫(yī)院皮膚科；2.福州市第一醫(yī)院檢驗科，福建 福州 350000）

痤瘡是一種累及面部毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病。痤瘡好發(fā)于青春期，中國人群截面統(tǒng)計痤瘡發(fā)病率為8.1%[1]，是常見的皮膚疾病。痤瘡的發(fā)病機制與雄激素刺激皮脂腺分泌旺盛、痤瘡丙酸桿菌等微生物感染，免疫介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[2]。痤瘡的治療有外用藥物治療、系統(tǒng)藥物治療、物理和化學(xué)治療、中醫(yī)和中藥治療等，其中外用藥物是基礎(chǔ)治療。目前痤瘡的外用藥物治療主要有維A酸類乳膏，外用抗菌藥物類以及水楊酸等其他外用藥物。外用維A酸類藥物以及抗菌藥物中的過氧化苯甲酰有不同程度的皮膚刺激，可以造成皮膚屏障功能受損?？咕幬镏械目股赝庥萌菀滓痧畀彵釛U菌耐藥[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從綠茶中提取的一種多酚類成分，是綠茶兒茶素中含量最高的組分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗輻射和紫外線等作用[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)EGCG還具有抑制細(xì)菌繁殖、抑制皮脂腺細(xì)胞生長和分泌、抗炎等作用[4-7]，這些作用與痤瘡發(fā)病機制相關(guān)，因此EGCG對于治療痤瘡，可能有效果。但是，因為皮膚屏障的保護(hù)和吸收作用，外用藥物發(fā)揮作用必須要有合適的劑型使之有一定程度的透皮滲透。透皮吸收因子TAF是一種新型的透皮技術(shù)，該技術(shù)通過臭氧促透，剪切、包衣等步驟，使活性成分能透過皮膚屏障。

因現(xiàn)有痤瘡?fù)庥盟幬锏木窒扌?，研究開發(fā)有效、安全副作用小的新型外用藥物存在臨床需求。本研究利用新型的TAF透皮生物技術(shù)對EGCG進(jìn)行處理，形成新劑型EGCG，即氫氧包衣EGCG，我們通過研究其對痤瘡形成機制相關(guān)方面的影響，探索痤瘡?fù)庥盟幬镏委煹男路椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

12周齡雄性新西蘭大白兔，體重2.5-3kg（贛州市畜牧水產(chǎn)研究所），98%EGCG（西安東峰生物科技有限公司），痤瘡丙酸桿菌（BNCC336649，北納生物），0.025%維A酸乳膏（重慶華邦制藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 利用TAF技術(shù)（江蘇朗沁科技有限公司）對98%EGCG進(jìn)行氫氧包衣，形成包衣EGCG。

1.2.2 活化痤瘡丙酸桿菌。稱取BHI腦心浸液肉湯取19.25g，加蒸餾水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min，取出冷卻至室溫備用；0.1‰維生素和0.1‰氯化血紅素通過0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到冷卻的BHI腦心浸液肉湯中，再存放至4℃冰箱備用。取50mL BHI培養(yǎng)基，按1% (v/v)接種比例來滴加500μL痤瘡丙酸桿菌濃縮菌液進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

1.2.3 建立兔耳痤瘡模型。選取24只12周齡雄性新西蘭大白兔，飼養(yǎng)于溫度18℃-26℃，濕度40%-70%條件下。在經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，對兔子左耳內(nèi)耳構(gòu)建兔耳痤瘡模型。在兔子左耳內(nèi)耳中央附近涂抹2%粗煤焦油，0.5ml，范圍為2×2-4×4CM2。連續(xù)兩周，從給煤焦油第7天起，隔天皮內(nèi)多點（6點）注射0.2ml痤瘡丙酸桿菌溶液（3×108/ml）于兔耳涂煤焦油處，共4次進(jìn)行動物模型構(gòu)建。

1.2.4 為了探究包衣EGCG治療兔耳痤瘡的關(guān)系，將動物分為Control、Model、維A酸乳膏組（建模第一天起同時涂抹維A酸乳膏5mg/kg/d，共14天）、包衣EGCG（建模第一天起同時涂抹包衣EGCG，20mg/只/天，共14天）。

1.2.5 HE染色。切取各組實驗區(qū)域皮膚組織，制作石蠟切片，石蠟切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素染液染色3min-5min，流水沖洗后，用1%鹽酸酒精分化，反藍(lán)液反藍(lán)，伊紅染色3min-5min后，切片脫水，封片，在顯微鏡（BX43，Olympus）下觀察組織病理變化情況。

1.2.6 RT-qPCR檢測。采用Trizon試劑提取皮膚組織中的總RNA，采用RNA超純提取試劑盒提取mRNA，利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純度（OD260/OD280），通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性95℃，10min；變性95℃，10s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，基因的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計算。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用（)表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

如圖1結(jié)果顯示，Control組兔耳柔軟、薄白、毛細(xì)血管清晰，兔耳管開口處可見毛孔大小均勻，皮膚組織完整。Model組皮膚表皮明顯角化增厚、棘層細(xì)胞層數(shù)增多、毛囊擴張、毛囊面積增大。維A酸乳膏治療組和包衣EGCG組治療后表皮均出現(xiàn)角化厚度減小、棘層細(xì)胞層數(shù)均減少，毛囊擴張程度減輕，毛囊面積減小。

圖1 （HE染色，200×）

2.2 RT-qPCR檢測

如圖2結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組IL-1a、IL-8、IL-6促炎因子顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Model組相比，維A酸乳膏組、包衣EGCG組治療后IL-1a、IL-8、IL-6炎癥因子均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 qPCR檢測IL-1a、IL-6、IL-8、NF-κB基因表達(dá)水平

3 討論

綠茶是一種具有中國特色的食品，也受到世界上其他國家和地區(qū)的人們的喜愛。不僅飲用綠茶的養(yǎng)生功能被不斷地發(fā)現(xiàn)與開發(fā)，綠茶提取物還是世界范圍內(nèi)極受歡迎的護(hù)膚品的添加成分。茶多酚是從茶葉中提取的一類多酚類的物質(zhì)，其中兒茶素的占比最高，兒茶素主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）表沒食子兒茶素（EGC）表兒茶素沒食子酸酯（ECG）表兒茶素（EC）[8]。其中EGCG含量最高，具有較強、較多的生物活性。針對痤瘡的發(fā)病機制，EGCG在抑制皮脂分泌方面，可以通過活化MAPK通路，激活Nrf2通路及下游基因，達(dá)到抑菌、抗炎及抑制皮脂分泌的作用，并且可以減少自噬抑制因子mTORC的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而抑制皮脂分泌[9]。EGCG的抗炎機制，一方面與其的抗氧化作用相關(guān)，EGCG可以通過清除自由基和氧化劑，抑制氧化應(yīng)激性，減輕氧化劑介導(dǎo)的損傷；通過抗氧化及阻礙細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流動抑制MCP-1的高表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT1的激活。除此之外，EGCG還可以干預(yù)NF-κB信號通路、抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB從而發(fā)揮抗炎作用[10-11]。

雖然EGCG在體外有諸多的活性和作用，但是臨床使用卻受限，主要原因是EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，容易受到各種環(huán)境及理化因素的影響，因此，EGCG在體內(nèi)分解快，生物利用度較低。在外用于皮膚的治療應(yīng)用中，又因為EGCG具有較高的水溶性，導(dǎo)致它在皮膚的滲透性差[12]。因此，如何提高EGCG的穩(wěn)定性和生物利用度是近來研究的熱點。在外用藥品或化妝品中，為了使活性成分更好地發(fā)揮作用，通常會使用促透劑，促進(jìn)有效成分的透皮。經(jīng)過對促滲劑的深入研究，大多數(shù)促滲劑都表現(xiàn)出不同程度的局部或全身毒性。隨著透皮技術(shù)的進(jìn)展，出現(xiàn)了新的劑型如脂質(zhì)體、微乳、納米粒等[13]。TAF技術(shù)也是一種新型的透皮吸收技術(shù)，該技術(shù)可以可逆的改變皮膚屏障脂質(zhì)的排列構(gòu)型，擴大細(xì)胞間隙，使細(xì)胞間的透過能力增大，并能改變分配系數(shù)，增加細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運，使被包衣成分深入皮膚表皮層，真皮層至皮下組織，克服了水溶性成分透皮吸收差的缺點。而本次研究的結(jié)果也呈現(xiàn)了經(jīng)過TAF技術(shù)進(jìn)行氫氧包衣后的EGCG對于兔耳痤瘡模型的治療效果與0.025%維A酸乳膏相當(dāng)，為EGCG治療痤瘡提供了新的思路。對于氫氧包衣的EGCG是否能用于臨床上痤瘡的治療，還需要更多方面，更加深入，更大樣本的研究。