鄒勇 徐亞寧 劉波 莊紅 尹俊 張?zhí)K川

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430016)

心肌成纖維細(xì)胞(CFs)是心臟的主要細(xì)胞類(lèi)型，在心肌纖維化中起主要作用。在正常情況下，纖維細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在持續(xù)性高血壓或系統(tǒng)性血管緊張素(Ang)Ⅱ慢性升高等應(yīng)激條件下纖維細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，其增殖、遷移、積極參與合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致心肌纖維化和收縮功能障礙〔1，2〕。因此，降低CFs的增殖和遷移能力可能是治療心肌纖維化的潛在策略。金蓮花總黃酮為毛茛科金蓮花屬的植物金蓮花的主要活性成分之一，具有清熱解毒、抗菌消炎等藥用功能，廣泛用于咽炎、扁桃體炎、上呼吸道感染治療。近年研究顯示，金蓮花總黃酮可能通過(guò)抗氧化、抗凋亡機(jī)制對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用〔3〕。miR-215-5p是一種纖維化相關(guān)非編碼RNA，研究顯示隨著炎癥活動(dòng)程度和纖維化程度的增加，慢性乙肝肝損傷患者血漿中miR-215-5p表達(dá)顯著降低，是潛在的肝損傷標(biāo)志物〔4〕。本研究通過(guò)觀察金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖、遷移及miR-215-5p表達(dá)的影響，探討其潛在分子機(jī)制，旨在為金蓮花總黃酮用于防治心肌纖維化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 大鼠CFs購(gòu)于上海博湖生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；金蓮花總黃酮(純度為98%)由江漢大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制劑室提供；Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒、miRNA universal master mix、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；胰蛋白酶、AngⅡ購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞技術(shù)試劑盒(CCK-8)、放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所；miRNA模擬物(miRNA mimics)、模擬物對(duì)照(miR-NC)、miRNA抑制物、抑制物對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)于廣州銳博生物技術(shù)公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)康寧公司；兔源Ki67抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2抗體、兔源MMP9抗體、兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)抗體和兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體、兔源β-actin抗體、羊抗兔IgG購(gòu)于上海賽信通公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 大鼠CFs采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于飽和濕度、5% CO2和37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)85%以上時(shí)，加胰蛋白酶消化傳代，收集第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取2×105個(gè)對(duì)數(shù)期CFs接種6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%時(shí)，更換為血清培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-NC、miR-215-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-215-5p分別轉(zhuǎn)染CFs，轉(zhuǎn)染6 h后，更換為換血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組和處理 取2×104個(gè)CFs接種24孔板。未轉(zhuǎn)染CFs分為正常對(duì)照(NC)組、AngⅡ組、0.2、0.4、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組。NC組為正常培養(yǎng)的CFs；AngⅡ組使用AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)〔5〕；0.2、0.4、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮組分別使用金蓮花總黃酮終濃度為0.2、0.4、0.8 mmol/L和AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-215-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-215-5p的CFs用AngⅡ終濃度為10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次記為miR-NC+AngⅡ組、miR-215-5p+AngⅡ組、anti-miR-NC+AngⅡ組、anti-miR-215-5p+AngⅡ組。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-215-5p mimics的CFs用含0.8 mmol/L金蓮花總黃酮和10-7mol/L AngⅡ的培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次命名為金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組。培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，孵育48 h后，將10 μl的CCK-8溶液加入96孔板各孔內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2.5 h?？瞻卓渍{(diào)零后，酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)量每孔的光密度(OD)值。

1.2.4Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移 取600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基添加到24孔板下室。取200 μl細(xì)胞數(shù)約為5×104個(gè)的細(xì)胞懸液添加到Transwell上腔室。置于37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。無(wú)菌濕棉簽擦去Transwell膜上表明未遷移細(xì)胞，分別用70%乙醇、0.1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行Transwell膜下表面進(jìn)行固定和染色。顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況、以3個(gè)視野細(xì)胞數(shù)均值表示遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5Western印跡檢測(cè)Ki67、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT表達(dá)水平 RIPA緩沖液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后煮沸5 min變性。配置濃縮膠、分離膠，每泳道加入30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時(shí)，停止電泳利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將已分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將膜置于5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h。用稀釋的一抗溶液室溫孵育膜2 h。用稀釋的二抗溶液室溫孵育膜1 h。加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-215-5p表達(dá)水平 Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板利用miRNA universal master mix進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 10 s，退火延伸60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析miR-215-5p相對(duì)表達(dá)水平。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，AngⅡ組CFs細(xì)胞活力、Ki67蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AngⅡ組比較，0.2 mmol/L 金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.4 μmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.8 μmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細(xì)胞活力、Ki67蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

1～5：NC組、AngⅡ組、0.2 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.4 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組、0.8 mmol/L金蓮花總黃酮+AngⅡ組圖1 Western印跡檢測(cè)Ki67蛋白的表達(dá)

表1 不同濃度金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞 增殖的影響

2.2金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞遷移的影響 與NC組比較，AngⅡ組CFs細(xì)胞遷移數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細(xì)胞遷移數(shù)量、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞遷移的 影響

圖2 金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.3金蓮花總黃酮對(duì)miR-215-5p表達(dá)的影響 與NC組(1.00±0.09)比較，AngⅡ組CFs細(xì)胞miR-215-5p表達(dá)顯著升高(4.37±0.37，P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細(xì)胞miR-215-5p表達(dá)顯著降低(1.82±0.12，F(xiàn)=523.169，P=0.000)。

2.4miR-215-5p對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞增殖和遷移的影響 與miR-NC+AngⅡ組比較，miR-215-5p+AngⅡ組CFs細(xì)胞miR-215-5p、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+AngⅡ組比較，anti-miR-215-5p+AngⅡ組CFs細(xì)胞miR-215-5p、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

1～4：miR-NC+AngⅡ組、miR-215-5p+AngⅡ組、anti-miR-NC+AngⅡ組、anti-miR-215-5p+AngⅡ組圖3 Western印跡檢測(cè)Ki67、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)

表3 miR-215-5p對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞增殖和遷移的影響

2.5miR-215-5p可以逆轉(zhuǎn)金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞增殖和遷移的影響 與金蓮花總黃酮+AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組CFs細(xì)胞miR-215-5p的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、Ki67、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖4。

表4 miR-215-5p可以逆轉(zhuǎn)金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ處理的CFs細(xì)胞增殖和遷移的影響

1～3：金蓮花總黃酮+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組圖4 Western印跡檢測(cè)Ki67、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

2.6PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況 與NC組比較，AngⅡ組CFs細(xì)胞p-PI3K和p-AKT水平顯著升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+AngⅡ組CFs細(xì)胞p-PI3K和p-AKT水平顯著降低(P<0.05)；與金蓮花總黃酮+AngⅡ組比較，金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組CFs細(xì)胞p-PI3K和p-AKT水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表5。

1～5：NC組、AngⅡ組、金蓮花總黃酮+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-NC+AngⅡ組、金蓮花總黃酮+miR-215-5p+AngⅡ組圖5 Western印跡檢測(cè)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)

表5 PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

金蓮花總黃酮是從金蓮花中提取的黃酮類(lèi)化合物的總稱(chēng)，具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤作用〔6，7〕。然而，其在心肌纖維化中的作用有待闡明。既往研究顯示，AngⅡ通過(guò)激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路促進(jìn)CFs增殖和遷移，在心肌纖維化發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程中起中心作用〔8，9〕。因此本研究使用AngⅡ刺激心肌細(xì)胞模擬心肌纖維化進(jìn)程，探索金蓮花總黃酮對(duì)CFs增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)CFs后，細(xì)胞活力、Ki67蛋白表達(dá)顯著降低，而金蓮花總黃酮呈劑量依賴(lài)性降低AngⅡ?qū)Fs的促增殖作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，金蓮花總黃酮還可降低AngⅡ?qū)Fs的促遷移作用，降低促遷移蛋白MMP2和MMP9的表達(dá)水平。以上數(shù)據(jù)表明，金蓮花總黃酮可能通過(guò)抑制CFs增殖和遷移進(jìn)而減輕心肌纖維化。

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性多功能非編碼RNA，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲在包括心臟纖維化在內(nèi)的心血管疾病中發(fā)揮重要作用〔10〕。研究顯示，硒缺乏導(dǎo)致的miR-215-5p表達(dá)增加可能導(dǎo)致心肌基因轉(zhuǎn)錄紊亂、線粒體生物合成失衡，影響心肌發(fā)育及分化〔11〕。抑制miR-215-5p通過(guò)抑制活性氧(ROS)依賴(lài)性絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，激活心肌細(xì)胞中的PI3K/AKT通路對(duì)抗自噬增強(qiáng)細(xì)胞的生存能力〔12〕。此外，下調(diào)miR-215-5p表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞IMR-90增殖具有抑制作用，抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化〔13〕。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-215-5p mimics上調(diào)miR-215-5p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，次誘導(dǎo)CFs活力、遷移能力、Ki67、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著升高，而下調(diào)miR-215-5p則顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)對(duì)CFs的增殖和遷移促進(jìn)作用，提示下調(diào)miR-215-5p表達(dá)具有潛在抑制心肌纖維化作用。進(jìn)一步研究顯示，AngⅡ可升高CFs中miR-215-5p表達(dá)水平，而金蓮花總黃酮?jiǎng)t減輕AngⅡ?qū)iR-215-5p表達(dá)的促進(jìn)作用，提示金蓮花總黃酮可能通過(guò)下調(diào)miR-215-5p表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗CFs增殖和遷移作用。后續(xù)研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-215-5p能夠逆轉(zhuǎn)金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和遷移的影響，這進(jìn)一步說(shuō)明金蓮花總黃酮可能通過(guò)下調(diào)miR-215-5p表達(dá)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和遷移。

PI3K/AKT信號(hào)通路是體內(nèi)一條重要的調(diào)控通路，具有調(diào)控細(xì)胞在增殖、遷移、分化和血管生成等多種功能，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)大鼠CFs的增殖、遷移具有顯著的抑制作用〔14，15〕。本研究顯示，金蓮花總黃酮可降低AngⅡ誘導(dǎo)的CFs中PI3K和AKT的磷酸化水平，而下調(diào)miR-215-5p表達(dá)可降低金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFs中PI3K和AKT的磷酸化的影響，說(shuō)明金蓮花總黃酮對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFs的抗增殖、遷移作用可能與下調(diào)miR-215-5p和抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，金蓮花總黃酮能夠降低AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和遷移，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-215-5p表達(dá)和抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，這為金蓮花總黃酮用于防治心肌纖維化提供了理論支持。