莊憲麗 張瑩 楊家干 楊延振
(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬滕州市中心人民醫(yī)院眼科,山東 滕州 277500)
糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,是否會(huì)發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變?nèi)Q于患者血壓、血糖、血脂的控制情況及患病時(shí)間的長(zhǎng)短〔1,2〕?;加刑悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的患者會(huì)出現(xiàn)失明、視物模糊及視力下降等臨床表現(xiàn),糖尿病視網(wǎng)膜病變常見的眼部表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微動(dòng)脈形成及點(diǎn)狀出血,如果出現(xiàn)玻璃體積血、黃斑水腫就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視力下降〔3〕?;颊呖梢酝ㄟ^控制血壓、血糖等減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程,通過聯(lián)合玻璃體腔藥物注射的方法來減輕黃斑水腫,改善視力。貝伐單抗(Avastin)可通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體(VEGF-VEGFR)的表達(dá),進(jìn)而改善視力〔4〕。目前關(guān)于Avastin用于糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠缺乏相關(guān)資料數(shù)據(jù)。本研究基于VEGF-VEGFR通路探究Avastin對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果。
1.1研究動(dòng)物 選取75只SPF級(jí)大鼠,由冠科生物技術(shù)(中山)有限公司提供〔動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2020-0240〕,鼠齡3~6個(gè)月,平均(4.27±1.43)個(gè)月,體重227~268 g,平均體質(zhì)量(235.12±19.48)g,將大鼠放置室溫23~25℃,濕度40%~70%,自然光照、通風(fēng)的無病原菌干凈籠子中飼養(yǎng),飲用的水和食物均經(jīng)消毒。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司;VEGF抗體購(gòu)于江西江藍(lán)純生物試劑有限公司;VEGFR-2抗體購(gòu)于廈門侖昌碩生物科技有限公司;β-actin抗體購(gòu)于上海梵態(tài)生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1建模 在75只大鼠中隨機(jī)選取15只為正常組不做任何處理,其余大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各15只,參照陳向東等〔5〕研究實(shí)驗(yàn)中糖尿病視網(wǎng)膜病變建立方法建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型,除正常組外,其余各組大鼠均按照30 mg/kg腹腔內(nèi)注射枸櫞酸鈉緩沖液誘發(fā)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變,每周1次,持續(xù)2 w,累計(jì)劑量達(dá)到60 mg/kg,正常組給予同法注射等體積生理鹽水。建模成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠視力下降,出現(xiàn)視物模糊癥狀。
1.2.2給藥 低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予Avastin(齊魯制藥有限公司;國(guó)藥準(zhǔn)字H20020535;6.25 mg/ml)灌胃6 w,劑量分別為0.09、1.00、1.25 mg,正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。
1.2.3病理組織學(xué)觀察 在大鼠灌胃后、禁食不禁水12 h,麻醉處死,迅速摘除眼球后立即固定在染色液中,將所制備的大鼠眼球組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后,行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,制備厚度為3 μm的組織切片,取眼球組織石蠟包埋切片,經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色,中性樹膠封片后,顯微鏡下觀察并拍照分析。
1.2.4脂聯(lián)素(ADPN)、瘦素(LP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1水平評(píng)價(jià) 抽取各組大鼠的空腹靜脈血2 ml,離心半徑5 cm平均32 s轉(zhuǎn)速 3 000 r/min進(jìn)行離心處理3 min,分離上層血清,在-4℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆?,采用ELISA檢測(cè)ADPN、LP、SOD、MDA、ICAM-1水平,實(shí)驗(yàn)步驟:設(shè)置10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔并準(zhǔn)備相應(yīng)水平標(biāo)準(zhǔn)品,設(shè)置1個(gè)空白孔及若干待測(cè)樣品在10 μl 待測(cè)樣品中加入40 μl樣本稀釋液,封板膜封板,置于37℃水浴箱溫育30 min,清洗反應(yīng)板5次,每次間隔30 s,拍干,在除空白孔以外的各孔中加入酶標(biāo)液50 μl,封膜溫育30 min,清洗反應(yīng)板5次,每次間隔30 s,拍干,在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光環(huán)境下顯色15 min,在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液50 μl/孔以終止反應(yīng),450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔吸光度,檢測(cè)出ADPN、LP、SOD、MDA、ICAM-1的水平。
1.2.5循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞法檢測(cè)CEC、EPC;抽取清晨空腹靜脈血20 μl,進(jìn)行抗凝處理后分為兩管,其中一管加20 μl CEC單克隆抗體,另一管加入20 μl EPC單克隆抗體,在室溫環(huán)境下孵育30 min后將融血?jiǎng)┘尤胫粮鞴苤校耆苎笮须x心處理,3 000 r/min離心5 min,將上清液棄除后,使用洗滌液洗滌,之后將150 μl固定劑加入至各管中,使用0.6 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混合均勻制備為懸液,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105~1×106/ml,完成之后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(美國(guó)BectonDickinso公司)CEC、EPC水平,并計(jì)算CEC、EPC比值。
1.2.6VEGF-VEGFR信號(hào)通路蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià) 采用Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)步驟:將視網(wǎng)膜組織接種于6孔板中,24 h貼壁后各組進(jìn)行處理,并使用BCA法測(cè)定濃度,制備電泳樣品,上樣量50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入脫脂奶粉封閉1 h,一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜,洗膜5 min/次,共3次,二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,洗膜5 min/次,共3次,取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值,內(nèi)參蛋白為GAPDH。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。
2.1各組病理組織學(xué)觀察 如圖1所示,正常組大鼠內(nèi)外叢狀層呈網(wǎng)狀排列,未有毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血情況;模型組大鼠出現(xiàn)水腫,且結(jié)構(gòu)疏松,內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列紊亂無序,出現(xiàn)充血及擴(kuò)張的毛細(xì)血管;藥物干預(yù)后,低劑量組、中劑量組大鼠內(nèi)外叢狀層腫脹減輕,排列相對(duì)規(guī)整;高劑量組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)基本完整,未見明顯水腫,內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)整,各層未見明顯擴(kuò)張及充血的毛細(xì)血管,內(nèi)叢狀層及外叢狀層腫脹情況減輕,未見新生血管。
2.2各組ADPN、LP、ICAM-1比較 如表1所示,高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組ADPN水平均低于正常組,LP、ICAM-1水平均高于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組、低劑量組ADPN水平高于模型組,LP、ICAM-1水平低于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組ADPN水平高于低劑量組,LP、ICAM-1水平低于低劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組ADPN水平高于中劑量組,LP、ICAM-1水平低于中劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
2.3各組CEC、EPC比較 如表1所示,高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組CEC水平均高于正常組,EPC水平均低于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組、低劑量組CEC水平低于模型組,EPC水平高于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組CEC水平低于低劑量組,EPC水平高于低劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組CEC水平低于中劑量組,EPC水平高于中劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
圖1 各組眼球組織病理組織學(xué)觀察(HE染色,×400)
表1 各組ADPN、LP、ICAM-1、CEC、EPC比較
2.4各組VEGF-VEGFR通路蛋白表達(dá)量比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平均高于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組、低劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于低劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組VEGF、VEGFR-2、β-actin水平低于中劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖2、表2。
2.5各組SOD、MDA比較 如表2所示,高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組SOD水平均低于正常組,MDA水平均低高于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組、低劑量組SOD水平高于模型組,MDA水平低于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組、中劑量組SOD水平高于低劑量組,MDA水平低于低劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);高劑量組SOD水平高于中劑量組,MDA水平低于中劑量組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
圖2 各組VEGF-VEGFR通路蛋白Western印跡
表2 各組SOD、MDA水平及VEGF-VEGFR通路蛋白表達(dá)量比較
糖尿病視網(wǎng)膜病變屬于眼科疾病及內(nèi)分泌疾病的一種,是糖尿病常見并發(fā)癥,是神經(jīng)病變及糖尿病微血管病變?cè)谝暰W(wǎng)膜中的表現(xiàn),是致盲的主要原因之一〔6〕。糖尿病病程越長(zhǎng)誘發(fā)此病的概率就越大,此病的病理改變?yōu)橹芗?xì)胞對(duì)視,導(dǎo)致微動(dòng)脈瘤形成及血視網(wǎng)膜屏障破壞,從而造成的毛細(xì)血管及小動(dòng)脈閉塞〔7〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诘母深A(yù)措施為視網(wǎng)膜激光光凝,一般合并視網(wǎng)膜脫落及玻璃體積血的患者需要進(jìn)行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)進(jìn)行治療,平時(shí)一定要注意血壓及血糖的控制,從而減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程〔8,9〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變患者若未得到及時(shí)治療或治療不佳時(shí),會(huì)導(dǎo)致病情惡化,從而導(dǎo)致視力受損。
Avastin屬于抗VEGF藥物,可以對(duì)新生血管起到很好的抑制作用,可有利于降低血管滲透、黃斑水腫等,此外,有劉巖等〔10〕研究發(fā)現(xiàn),使用Avastin后患者癥狀明顯出現(xiàn)好轉(zhuǎn)且視力明顯上升,進(jìn)一步的證實(shí)了注射Avastin的有效性及安全性,與本文研究結(jié)果一致。采取Avastin治療可以在一定的程度上降低眼底疾病的眼壓,加快視力恢復(fù),有效降低黃斑水腫等并發(fā)癥的發(fā)生率〔11〕。本研究結(jié)果顯示,高劑量Avastin可更好的減少并發(fā)癥的出現(xiàn),促進(jìn)視力恢復(fù),改善糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視力水平。
研究顯示〔12〕,ADPN、LP、ICAM-1與糖尿病視網(wǎng)膜病變存在密切關(guān)聯(lián),且在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨疾病的進(jìn)展過程改變視力變化。其中ADPN屬于脂肪組織,可以存儲(chǔ)脂肪,又有著分泌作用,是胰島素作用的重要靶器官之一,可以參與脂類及糖類的代謝,是胰島素免疫、敏感性、炎癥等過程的重要調(diào)節(jié)因子之一,同時(shí)也是一種特異性血漿蛋白,由脂肪組織分泌,參與糖類代謝具有降血糖的作用。LP可以作為肥胖基因在脂肪的細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物中參與能量消耗及代謝,同時(shí)還可以參與新生血管的生成〔13~15〕。ICAM-1可導(dǎo)致細(xì)胞毒性物質(zhì)及大量細(xì)胞因子的急劇釋放,由此可說明ICAM-1可以導(dǎo)致微血管損傷的加劇,內(nèi)皮修復(fù)功能受到抑制,從而造成大量的新生血管的形成,加重糖尿病視網(wǎng)膜病變〔16~18〕。CEC、EPC、SOD、MDA可作為診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的客觀有效指標(biāo),可參與糖尿病視網(wǎng)膜病變等病理過程的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸〔19〕,提示LP、ADPN及LP、ADPN對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管具有重要的促進(jìn)作用,CEC、EPC、SOD、MDA可作為診斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的客觀有效指標(biāo),以上指標(biāo)的變化有利于判斷糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度。
VEGF-VEGFR通路是經(jīng)典信號(hào)通路之一,其中VEGF、VEGFR-2、β-actin是VEGF-VEGFR通路中的蛋白因子,此信號(hào)通路被證實(shí)在多種疾病中存在表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象,且是一條重要的調(diào)節(jié)通路〔20〕。除此之外還可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原,同時(shí)也是已知最強(qiáng)的血管通透劑,可以提高血管的通透性,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與增殖〔21〕。故在本研究中,高劑量Avastin可能通過抑制VEGF-VEGFR信號(hào)通路,下調(diào)VEGF、VEGFR-2、β-actin表達(dá),緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展,有較好的治療價(jià)值。
綜上,Avastin可通過調(diào)控VEGF-VEGFR信號(hào)通路中相關(guān)重要信號(hào)傳導(dǎo)分子的基因表達(dá),改善糖尿病視網(wǎng)膜病變模型大鼠視力水平。