周璇 胡蘇華

(隨州市中心醫(yī)院 1中醫(yī)科，湖北 隨州 441300；2神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū))

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)的常見并發(fā)癥之一，患者早期癥狀為腎小球病變，隨著疾病的進展逐步發(fā)展為終末期腎病，腎小管上皮細胞炎癥反應、細胞凋亡與DN嚴重程度密切相關〔1～4〕。蛇床子素屬于香豆素類物質(zhì)，可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷〔5〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在DM并發(fā)癥的發(fā)生過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中LncRNA SNHG5屬于snoRNA U50與U50宿主基因外顯子的成熟剪切體，高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中SNHG5的表達水平降低，上調(diào)其表達可抑制高糖誘導的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡及遷移〔6〕。本研究探討蛇床子素對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖、凋亡、炎癥的影響及其對SNHG5的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 南京澤朗醫(yī)藥提供蛇床子素；上海弘順生物提供人腎小管上皮細胞HK-2；南京信帆生物提供Lipofectamine2000；上海吉瑪制藥提供si-NC、si-SNHG5、pcDNA、pcDNA-SNHG5；美國Thermo Fisher公司提供Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑；上海卡韋生物提供CCK-8試劑；美國Sigma公司提供凋亡檢測試劑盒；上海信裕生物提供腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒；上海遠慕生物提供白細胞介素(IL)-6檢測試劑盒；美國CST公司提供兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體；美國Abcam公司提供二抗。

1.2方法

1.2.1實驗分組 HK-2細胞培養(yǎng)于含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h〔7〕，記為高糖(HG)組。HK-2細胞培養(yǎng)于含有濃度為5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，記為正常糖(NG)組。采用不同濃度的蛇床子素(0、1、10、100、1 000、5 000 nmol/L)培養(yǎng)HK-2細胞48 h〔8〕，分別記為0、1、10、100、1 000、5 000 nmol/L組。采用含有濃度為100 nmol/L蛇床子素與5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞48 h，記為NG+蛇床子素組。采用含有濃度為100 nmol/L蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞48 h，記為HG+蛇床子素組。分別將pcDNA、pcDNA-SNHG5轉(zhuǎn)染入HK-2細胞，加入含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，分別記為HG+pcDNA組、HG+pcDNA-SNHG5組。si-NC、si-SNHG5分別轉(zhuǎn)染入HK-2細胞后加入含有濃度為100 nmol/L蛇床子素與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞48 h，分別記為HG+蛇床子素+si-NC組、HG+蛇床子素+si-SNHG5組。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測SNHG5的表達水平 采用Trizol法提取NG組、NG+蛇床子素組、HG組、HG+蛇床子素組、HG+pcDNA組、HG+pcDNA-SNHG5組、HG+蛇床子素+si-NC組、HG+蛇床子素+si-SNHG5組HK-2細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書配置反應體系與設置反應程序，應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測SNHG5(內(nèi)參GAPDH)相對表達量。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 收集各組HK-2細胞(1×106個/ml)分別接種于96孔板(100 μl/孔)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入10 μl CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測各孔吸光度值(OD 450 nm)。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組HK-2細胞加入預冷PBS洗滌后棄上清，將500 μl結合緩沖液加入細胞沉淀中，按照凋亡試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6的水平 收集各組HK-2細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測TNF-α、IL-6的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組HK-2細胞加入400 μl放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加電化學發(fā)光(ECL)顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度的蛇床子素對HK-2細胞活力的影響 隨著不同濃度的蛇床子素處理HK-2細胞，細胞活力比較無統(tǒng)計學意義，在蛇床子素濃度為5 000 nmol/L時于培養(yǎng)48 h時細胞活力明顯降低(P<0.05)，在蛇床子素濃度為1 000、5 000 nmol/L時于培養(yǎng)72 h時細胞活力明顯降低(P<0.05)，蛇床子素濃度為100 nmol/L時于培養(yǎng)24、48、72 h時細胞活力無明顯變化，因而選用100 nmol/L蛇床子素進行后續(xù)研究，見表1。

表1 不同濃度蛇床子素對HK-2細胞活力的影響

2.2蛇床子素對高糖誘導的HK-2細胞活力、凋亡及炎癥因子的影響 NG組與NG+蛇床子素組SNHG5的表達水平、細胞活力、凋亡率、Bax、Bcl-2蛋白、TNF-α、IL-6水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與NG組比較，HG組SNHG5表達水平、細胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，TNF-α、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)，蛇床子素可降低HG對細胞活力、凋亡及炎癥因子的作用，見圖1、圖2、表2。

2.3SNHG5對高糖誘導的HK-2細胞活力、凋亡及炎癥因子的影響 與HG組、HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-SNHG5組SNHG5表達明顯升高，48、72 h細胞活力明顯升高，凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，TNF-α、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)，見圖3、表3。

1～4：NG組、NG+蛇床子素組、HG組、HG+蛇床子素組圖1 Western印跡檢測各組Bax、Bcl-2蛋白表達

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡

表2 蛇床子素對細胞活力和凋亡及炎癥因子的影響

1～3：HG組、HG+pcDNA組、 HG+pcDNA-SNHG5組圖3 SNHG5對高糖誘導的HK-2細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表3 SNHG5對細胞活力、凋亡及炎癥因子的影響

2.4干擾SNHG5可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對高糖誘導的HK-2細胞活力、凋亡及炎癥因子的影響 與HG+蛇床子素+si-NC組比較，HG+蛇床子素+si-SNHG5組SNHG5表達明顯升高，48、72 h細胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低，TNF-α、IL-6水平明顯升高(均P<0.05)，見圖4、圖5、表4。

1～4:HG組、HG+蛇床子素組、HG+蛇床子素+si-NC組、HG+蛇床子素+si-SNHG5組圖4 Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達

圖5 流式細胞檢測細胞凋亡

表4 干擾SNHG5可逆轉(zhuǎn)蛇床子素對細胞活力和凋亡及炎癥因子的影響

3 討 論

蛇床子素具有清除氧自由基等作用，其可通過抗氧化應激作用而減輕海馬組織神經(jīng)細胞損傷，并對睡眠剝奪大鼠的記憶功能發(fā)揮保護作用〔9〕。蛇床子素可減輕類風濕性關節(jié)炎大鼠的軟骨損傷，并可抑制炎癥反應〔10〕。但蛇床子素對DN的治療效果及其可能作用機制尚未闡明。本研究結果提示，蛇床子素可促進高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖。細胞凋亡異常在多種疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2/Bax比值降低可促進細胞凋亡，而比值升高可抑制細胞凋亡〔11〕。本研究結果表明，蛇床子素可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡。本研究結果與相關文獻報道結果相似〔12〕，進一步研究顯示，蛇床子素可明顯降低高糖誘導的腎小管上皮細胞中TNF-α、IL-6的水平，提示蛇床子素可抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥反應。

本研究提示，蛇床子素可能通過上調(diào)SNHG5的表達從而發(fā)揮作用。研究表明SNHG5/miR-26a/SOX2信號軸增強骨關節(jié)炎中軟骨細胞的增殖，并可減輕細胞損傷〔13〕。SNHG5通過上調(diào)KLF4增強脊髓損傷中星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活力〔14〕。SNHG5在慢阻肺中表達水平降低，并可通過miR-132/PTEN軸調(diào)控細胞凋亡及炎癥反應〔15〕。本研究提示，干擾SNHG5表達可明顯逆轉(zhuǎn)蛇床子素對高糖誘導的腎小管上皮細胞增殖、凋亡及炎癥反應的作用。