趙麗 原大江

(山西醫(yī)科大學(xué) 1麻醉學(xué)系，山西 太原 030001；2第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科)

急性心肌梗死病理過程中，梗死冠脈再通可以限制梗死范圍，改善心肌收縮功能，然而缺血心肌再灌注后會導(dǎo)致梗死心肌損傷程度進(jìn)一步加重，降低治療的成功率，稱為缺血/再灌注(I/R)損傷〔1〕。有研究表明，自噬在心肌I/R的不同階段發(fā)揮不同的作用〔2〕。當(dāng)心肌細(xì)胞處于缺血狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的自噬水平會適度激活，通過循環(huán)利用功能失調(diào)的胞質(zhì)成分彌補(bǔ)線粒體損傷從而保護(hù)心肌細(xì)胞〔3〕。在再灌注過程中，過度氧化應(yīng)激導(dǎo)致Beclin-1過表達(dá)，細(xì)胞自噬被過度激活，促進(jìn)細(xì)胞重要成分過度降解和自我消化，加重心肌細(xì)胞的損傷〔4，5〕。

研究證實(shí)，當(dāng)心肌缺血時(shí)心臟感覺神經(jīng)在心肌組織間釋放降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)增加〔6〕，CGRP可激活線粒體ATP敏感性鉀通道(KATP)通道(mitoKATP通道)，穩(wěn)定線粒膜電位，保護(hù)I/R心肌細(xì)胞〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP預(yù)處理與自噬密切相關(guān)〔8，9〕。本研究旨在探討CGRP的心臟保護(hù)作用是否與其抑制過度自噬有關(guān)，并探討其潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1主要試劑和儀器 H9c2大鼠心肌細(xì)胞株(武漢普賽諾公司)。CGRP、CGRP8～37(Sigma公司，美國舊金山)；無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號PYG0021，BOSTER公司)、高糖改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM,批號PYG0073，BOSTER公司)；1%青/鏈霉素雙抗(批號P1400，索萊寶公司)；胎牛血清(批號11011-8611，四季青公司)；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號C1086，碧云天公司)；p-蛋白激酶B(AKT)，AKT，p-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和mTOR(Abcam公司)〕；C3B重組兔單克隆抗體(批號3868T，CST公司)；Beclin-1兔多克隆抗體(批號11306-1-AP，proteintech公司)；Cytochrome C多克隆抗體(批號SA00001-2，proteintech公司)；HRP-標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號SA00001-2，proteintech公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒 JC-1(批號C2006，碧云天公司)。超凈工作臺(世安，中國)；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(型號：800WJ3423，Thermo Forna美國)；PH 儀(批號PHSJ-SF，上海精科有限公司，中國上海)；奧林巴斯OlympusDP73 熒光顯微鏡(TKO光學(xué)儀器股份有限公司，日本)。

1.2方法

1.2.1H9c2細(xì)胞培養(yǎng)及建立H/R模型 常規(guī)培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞。隔2 d換液，培養(yǎng)3～4 d按照1∶4比例傳代，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至亞融合(肉眼估計(jì)>80%)，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行H/R處理。自制H/R盒，使用前通氮?dú)獬ズ凶又械难鯕猓渲迫毖跻?，使用前通氮?dú)怙柡? h；配制復(fù)氧液，使用前通氧氣飽和30 min。缺氧培養(yǎng)：H9c2心肌細(xì)胞中加缺氧液于培養(yǎng)3 h，期間持續(xù)通入氮?dú)?1 L/min)至氧分壓為25 mmHg；復(fù)氧培養(yǎng)：加復(fù)氧液，正常培養(yǎng)2 h。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 空白對照組：正常培養(yǎng)；H/R組：進(jìn)行H/R處理；參照文獻(xiàn)〔8〕，1×10-1mol/L CGRP對H/R后心肌細(xì)胞有比較顯著的保護(hù)作用，1×10-7mol/L CGRP8～37對CGRP的心肌保護(hù)有明顯的拮抗作用，本實(shí)驗(yàn)選擇該濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CGRP組：加入 CGRP 1×10-8mol/L作用20 min，缺氧3 h，復(fù)氧2 h；CGRP8～37組：于H/R前30 min加入1×10-7mol/L CGRP8～37作用10 min，加入CGRP作用20 min。

1.2.3臺盼藍(lán)染色檢測各組H9c2心肌細(xì)胞存活率 各組實(shí)驗(yàn)完成后，收集并重懸細(xì)胞，加入臺盼藍(lán)染液，吸取少量經(jīng)過染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率=(細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4TUNEL法檢測H9c2心肌細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)完成后，先利用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染細(xì)胞核，方便計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的細(xì)胞總數(shù)，然后根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，熒光顯微鏡下觀察計(jì)算細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5檢測H9c2心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)活性 收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃離心取上清，根據(jù)LDH檢測試劑盒操作流程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組LDH活性。

1.2.6JC-I檢測H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電變化 根據(jù)試劑盒操作流程標(biāo)記線粒體，熒光顯微鏡下觀察記錄。 ImageJ 軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算紅/綠熒光強(qiáng)度比值。

1.2.7Western印跡檢測Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3、p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR表達(dá)量 加裂解液，冰上裂解，離心，取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，將樣品中加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)混勻，沸水浴，使蛋白充分變性。制備SDS-PAGE，上樣，電泳，然后轉(zhuǎn)膜。膜用TBST漂洗，封閉液封閉3 h，加入一抗(LC3B 1∶1 000；Beclin1 1∶1 000；p-AKT，AKT，p-mTOR和mTOR 1∶5 000；β-Actin 1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜。膜漂洗后加入二抗(1∶2 000)，室溫?fù)u床孵育2 h，將條帶放于曝光儀器平板上，將AB顯色液滴加到條帶上，曝光顯色，應(yīng)用 Quantity One 軟件進(jìn)行圖像量化，分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響 與空白組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)；與H/R組相比，CGRP組H9c2心肌細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)；CGRP8～37可部分逆轉(zhuǎn)CGRP的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞凋亡率的影響 藍(lán)色熒光為視野下的所有有核細(xì)胞。綠色熒光為TUNEL染色后的陽性細(xì)胞，提示細(xì)胞凋亡。見圖1。與空白組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；與H/R組比較，CGRP組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)；與CGRP組比較，CGRP8～37組心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。見表1。

2.3不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞LDH活性的影響 與空白組比較，H/R后H9C2心肌細(xì)胞LDH活性明顯升高(P<0.01)。加入CGRP預(yù)處理后細(xì)胞LDH活性明顯降低(P<0.01)。與CGRP組比較，CGRP8～37組LDH活性明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.4不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與空白組比較，H/R組紅/綠熒光比值明顯下降，線粒體膜電位去極化(P<0.01)；與H/R組相比，CGRP組紅/綠熒光比值明顯升高，線粒體膜電位超極化(P<0.01)；CGRP8～37組可逆轉(zhuǎn)CGRP組的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表1、見圖2。

2.5不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的影響 與空白組對比，H/R組的H9c2心肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯上升(P<0.01)。與H/R組比較，CGRP組的H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1表達(dá)和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯下降(P<0.01)，CGRP8～37組可拮抗CGRP的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 見表1、圖3。

2.6不同處理方法對H9c2心肌細(xì)胞AKT/mTOR通路蛋白p-AKT、AKT、p-mTOR和mTOR表達(dá)量的影響 與空白組對比，H/R組H9c2心肌細(xì)胞p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明顯下降(P<0.01)。與H/R組比較，CGRP組p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值明顯升高(P<0.01)。CGRP8～37組可拮抗CGRP的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4、表2。

表1 各組心肌細(xì)胞凋亡率、凋亡率、LDH紅綠熒光自噬蛋白表達(dá)量的比較

圖1 各組H9c2心肌細(xì)胞(TUNEL染色，×200)

紅色熒光線粒體膜電位超極化，綠色熒光線粒體膜電位去極化圖2 各組H9c2心肌細(xì)胞熒光顯微鏡下線粒體膜電位(×400)

圖3 Western印跡檢測各組H9c2心肌細(xì)胞Beclin-1和 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

圖4 Western印跡檢測各組H9c2心肌細(xì)胞Akt/mTOR 信號蛋白的表達(dá)

表2 CGRP對Akt/mTOR信號通路的影響

3 討 論

本研究表明，LDH的釋放量可反映細(xì)胞的損傷程度。為進(jìn)一步測定細(xì)胞的損傷程度，檢測了細(xì)胞外液中LDH的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/R后心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度升高，CGRP預(yù)處理后LDH濃度下降，CGRP8～37可逆轉(zhuǎn)CGRP的作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的研究〔7〕結(jié)果一致，CGRP可減輕心肌細(xì)胞H/R損傷。

細(xì)胞凋亡存在于心肌細(xì)胞I/R損傷過程中。線粒體膜電位的下降提示細(xì)胞處于凋亡早期。本研究結(jié)果與先前CGRP保護(hù)I/R心肌細(xì)胞的報(bào)道〔10〕一致。有研究認(rèn)為，在I/R心肌細(xì)胞中自噬具有調(diào)節(jié)作用，但是CGRP通過影響自噬水平減輕I/R心肌細(xì)胞損傷的報(bào)道很少。

細(xì)胞生理狀態(tài)下，自噬維持在較低的基礎(chǔ)水平，通過降解功能受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定〔9〕。細(xì)胞在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、能量耗盡等應(yīng)激情況下會誘導(dǎo)自噬發(fā)生，自噬對細(xì)胞成分降解和再循環(huán)，成為細(xì)胞暫時(shí)的營養(yǎng)物質(zhì)來源〔11，12〕。心肌細(xì)胞I/R時(shí)會誘導(dǎo)過度自噬，過多的自噬小體與溶酶體結(jié)合，吞噬降解正常的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，加重心肌細(xì)胞損傷〔13〕。LC3是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白。當(dāng)自噬激活時(shí)，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇共價(jià)結(jié)合后形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體膜。因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬水平〔14〕。Beclin-1是一種Bcl-2相互作用蛋白，也是一種重要的自噬啟動蛋白，可與其他自噬調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，調(diào)控自噬水平〔15〕。據(jù)報(bào)道，敲除Beclin-1基因可降低心肌細(xì)胞再灌注時(shí)誘導(dǎo)的過度自噬，改善心臟損傷〔16〕。本研究結(jié)果與先前報(bào)告一致〔17〕，同時(shí)CGRP可降低H/R心肌細(xì)胞 LC3-Ⅱ，Beclin-1蛋白質(zhì)的表達(dá)，上述作用可被CGRP8～37抑制，由此可見，CGRP可能通過抑制H/R誘導(dǎo)的過度自噬從而保護(hù)H/R心肌細(xì)胞。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT/mTOR途徑在許多細(xì)胞過程和細(xì)胞功能中起著不可或缺的作用，包括腫瘤的增殖、遷移、黏附、存活和分子改變〔18，19〕。研究表明，mTOR是細(xì)胞生長的核心調(diào)節(jié)劑，它可以負(fù)性調(diào)控自噬活性〔20～22〕。越來越多的證據(jù)證明，AKT激活在I/R或H/R后的心臟保護(hù)中起著至關(guān)重要的作用〔23～25〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，Akt/mTOR信號通路可能參與CGRP調(diào)控自噬。

綜上，在體外模型中證明，CGRP可能部分通過激活A(yù)KT/mTOR通路抑制過度自噬，從而保護(hù)H/R心肌細(xì)胞。 CGRP和自噬之間的相互作用為預(yù)防I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和損傷提供了新的策略。然而，需要使用自噬激動劑和自噬抑制劑來更深入的研究評估CGRP的心臟保護(hù)作用，并且進(jìn)一步闡明確切的分子機(jī)制。