黃敏 朱立成 吳傳中

(1南通大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南通 226000；南通市第三人民醫(yī)院 2呼吸內(nèi)科；3老年科)

肺癌是目前嚴重威脅人類健康的疾病之一，目前臨床上多采用早期手術、化療、放療為主要治療手段，但早期手術治療的效果并不理想，多數(shù)患者存在病灶復發(fā)的現(xiàn)象，因此多在術后聯(lián)合化療治療，研究顯示，化療可在一定程度上提高肺癌患者5年生存率，但存在明顯的血液、肝臟等毒副作用〔1,2〕。肺癌的進展與癌細胞增殖失調(diào)，遷移加劇相關，隨著臨床上對肺癌轉(zhuǎn)移的機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的進展與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路相關，此信號通路具有促進細胞外基質(zhì)增生，原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，在肺癌進展過程中具有重要的作用〔3,4〕。在本文研究中將紅景天提取物應用于肺癌模型中，分析其對肺癌的作用及是否經(jīng)TGF-β/Smads信號通路抑制肺癌的進展。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取90只Wistar大鼠，雌雄各半，購自慕恩(廣州)生物科技有限公司，動物許可證號：SYXK(粵)2020-0225，18～20月齡，平均體重(302.25±25.75)g，在30%～35%相對濕度、(23.8±1.5)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)7 d，光照12 h/d，分籠飼養(yǎng)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，實驗操作嚴格按照動物實驗倫理要求相關規(guī)定進行。

主要試劑：鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)；碘油(鄭州派尼化學試劑)；癌抗原(CA)125酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海群己生物科技有限公司)；癌胚抗原(CEA)ELISA試劑盒(艾美捷科技有限公司)；小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)抗體(武漢益普生物科技有限公司)；兔抗大鼠E-鈣黏附蛋白(Cadherin)抗體(上海研卉生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠TGF-β1抗體(艾美捷科技有限公司)；兔抗人Smad3抗體(武漢益普生物科技有限公司)；兔抗大鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體(武漢益普生物科技有限公司)；兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1紅景天提取物制備 將紅景天放置于烘干箱中做烘干處理后粉碎，行超聲提取液冷卻、濾過、回收乙醇，加30倍量水做洗脫處理后使用30%乙醇洗脫、濃度、真空干燥，得到紅景天提取物，配制為0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml 3個低、中、高劑量，備用。

1.2.2分組及建模 將所選取的90只大鼠分為A組(正常組)、B組(模型組)、C組(環(huán)磷酰胺組)各15只，D組(紅景天組)45只，B組、C組、D組均參照陳稀煩等〔5〕研究中肺癌模型的建立方法構(gòu)建肺癌大鼠模型，制備致癌碘油液：將6.4 ml碘油、1.6 ml二乙基亞硝胺、1.2 g三甲基膽蒽混合均勻后放置于70℃的水浴箱中做孵育處理，孵育12 h后所得到的乳狀液即為致癌碘油液。在大鼠建模前3 d肌注45 mg鏈霉素、2萬U的青霉素，以避免建模過程中感染的發(fā)生提高建模成功率。建模：大鼠腹腔注射水合氯醛做常規(guī)麻醉處理后將其仰臥固定于操作平臺上，使用手術縫線固定上齒促使大鼠喉部肌肉處于松弛的狀態(tài)，使用無齒鑷將舌緩慢拉出，在額鏡的輔助下將0.1 ml致癌碘油液灌注于左肺葉支氣管處，灌注結(jié)束后自由攝食飼養(yǎng)。A組在此過程中不做任何處理。

1.2.3給藥 在灌注致癌碘油液后第2天A組、B組腹腔注射0.5 ml/kg的0.9%氯化鈉(Nacl)，C組腹腔注射0.5 ml/kg的環(huán)磷酰胺注射液，D組分為E組(低劑量紅景天)、F組(中劑量紅景天)、G組(高劑量紅景天)3個亞組，大鼠分別腹腔注射0.5、1.0、2.0 mg/(ml·kg)的紅景天提取物，各組大鼠均每日注射1次，連續(xù)注射8 w，觀察變化。

1.2.4腫瘤體積、質(zhì)量評價 在末次給藥1 d后采取大鼠2 ml尾部靜脈血后常規(guī)麻醉處死大鼠，迅速取肺癌組織，測量肺癌組織最長徑、最短徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積=(最長徑×最短徑2)/2，并稱量腫瘤重量，計算抑瘤率，抑瘤率=(1-治療組平均腫瘤質(zhì)量/B組平均腫瘤質(zhì)量)×100%。上述操作完成后將肺癌組織均勻分為3等份，分別做病理組織學觀察、肺癌細胞分離和蛋白檢測。

1.2.5病理組織學觀察 取所獲取的肺癌組織，固定1 d后，使用酒精脫水、二甲苯透明處理后做常規(guī)石蠟包埋，做5 μm切片，做蘇木素-伊紅(HE)染色，樹膠封片后使用光學顯微鏡觀察大鼠肺組織病理變化。

1.2.6腫瘤標志物水平檢測 將所抽取的2 ml尾部靜脈血分離血清，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠血清腫瘤標志物CA125、CEA水平。

1.2.7肺癌細胞增殖活性檢測 將所取得的肺癌組織分離出肺癌細胞，采用CCK-8法測定大鼠肺癌細胞增殖活性，取對數(shù)生長期細胞，將其接種于96孔板內(nèi)，細胞濃度為2×107/L，在溫度為37℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后使用酶標儀記錄450 nm波長處的吸光值，取其中4孔光密度(OD)均值，計算各組癌細胞增殖活性，增殖率(%)=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD處理組)×100%。

1.2.8肺癌細胞凋亡情況檢測 采用TUNEL法檢測大鼠肺癌細胞凋亡率，將所獲得的細胞使用磷酸鹽緩沖液(PBS)震蕩后使用PBS重復洗滌3次，每次洗滌時間為5 min，使用0.1% Triton X-100打孔，完成后再次使用PBS重復洗滌3次，根據(jù)TUNEL試劑盒操作說明做1號、2號液混合，在避光、37℃的條件下孵育1 h后，使用PBS重復洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并進行計數(shù)，經(jīng)洗滌、4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的細胞核分別呈現(xiàn)為陽性和陰性，其中顏色分別為綠色熒光和藍色熒光，重復進行3次并取平均值。細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.9肺癌細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗檢測大鼠肺癌細胞遷移能力，將細胞接種至18孔板帶其增長到80%時，使用100 μl的槍頭,垂直劃出3條直線，使用PBS清洗2～3次，分別加入0.5%的血清培養(yǎng)基，觀察24 h之后，使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的遷移數(shù)量。

1.2.10肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白、TGF-β/Smads信號通路蛋白表達量檢測 采用Western印跡檢測大鼠肺組織EMT相關蛋白Vimentin、E-Cadherin、TGF-β/Smads信號通路蛋白TGF-β1、Smad3、Bcl-2、Caspase-3表達量，將肺癌組織離心處理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸(BCA)進行蛋白定量檢測，在十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，100℃加熱5 min，凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.10% TBST給予稀釋(Vimentin、E-Cadherin、TGF-β1、Smad3、Bcl-2、Caspase-3一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腫瘤體積、腫瘤重量、抑瘤率對比 與B組相比，C、E、F、G組腫瘤體積、腫瘤重量明顯降低(P<0.05)；與C組相比，E、F、G組腫瘤體積、腫瘤重量明顯降低，抑瘤率明顯升高，且隨著紅景天劑量增加腫瘤體積、腫瘤重量明顯降低、抑瘤率明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組病理組織學觀察 A組大鼠肺組織無病理改變，細胞結(jié)構(gòu)正常；B組大鼠上皮細胞受到嚴重損傷，肺泡損傷，肺泡壁細胞呈深染、不規(guī)則的細胞核；C、E、F、G組大鼠肺泡損傷程度較B組明顯減輕，細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復正常，且隨著D組各亞組(E組、F組、G組)用藥劑量的增加，肺病理變化改善程度越來越明顯，接近于正常。見圖1。

表1 各組腫瘤體積、腫瘤重量、抑瘤率、血清腫瘤標志物水平對比

圖1 各組病理組織學觀察(HE染色，×400)

2.3各組血清腫瘤標志物水平對比 與A組相比，B、C、E、F、G組CA125、CEA水平明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、E、F、G組CA125、CEA水平明顯降低(P<0.05)；與C組相比，E、F、G組CA125、CEA水平明顯降低，且隨著紅景天劑量增加CA125、CEA表達明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組癌細胞增殖率、凋亡、遷移能力對比 與B組相比，C、E、F、G組癌細胞增殖率、遷移數(shù)量明顯降低，凋亡率明顯升高(均P<0.05)；與C組相比，E、F、G組癌細胞增殖率、遷移數(shù)量明顯降低，凋亡率明顯升高，且隨著紅景天劑量增加，各項指標變化程度更為顯著(均P<0.05)。見表2。

2.5各組肺組織EMT相關蛋白表達情況對比 與A組對比，B、C、E、F、G組Vimentin蛋白表達量明顯升高，E-cadherin蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；與B組相比，C、E、F、G組Vimentin蛋白表達量明顯降低，E-cadherin蛋白表達量明顯升高(P<0.05)；與C組相比，E、F、G組Vimentin蛋白表達量明顯降低，E-cadherin蛋白表達量明顯升高，且隨著紅景天劑量增加表達水平的變化程度更為顯著(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組癌細胞增殖率、凋亡、遷移能力、肺組織EMT相關蛋白表達情況對比

圖2 Western印跡檢測EMT相關蛋白表達

2.6各組肺組織TGF-β/Smads信號通路蛋白表達量對比 與A組相比，B、C、E、F、G組TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表達量明顯降低，Bcl-2蛋白表達量明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、E、F、G組TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表達量明顯升高，Bcl-2蛋白表達量明顯降低(P<0.05)；與C組相比，E、F、G組TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表達量明顯升高，Bcl-2蛋白表達量明顯降低，且隨著紅景天劑量增加表達水平的變化程度更為顯著(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 Western印跡檢測TGF-β/Smads信號通路蛋白表達

表3 各組肺組織TGF-β/Smads信號通路蛋白表達量對比

3 討 論

肺癌包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種類型，其中以非小細胞肺癌發(fā)病率最高，肺癌發(fā)生后其疾病進展較為迅速，較易轉(zhuǎn)移，且部分患者預后較差，究其原因可能與臨床用藥不能有效作用于疾病進展相關作用靶點相關〔6,7〕。

紅景天分布較為廣泛，作為藥用植物用藥歷史悠久，其在民間被稱為“黃金根”，可見其具有較為重要的藥用價值〔8〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，紅景天中含有多種化學物，其中以紅景天苷為主的紅景天提取物已經(jīng)逐漸被臨床上證實具有多種藥理作用，目前藥理試驗已經(jīng)證實紅景天提取物具有抗抑郁、抗衰老、抗疲勞、預防高原病及抗惡性腫瘤等多種藥理作用〔9〕。王也夫等〔10〕、羅蘭〔11〕、韓何丹等〔12〕在其研究中發(fā)現(xiàn)紅景天提取物具有抗慢性束縛應激所致大鼠焦慮障礙、運動小鼠抗氧化能力、順鉑致腎細胞毒性的保護作用等多種作用。另外有體外試驗發(fā)現(xiàn)，紅景天提取物可抑制腫瘤細胞活性，促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮其抵抗腫瘤進展的作用。本研究結(jié)果提示，紅景天提取物可能劑量依賴性的抑制肺癌腫瘤生長，抑制疾病進展。

TGF-β內(nèi)含6個半胱氨酸殘基，包括BMP/GDF/Mis亞家族、TGF-β/Actinvin/Nodal亞家族兩個亞家族，TGF-β1屬于其成員之一，屬于一種促進肺癌轉(zhuǎn)移和侵襲的指標，在肺癌發(fā)生初期其作為一種腫瘤抑制因子可抑制癌細胞增殖，但在肺癌晚期其可經(jīng)促進癌細胞增殖、分化、遷移促進疾病進一步發(fā)展〔13～15〕。TGF-β/Smads信號通路是由膜結(jié)合的Ⅰ型受體、Ⅱ型受體與Smad蛋白所組成的復合物相關，上述受體可與Smad蛋白在Ⅰ型受體的絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域下相互作用〔16〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可經(jīng)誘導Smad3的磷酸化，介導炎性信號通路的傳導作用促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，與癌細胞增殖、遷移相關。Smad3在TGF-β的誘導作用下發(fā)生磷酸化，使得磷酸化的Smad3進入至核內(nèi)，可經(jīng)與相對應的作用靶點相結(jié)合后發(fā)生其多種生物學效應〔17,18〕。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads信號通路在肺癌發(fā)生、癌細胞遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、衰老等過程相關〔19，20〕。一項研究顯示，TGF-β1/Smads可經(jīng)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白E-cadherin、Vimentin等表達，參與肺癌進展〔21〕。本研究結(jié)果提示，紅景天提取物經(jīng)激活肺癌TGF-β/Smads信號通路，上調(diào)E-cadherin、Caspase-3表達，抑制Vimentin、Bcl-2表達相關，呈劑量依賴。