嚴(yán)曉麗 范彥芳 嚴(yán)鵬 薛晶 鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2021年最新癌癥評(píng)估數(shù)據(jù)顯示，大腸癌發(fā)病率和死亡率在男性和女性中均位居第三位〔1〕。在我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)，2018年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，中國(guó)已成為全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)最多的國(guó)家〔2〕。奧沙利鉑(L-OHP)是臨床治療中晚期結(jié)直腸癌的一線化療藥物，并已被推薦列入Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的輔助治療和復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的術(shù)前治療和全身系統(tǒng)治療方案中〔2〕。但結(jié)直腸癌患者對(duì)L-OHP產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致化療療效明顯降低甚至化療失敗的一個(gè)主要原因。為了提高中晚期結(jié)直腸癌患者的預(yù)期壽命和生活質(zhì)量，通過尋找新的生物標(biāo)志物逆轉(zhuǎn)L-OHP化療耐藥將有助于改善患者預(yù)后和治療方案的選擇。L-OHP主要通過破壞癌細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能阻止癌細(xì)胞的分裂和增殖，而DNA結(jié)構(gòu)損傷主要和毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因(ATM)/細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶(CHK)2/細(xì)胞周期分裂素(CDC)25A信號(hào)通路有關(guān)。有研究顯示miRNA-21與以L-OHP為基礎(chǔ)化療方案的腫瘤患者的療效及預(yù)后密切相關(guān)〔3,4〕，但miRNA-21是否主要通過調(diào)控ATM/CHK2/CDC25A通路參與L-OHP化療耐藥目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過研究結(jié)直腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞株HCT116/L-OHP中miRNA-21與該信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子ATM、CHK2、CDC25A、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2的關(guān)系，探討miRNA-21是否主要通過調(diào)控該信號(hào)通路參與結(jié)直腸癌細(xì)胞L-OHP的耐藥，進(jìn)而為臨床L-OHP耐藥提供新的生物治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 HCT116/L-OHP購(gòu)于上海博谷生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)于BI公司，RPMI1640培養(yǎng)基與胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA,0.05%)購(gòu)于Gibco公司?？俁NA抽提試劑(TRIZOL)購(gòu)于Invitrogen科技公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，莖環(huán)法miRNA RT-PCR 定量試劑盒和莖環(huán)法miRNAs熒光擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)于蘇州吉瑪基因公司。miRNA-21引物序列、miRNA-21模擬物(mimics)、miRNA-21抑制劑(inhibitors)及相應(yīng)的陰性對(duì)照序列均由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成，其余因子引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。RIPA裂解液購(gòu)于索萊寶科技有限公司，ATM、β-actin兔抗人單克隆抗體購(gòu)于ABclonal公司，CHK2、CDK2兔抗人單克隆抗體、CDC25A兔抗人多克隆抗體及二抗羊抗兔均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCT116/L-OHP細(xì)胞采用含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)培養(yǎng)皿底的85%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化，以1∶3比例進(jìn)行傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為五組：空白對(duì)照(NC)組、mimics陰性對(duì)照(MNC)組、mimics組、inhibitors陰性對(duì)照(INC)組、inhibitors組。空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，MNC組轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics 陰性對(duì)照序列，mimics組轉(zhuǎn)染miRNA-21 mimics序列，INC組轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitors 陰性對(duì)照序列，inhibitors組轉(zhuǎn)染miRNA-21 inhibitors序列。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以密度約1×106個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，待細(xì)胞匯合至70%～80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)配液：A液(Lipo2000 5 μl+無(wú)血清培養(yǎng)基250 μl)/孔×4個(gè)轉(zhuǎn)染組，室溫靜置5 min，B液(MNC/Mimics/INC/Inhibitors轉(zhuǎn)染序列各5 μl+無(wú)血清培養(yǎng)基250 μl)/孔，混合各轉(zhuǎn)染組的A液與B液后，室溫靜置20 min，分別將各組的AB混合液滴加至相應(yīng)的6孔板中，轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞基本融合至85%～95%，收集細(xì)胞。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞RNA提?。捍囵B(yǎng)的細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%時(shí)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA。RNA濃度采用Nanodrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，樣品純度A260/A280比值在1.8～2.1范圍內(nèi)為符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品做2個(gè)復(fù)孔，復(fù)孔間Ct值差異<1。以2-ΔΔCt判定目的基因的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)于對(duì)照組中的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。引物序列：miRNA-21正義鏈5′-TCGCCCGTAGCTTATCAGACT-3′,反義鏈5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′;U6 snRNA正義鏈5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反義鏈5′-GGAA CGCTTCACGAATTTG-3′;ATM正義鏈5′-ATTGGCTTATACGCGCAGTG-3′,反義鏈5′-TAGAGATTCTGGATCTCCGTCA-3′;CHK2正義鏈5′-CTCGGG-ATGCGGATGTTGAG-3′,反義鏈5′-TGCTGGTAGAGGAGCTGGAT-3′;CDC25A正義鏈5′-ACCTCAGA-AGCTGTTGGGATG-3′,反義鏈5′-GTCCTAGAGAGTGCAGGCAG-3′;CDK2正義鏈5′-TGGACACTGAG-ACTGAGGGTGT-3′,反義鏈5′-TCTTGATGAGGGGAAGAGGAAT-3′;GAPDH正義鏈5′-GCACCGTCA-AGGCTGAGAAC-3′,反義鏈5′-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3′。

1.2.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，ATM、CHK2、CDC25A、CDK2一抗均以1∶1 000濃度稀釋、β-actin一抗(1∶100 000稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，15 min/次，二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL液顯影拍照。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。圖像采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

各組ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 mimics組中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于MNC組與NC組(P<0.05)；MNC組與NC組相比較，各因子 mRNA及蛋白表達(dá)水平的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。inhibitors組中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA的表達(dá)均明顯低于INC組(P<0.05)；INC組與NC組相比較，各因子 mRNA及蛋白表達(dá)水平差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組ATM、CHK2、CDC25A 和CDK2 mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖1 β-actin、ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 蛋白在 各組中的表達(dá)

3 討 論

腫瘤的放化療治療多是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA損傷來(lái)消除腫瘤細(xì)胞。L-OHP作為一種抗腫瘤藥物被廣泛應(yīng)用于治療各種癌癥，包括結(jié)直腸癌，但腫瘤細(xì)胞對(duì)L-OHP化療產(chǎn)生耐藥性限制了L-OHP的療效和臨床應(yīng)用。L-OHP屬于第三代鉑類化療藥物，其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要是通過與DNA形成加合物，引起DNA鏈間、鏈內(nèi)及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，干擾DNA結(jié)構(gòu)和功能，致使DNA雙鏈在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中無(wú)法解開，阻止癌細(xì)胞的分裂和增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡〔5，6〕。DNA結(jié)構(gòu)損傷主要和ATM/CHK2/CDC25A信號(hào)通路有關(guān)。ATM基因編碼的蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境的不良刺激如L-OHP作用后DNA發(fā)生損傷，ATM會(huì)發(fā)生磷酸化進(jìn)而誘導(dǎo)多個(gè)底物包括CHK2磷酸化，進(jìn)一步放大DNA損傷信號(hào)并激活CDC25A。正常情況下，CDC25A在細(xì)胞分裂中期是穩(wěn)定的，而在分離中期結(jié)束后便被降解。DNA損傷后，CDC25A會(huì)特異性降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。研究表明，CDC25A表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤細(xì)胞化療耐藥密切相關(guān)，機(jī)制是通過減少G2/M期阻滯而增強(qiáng)了化療耐藥性，并且沉默CDC25A或用CDC25A抑制劑治療可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性〔7〕。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制因子miRNAs可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)L-OHP化療的敏感性，觸發(fā)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活力下降和腫瘤進(jìn)展，一些miRNAs還能提高L-OHP化療的療效〔8〕。miRNA-21 是一種癌基因，其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移預(yù)后、化療耐藥等均有密切關(guān)系。研究〔9～11〕顯示，miRNA-21高表達(dá)的大腸癌患者整體生存率和無(wú)病生存率較miRNA-21低表達(dá)患者明顯下降，miRNA-21在大腸癌組織中的表達(dá)水平對(duì)于患者的整體生存和無(wú)病生存是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCT116/L-OHP細(xì)胞株中miRNA-21的表達(dá)受到干預(yù)后，ATM/CHK2/CDC25A通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)也隨之發(fā)生變化。過表達(dá)miRNA-21時(shí)可促進(jìn)ATM的表達(dá)和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表達(dá)；當(dāng)miRNA-21表達(dá)降低時(shí)，ATM的表達(dá)和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表達(dá)水平均隨之下降，說明miRNA-21參與結(jié)直腸癌L-OHP化療耐藥的作用很可能和ATM/CHK2/CDC25A信號(hào)通路有關(guān)。抑制miRNA-21的表達(dá)可阻斷ATM/CHK2/CDC25A信號(hào)通路，進(jìn)而抑制耐藥細(xì)胞的無(wú)限增值。推測(cè)抑制miRNA-21將有可能成為結(jié)直腸癌L-OHP化療耐藥新的治療靶點(diǎn)，這也為進(jìn)一步研究L-OHP的耐藥機(jī)制提供了許多預(yù)測(cè)，但這還需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。