畢磊 賀釗 劉輝 武燃 陳暉

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，河北 唐山 063000；2唐山市第二醫(yī)院麻醉科)

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，由于早期無(wú)明顯癥狀，導(dǎo)致許多患者確診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球口腔癌發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，且多發(fā)于中年男性〔2〕。研究表明，口腔癌發(fā)病與長(zhǎng)期生活作息不良、吸煙及口腔類疾病長(zhǎng)期刺激有關(guān)〔3，4〕。目前，臨床上針對(duì)口腔癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化療和中醫(yī)中藥治療等〔5，6〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1是NAD+依賴的去乙酰化酶，通過(guò)使底物去乙?；鴧⑴c調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激等生理功能〔7～10〕。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1過(guò)表達(dá)在多種腫瘤和癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，如SIRT1過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔11〕，SIRT1過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制p65乙?；种蒲装Y細(xì)胞因子激活的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)產(chǎn)生，破壞間質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力12，SIRT1過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)傳導(dǎo)減弱骨橋蛋白誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移〔13〕等。但SIRT1過(guò)表達(dá)在口腔癌中的研究鮮見報(bào)道，本研究通過(guò)口腔癌CAL27細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT1過(guò)表達(dá)，檢測(cè)SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答及氧化應(yīng)激水平的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器 人口腔癌細(xì)胞CAL27由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供，pcDNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和載體購(gòu)自上海艾博思生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000購(gòu)自美國(guó)CST公司(貨號(hào)11668030)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、Trlzol試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)RP1100、RP2401、PC0020)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司(貨號(hào)MF01544、MF01310、MF01360、MF01963、MF16742、MF16113)，10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(貨號(hào)10100147、10313039)，兔抗鼠SIRT1單克隆抗體(ab32441)、兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗體(ab13847)、大鼠p21單克隆抗體(ab107099)、兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體(ab16502)、兔抗鼠活性氧(ROS)單克隆抗體(ab238986)及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的對(duì)應(yīng)山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。GeneAmp PCR系統(tǒng)9700、ABI7500 Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)；酶標(biāo)儀(Rayto，RT6100)，臺(tái)式高速離心機(jī)(大龍，D3024R)，成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，Tanon-1600R)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse E100)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 口腔癌細(xì)胞CAL27置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)研究。按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000說(shuō)明書將pcDNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染至CAL27細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CAL27細(xì)胞分為對(duì)照組、陰性對(duì)照組和SIRT1過(guò)表達(dá)組，陰性對(duì)照組和SIRT1過(guò)表達(dá)組按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000說(shuō)明書將空載體和pcDNA SIRT1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CA127細(xì)胞中，對(duì)照組不轉(zhuǎn)染，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-PCR檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)水平 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化處理后收集細(xì)胞懸液，用Trlzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明配制反應(yīng)體系。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增條件：保持步驟96℃ 15 s，和40個(gè)循環(huán)95℃ 10 s和60℃ 30 s)采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。SIRT1上游引物：5′-TGCGGGAATCCAAAGGATAATTCA-3′，下游：5′-CTT-CATCTTTGTCATACTTCATGGCT-3′；GADPH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCT-CCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng) 收集各組生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按梯度倍數(shù)進(jìn)行稀釋并接種至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2～3 w，至肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄上清液，結(jié)晶紫染色液染色10～20 min，選取培養(yǎng)皿拍照計(jì)數(shù)，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5Western印跡檢測(cè)SIRT1、caspase-3、P21和p-P65蛋白水平 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞，胰酶消化處理細(xì)胞。用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)模、脫脂奶粉封閉后，加入抗體SIRT1(1∶200)、caspase-3、p21、P65(1：500)，4℃孵育搖床過(guò)夜。回收一抗，加入按比例稀釋HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法于暗室下曝光顯影(GADPH作內(nèi)參)。將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分享光密度值。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6ELISA檢測(cè)iNOS、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10含量 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAL27細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書測(cè)定iNOS、IL-6、IL-10、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氨酶(LDH)含量，酶標(biāo)儀下測(cè)450 nm處吸光值，(實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450)/(對(duì)照組OD450-空白組OD450)×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.7免疫熒光檢測(cè)ROS含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至24孔板中，待細(xì)胞貼壁爬片后吸取培養(yǎng)基，用提前預(yù)熱的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，加入0.01 mol/L PBS洗滌3次，加入3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37℃條件下封閉1 h。棄封閉液后加入ROS一抗(1∶300)，4℃孵育過(guò)夜。0.01 mol/L PBS液洗滌3次，加入對(duì)應(yīng)的二抗(1∶100)室溫孵育2 h后加入0.01 mol/L PBS洗滌3次。10 μmol/L DCFH-DA室溫標(biāo)記15 min，PBS洗滌3次，熒光封片后顯微鏡下觀察。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1SIRT1過(guò)表達(dá)效率 與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1、圖1。提示過(guò)表達(dá)體系構(gòu)建成功。

2.2SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組〔(32.21±6.88)%〕相比，陰性對(duì)照組克隆形成率〔(35.45±7.82)%〕無(wú)明顯差異(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞克隆形成率〔(6.46±4.73)%〕明顯降低(P<0.05)。見圖2。

表1 RT-PCR和Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT1 表達(dá)水平

圖1 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平

圖2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SIRT1轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖(結(jié)晶紫染色)

2.3SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞中Cleaved caspase3/caspase3和p21表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，SITR1過(guò)表達(dá)組Cleaved caspase3/caspase3和p21表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、iNOS、IL-6和IL-10水平及 p-P65蛋白磷酸化的影響

2.4SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞免疫因子表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞上清液中iNOS、IL-6和IL-10含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞上清液中iNOS和IL-6含量明顯降低，IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.5SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞中p-P65表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞中p-P65/P65蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-P65/P65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖4。

圖3 Western印跡檢測(cè)Cleaved caspase3/caspase3和 p21蛋白表達(dá)水平

2.6SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組SOD、MDA和LDH含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組SOD含量明顯降低，MDA和LDH含量水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

2.7SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞ROS活性氧含量水平的影響 與對(duì)照組〔(6.92±2.44)U/ml〕相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞中ROS含量〔(7.48±2.13)U/ml〕無(wú)明顯差異(P>0.05)，SIRT1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞ROS活性氧含量〔(26.67±3.58)U/ml〕明顯增高(P<0.05)。見圖5。

圖4 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞中p-P65/P65 蛋白表達(dá)水平

表3 SIRT1過(guò)表達(dá)對(duì)CAL27細(xì)胞氧化應(yīng)激的 影響

圖5 免疫熒光檢測(cè)各組ROS含量(×400)

3 討 論

研究表明，SIRT1表達(dá)水平對(duì)口腔癌的病理生理改變具有重要影響，SIRT1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)口腔癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，而SIRT1穩(wěn)定表達(dá)或表達(dá)上調(diào)則抑制口腔癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)SIRT1表達(dá)上調(diào)能夠誘導(dǎo)口腔癌上皮細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β介導(dǎo)的口腔癌惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移〔14～16〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SIRT1顯著抑制CAL27細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。

口腔癌的發(fā)生發(fā)展依賴于癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。p21是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族成員之一，p21與腫瘤增殖、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，p21在口腔癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致口腔癌細(xì)胞中G0/G1細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17，18〕。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，上游的caspase-9啟動(dòng)caspase-3并發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔19〕。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)SIRT1顯著上調(diào)p21和caspase-3表達(dá)水平，結(jié)合克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)SIRT1抑制口腔癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

iNOS、IL-6和IL-10是重要的多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化、炎癥、免疫反應(yīng)等，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量研究表明，IL-6通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附力、活動(dòng)力及腫瘤細(xì)胞特異性抗原的表達(dá)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔20〕。Singh等〔21〕發(fā)現(xiàn)，iNOS表達(dá)增加可作為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)，同時(shí)也是口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后指標(biāo)。IL-10是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，具有抗炎癥、免疫抑制、抗衰老等生物學(xué)功能。研究表明，IL-10在口腔癌細(xì)胞中高表達(dá)抑制癌細(xì)胞免疫能力，同時(shí)，IL-10高表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔22〕。p65是天然的參與調(diào)控細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子〔23〕。本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)SIRT1通過(guò)調(diào)節(jié)口腔癌細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)水平參與口腔癌細(xì)胞免疫反應(yīng)。

氧化應(yīng)激與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，SOD是氧自由基清除酶，在氧化與抗氧化平衡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。MDA和ROS是細(xì)胞線粒體損傷和氧自由基積累的主要產(chǎn)物，過(guò)量的MDA和ROS能損壞細(xì)胞正常功能，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。LDH含量水平常作為診斷惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)〔24，25〕。本研究結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)SIRT1通過(guò)誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞CAL27氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使細(xì)胞凋亡。

綜上，過(guò)表達(dá)SIRT1抑制口腔癌細(xì)胞CAL27生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃通過(guò)移植瘤動(dòng)物模型探討過(guò)表達(dá)SIRT1在體外的效果。