胡朋 林捷 王鋒 符燕 符瓊方 吳易晟

(1?？谑腥嗣襻t(yī)院中醫(yī)科，海南 ?？?570208;2湖北省中醫(yī)院急診科;3海南省中醫(yī)院肺病科)

咳嗽變異性哮喘臨床主要癥狀表現(xiàn)為慢性持續(xù)性干咳，多以夜間咳嗽增多為主〔1〕。有研究顯示〔2〕，限制并抑制炎癥反應(yīng)后可改善疾病的臨床癥狀，咳嗽變異性哮喘類似于典型的哮喘發(fā)病機(jī)制，主要與氣管炎癥、致敏、氣道重塑密切相關(guān)。五味子具有益氣生津及安心之功效，臨床中常用于治療久咳虛喘等〔3〕，有學(xué)者在研究中指出〔4〕，五味子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能及特異性體液免疫功能中具有調(diào)理作用。本研究旨在分析五味子提取物對(duì)咳嗽變異性哮喘模型大鼠氣道重塑的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取75只大鼠，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2021-0009)，鼠齡3～5個(gè)月，平均(3.80±0.95)個(gè)月，體重213～256 g，平均(230.80±19.15)g，將大鼠放置室溫23～25℃，濕度40%～70%，自然光照、通風(fēng)的無病原菌干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用的水和食物均經(jīng)消毒。

1.2建模 在75只大鼠中隨機(jī)選取15只作為正常組不做任何處理，其余大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各15只，參照楚慧倫等〔5〕研究實(shí)驗(yàn)中咳嗽變異性哮喘建立方法建立大鼠模型，除正常組外，其余4組均在喂養(yǎng)10 d后將其置于密閉有機(jī)玻璃罩內(nèi)，給予含有1%配制卵清白蛋白(OVA)溶液的生理鹽水進(jìn)行超聲霧化激發(fā)2 min，1次/d，共10 d。模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)豎毛、噴嚏、干嘔、極度煩躁等現(xiàn)象中兩種或兩種以上判定為造膜成功。

1.3給藥 在五味子中提取五味子，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予五味子灌胃5 w，劑量分別為低劑量組(1.0 ml五味子提取物)、中劑量組(1.5 ml五味子提取物)、高劑量組(2.5 ml五味子提取物)，正常組和模型組給予等體積生理鹽水進(jìn)行注射。

1.4病理組織學(xué)觀察 在大鼠灌胃后、禁食不禁水12 h，麻醉處死，觀察其氣道重塑程度，迅速摘取右側(cè)肺下葉組織后立即固定在染色液中，將所制備的大鼠右側(cè)肺下葉組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后，行常規(guī)脫水、透明及石蠟包埋處理，制備厚度為4 μm的組織切片，取主動(dòng)脈組織石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色后封片，顯微鏡下觀察并拍照分析并測(cè)量大鼠管壁厚度、平滑肌厚度。

1.5最大呼氣流量(PEF)、1 s用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)水平檢測(cè) 通過麥邦MSA99肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)PEF、FEV1、FVC。

1.6核因子(NF)-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià) 采用Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟：將頸部組織接種于6孔板中，測(cè)定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組病理組織學(xué)觀察 正常組肺組織鏡下觀察氣管管腔通暢且氣管黏膜上皮未見充血及水腫，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，氣道平滑肌無明顯增生，肺泡結(jié)構(gòu)完整；模型組大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜充血，肺泡塌陷且間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞，氣管腔內(nèi)可見黏液及黏液栓；藥物干預(yù)后，低劑量組、中劑量組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；高劑量組大鼠水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，偶爾可見少量黏液附著，基底膜較薄。見圖1。

2.2各組平滑肌厚度、管壁厚度比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組平滑肌厚度、管壁厚度明顯高于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組平滑肌厚度、管壁厚度明顯低于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組平滑肌厚度、管壁厚度明顯低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組平滑肌厚度、管壁厚度明顯低于中劑量組(P<0.05)。見表1。

2.3各組肺功能比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組PEF、FEV1、FVC水平均顯著低于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組PEF、FEV1、FVC水平顯著高于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組PEF、FEV1、FVC水平顯著高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組PEF、FEV1、FVC水平顯著高于中劑量組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組病理組織學(xué)觀察(HE染色，×100)

表1 各組平滑肌厚度、管壁厚度、肺功能比較

2.4各組NF-κB通路蛋白表達(dá)量比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組抑制蛋白κB(IκB)水平均明顯低于正常組，NF-κB、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)均明顯高于正常組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組IκB水平明顯高于模型組，NF-κB、VEGF明顯低于模型組(P<0.05)；高劑量組、中劑量組IκB水平明顯高于低劑量組，NF-κB、VEGF明顯高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組NF-κB、VEGF明顯低于中劑量組，IκB水平明顯高于中劑量組(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組NF-κB通路蛋白表達(dá)量比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組NF-κB通路蛋白表達(dá)

3 討 論

咳嗽變異性哮喘患者在運(yùn)動(dòng)后咳嗽程度會(huì)有所增加，臨床無感染，長期抗生素治療基本無效〔6〕。如病情長期得不到控制極易出現(xiàn)氣道上皮組織化及氣道壁增厚，咳嗽變異性哮喘類似于典型的哮喘發(fā)病機(jī)制，主要與致敏、氣道重塑及氣道炎癥密切相關(guān)。

五味子被稱為中藥庫中的十大“抗氧化劑”之一，五味子提取物發(fā)揮著心肌保護(hù)作用機(jī)制可能為五味子提取物能抑制過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)及O-2的產(chǎn)生而保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)免受氧自由基損害〔7〕。有研究認(rèn)為〔8〕，五味子還可增強(qiáng)心肌細(xì)胞內(nèi)核糖核酸的作用，有效提高心肌細(xì)胞等活性。另有歷史記載張仲景發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為五味子可有效止咳，多位專家結(jié)合前人經(jīng)驗(yàn)及臨床總結(jié)中發(fā)現(xiàn)五味子具有較好的止咳效果。另有中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為〔9〕，五味子秉酸收之性，有斂肺保腎之功。因其酸斂，則有凝痰、滯邪、聚火之弊。是故五味子所治之咳，乃肺腎不足、元?dú)夂纳⒅?，取其固守金水則喘咳自止〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子提取物可明顯提高氣道重塑作用降低不良事件的發(fā)生，其原因可能與五味子類成分具有明顯的保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)免受氧自由基損害的作用。

氣道重塑主要的病理形態(tài)學(xué)改變是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，在多位學(xué)者實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠肺功能明顯低于其他各組，且肺組織存在炎性細(xì)胞的浸潤及水腫充血、起到平滑肌肥大、增生及上皮細(xì)胞脫落、基底膜增厚等氣道重塑的病理表現(xiàn)，提示著咳嗽變異性哮喘存在氣道重塑〔11～13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，采用五味子提取物對(duì)其治療后，各組大鼠的肺功能均得到有效改善效果氣道重塑現(xiàn)象明顯減輕，其中高劑量組的大鼠恢復(fù)效果極佳。另有學(xué)者認(rèn)為〔14～16〕，五味子提取物可有效減輕氣道炎癥及肺組織充血、浸潤及炎性細(xì)胞水腫。研究指出〔17〕，五味子提取物可有效減少氣管周圍膠原沉積，影響氣道重塑。本研究說明，干預(yù)咳嗽變異性哮喘大鼠氣道重塑可能是五味子提取物治療的作用之一，有效改善大鼠肺功能水平。

NF-κB信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，影響細(xì)胞的分化、增殖及凋亡〔18〕。NF-κB屬于一種與炎性反應(yīng)關(guān)系密切的通路分子，當(dāng)體內(nèi)的NF-κB信號(hào)傳播途徑被激活以后，IκB蛋白會(huì)發(fā)生水解釋放出NF-κB蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中參與對(duì)下游基因VEGF蛋白的表達(dá)〔19～21〕。以上研究證明，NF-κB信號(hào)通路可參與調(diào)節(jié)肺功能損傷后的過程，IκB在咳嗽變異性哮喘大鼠中表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，NF-κB、VEGF在咳嗽變異性哮喘大鼠中則表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致，說明NF-κB通路可在疾病發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，并通過抑制NF-κB通路可快速抑制炎性因子的生長。