張玉東 吳仁愿 趙怡 滕飛 何毅 陳沖 王亮 王忠誠

(1徐州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 徐州 221004；2中國礦業(yè)大學安全工程學院；徐州醫(yī)科大學；3影像學院；4醫(yī)學信息學院；5基礎醫(yī)學院)

缺血性腦卒中是由于各種原因引起的腦組織局部供血減少或中斷導致的缺血缺氧性改變，缺血組織出現(xiàn)相應區(qū)域神經功能缺損癥狀的臨床表現(xiàn)。該病好發(fā)于老年人，男性多于女性。在全球范圍內，缺血性腦卒中約占腦卒中總發(fā)生率的84%〔1〕，而腦卒中則是導致死亡的疾病及導致殘疾的主要因素〔2〕。臨床上缺血性腦卒中的治療方案有改善腦血循環(huán)(包括靜脈溶栓、血管內治療、抗血小板、抗凝、降纖等)、他汀藥物、神經保護及行為康復治療，目的是迅速恢復缺血區(qū)的血供，挽救缺血半暗帶，緩解腦組織缺血缺氧引起的神經功能損害癥狀和體征。

中藥在缺血性腦卒中的臨床治療中發(fā)揮重要作用。一些復方注射液具有活血化瘀、抗血小板聚集、擴張血管改善腦微循環(huán)和清除氧自由基等功效，對缺血性腦卒中治療、預防及改善患者的神經功能損傷〔3〕均有一定的作用。紅花作為一味重要的傳統(tǒng)中藥材，味辛性溫，歸心經、肝經，具有活血通經、祛瘀止痛等功效，常用于治療痛經閉經、跌打損傷和缺血性心血管疾病〔4,5〕。紅花含有多種化學成分，如槲皮素、木脂素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、黃芩苷、羥基紅花黃色素A等。近年來，對紅花、羥基紅花黃色素A及紅花黃色素等有效成分的效用、作用靶點及作用機制進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)紅花及其有效成分羥基紅花黃色素A具有抗炎癥〔6〕、抗凝〔5，7〕、抗氧化〔8〕、抗腫瘤〔9〕、抗腦缺血再灌注損傷及保護神經元〔10〕等藥理作用，且紅花黃色素被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療心絞痛等缺血性心臟病。雖然，臨床上已將紅花注射液應用于治療缺血性腦卒中，但總體的機制還不是很明確。利用網絡藥理學技術構建多層次網絡模型，從整體角度對中藥進行解析，已成為一種科學解釋中藥有效性和科學性的新策略。因此，本研究基于網絡藥理學的方法，探討紅花治療缺血性腦卒中的作用靶點和相關信號通路，為精確探討其作用機制和藥效物質基礎提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1紅花活性成分及作用靶點篩選 聯(lián)合應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索紅花的所有活性成分，篩選出符合條件〔口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18〕的候選化學成分及其對應靶點；結合文獻報道的紅花有效成分，在有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem)和中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)查找羥基紅花黃色素A、紅花黃色素A、紅花黃色素B、紅花醌苷A、紅花醌苷B、脫水紅花黃色素B、紅花素、紅花酮和6-羥基山奈酚等成份的化學結構和預測靶點。最后，借助 UniProt 數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)查詢靶點對應基因名的簡稱。

1.2缺血性腦卒中疾病靶點篩選 GeneCards(https：//www.genecards.org)和OMIM(https：//www.omim.org)數(shù)據(jù)庫中設置檢索詞為“ischemic stroke”和“ischemia reperfusion injury”，檢索缺血性腦卒中疾病相關靶點，并應用 Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)對疾病靶點進行標準化，獲得 Swiss-Prot ID。

1.3紅花活性成分作用靶點與疾病靶點的交集篩選 應用 R 語言軟件(版本3.6.1)及 Perl 語言程序(版本5.34.0)將疾病靶點與藥物靶點取交集，得到紅花-缺血性腦卒中交集靶點。

1.4紅花活性成分-缺血性腦卒中-靶點網絡構建 利用Cytoscape3.7.1軟件的merge功能構建紅花活性成分-缺血性腦卒中-靶點(基因)網絡。網絡圖中“node”代表活性成分和靶點，“edge”代表活性成分-缺血性腦卒中-靶點之間的相互關系?；跇嫿ǖ木W絡探討紅花治療缺血性腦卒中的潛在機制。

1.5蛋白相互作用網絡構建 將1.3中得到的紅花-缺血性腦卒中交集靶點導入 String(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)平臺，構建共同靶點蛋白相互作用(PPI) 網絡，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，Settings設為“high confidence：0.4”，去除離散的結點，其他參數(shù)保持默認設置，獲得 PPI 網絡。利用R 語言軟件的插件count.R對獲得的PPI 網絡數(shù)據(jù)進行蛋白靶點出現(xiàn)頻次的分析。

1.6GO分析和KEGG通路富集分析 應用R語言軟件插件(clusterProfilerGO.R)及 Perl 語言對紅花活性成分與缺血性腦卒中的共同靶點進行GO分析；應用插件 (clusterProfilerKEGG.R)進行 KEGG 通路富集分析，并利用R 語言軟件對其分析結果進行可視化。根據(jù)富集因子值分析富集程度，探究紅花治療缺血性腦卒中可能的生物功能及信號通路機制。

2 結 果

2.1紅花活性成分及作用靶點篩選結果 通過TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對紅花組成藥物已報道的活性成分進行檢索、并以OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選；同時，根據(jù)文獻報道的成分在PubChem數(shù)據(jù)庫中進行結構查找并在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中進行檢索，去掉重復成分后最終得到22個有效活性成分，靶點共220個。紅花的22個活性成分和分子編號分別為：木脂素(MOL002695)、除蟲菊酯Ⅱ(MOL002710)、6-羥基山奈酚(MOL002712)、黃芩素(MOL002714)、qt_紅花醌苷(MOL002717)、7,8-二甲基-1H-嘧啶并〔5,6-g〕喹喔啉-2,4-二酮(MOL002757)、六羥基黃酮(MOL002721)、黃芩苷(MOL002776)、β-谷甾醇(MOL000358)、山奈酚(MOL000422)、豆甾醇(MOL000449)、木犀草素(MOL000006)、CLR(MOL000953)、 槲皮素(MOL000098)、紅花紅色素(MOL002780)、β-胡蘿卜素(MOL002773)、羥基紅花黃色A (MOL002690)、Saffloquinoside A(45276863)、Saffloquinoside B(101501319)、Kinobeon-A(MOL002694)、紅花黃色素B( 101241647)、 脫水紅花黃色素B (102240413)。對應的靶點數(shù)目較多的活性成分依次為：槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩素、羥基紅花黃色素A、紅花紅色素、紅花黃色素B和紅花醌苷B。

2.2缺血性腦卒中靶點 通過檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫并設置Relevance score≥5.0篩選，刪去重復靶點，共得到1 072個缺血性腦卒中的治療靶點。

2.3紅花-缺血性腦卒中交集靶點篩選結果 應用R語言軟件及Perl語言程序分析1 072個缺血性腦卒中治療靶點與220個紅花活性成分作用靶點，共篩選出100個共同靶點。

2.4紅花-活性成分-靶點-缺血性腦卒中網絡 通過Cytoscape 3.7.1 軟件構建“紅花-活性成分-作用靶點-缺血性腦卒中”網絡，如圖1所示。有效化學成分中，按作用靶點數(shù)從高到低排序依次為：槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡蘿卜素、黃芩苷、羥基紅花黃色素A、紅花紅色素、紅花黃色素B和紅花醌苷B。這些可能是紅花治療缺血性腦卒中的關鍵化學成分。其中，羥基紅花黃色素A、紅花紅色素、紅花黃色素B和紅花醌苷B的作用靶點都基本相似，包括谷胱甘肽還原酶(GSR)、腺苷A2A受體(ADORA2A)、微管相關蛋白(MAP)2、單胺氧化酶(MAO)B、短鏈?；o酶A脫氫酶(ACADS)、MAOA、微管相關tau蛋白(MAPT)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ENPP)1、黃嘌呤脫氫酶(XDH)和一氧化氮合酶(NOS)1等。

2.5PPI網絡的構建結果 運用 String 在線數(shù)據(jù)平臺對紅花-缺血性腦卒中交集靶點進行分析，在“high confidence：0.4”模式下構建出的PPI 網絡。應用 count.R 插件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次居前 30 位的蛋白靶點(頻次)依次為：絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)1(76次)、白蛋白(ALB，75次)、白細胞介素(IL)-6(68次) 、腫瘤壞死因子(TNF，67次)、血管內皮生長因子(VEGF)A(62次)、胱天蛋白酶(CASP)3(61次)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)8(60次)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1(55次)、環(huán)加氧酶(PTGS)2(54次)、表皮細胞生長因子受體 (EGFR，53次)、FOS(53次)、NOS3(51次)、基質金屬蛋白酶(MMP)9(50次)、MYC(47次)、IL-10(45次)、MMP2(45次)、血紅素加氧酶(HMOX)1(44次)、雌激素受體(ESR)1(42次)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG,42次)、細胞周期蛋(CCN)D1(41次)、胱天蛋白酶(CASP8,40次)、細胞間黏附分子(ICAM)1(40次)、IL-4(40次)、APP(38次)、轉化生長因子(TGF)B1(38次)、Bcl2樣蛋白(Bcl2L)1(37次)、髓過氧化物酶(MPO,37次)、RELA(37次)、小窩蛋白(CAV)1(36次)和干擾素γ(IFNG,36次)。出現(xiàn)頻次較高的有ALB、AKT、IL6、TNF、VEGFA、FOS、CASP3、EGF、MAPK8和NOS3等，可作為紅花治療缺血性腦卒中的潛在靶點。

圖1 紅花-有效成分-作用靶點-IS網絡

2.6紅花治療缺血性腦卒中GO分析及核心通路篩選共同靶點 對100個紅花-缺血性腦卒中交集靶點基因進行生物學過程富集(GO)分析，分別選取P值較小的前20位作可視化展示，得到的氣泡圖見圖2。其中，主要富集過程涉及蛋白磷酸酶2A結合、細胞因子受體結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合、黃素腺嘌呤二核苷酸結合、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、DNA結合轉錄因子結合、兒茶酚胺結合、血紅素結合、半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡過程、四吡咯結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、信號受體激活劑活性、生長因子活性、氧化還原酶活性(分子氧的摻入或還原)、抑制轉錄因子結合、內肽酶活性、激活轉錄因子結合、細胞因子活性和腫瘤壞死因子受體超家族結合等。這表明紅花可能通過調控多個復雜的生物過程治療缺血性腦卒中。

圖2 紅花-缺血性腦卒中交集基因GO功能 富集結果(氣泡圖)

通過對紅花-缺血性腦卒中交集靶點基因進行 KEGG 通路富集分析的氣泡圖的結果見圖3。節(jié)點大小表示富集的靶點數(shù)量，節(jié)點顏色由紅色至深藍色表示P值由小到大，因此紅色節(jié)點越大表示信號通路的顯著性越高，該條信號通路越重要。篩選出富集基因數(shù)居前20 位的通路，主要分布在流體剪應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、細胞凋亡、結直腸癌、乙型肝炎、IL-17信號通路、胰腺癌、癌癥中的蛋白多糖、肺結核、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、凋亡(多物種)、C型凝集素受體信號通路、丙型肝炎和瘧疾等多條信號通路中，提示紅花通過作用于多條信號通路治療缺血性腦卒中。

圖3 紅花-缺血性腦卒中交集基因KEGG通路富集 分析結果(氣泡圖)

3 討 論

本研究通過構建PPI網絡并預測潛在靶點，分析出紅花治療缺血性腦卒中的關鍵靶點主 要為 ALB、AKT、IL6、TNF、VEGFA、FOS、CASP3、EGF、MAPK8和NOS3等；KEGG 富集通路分析發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路、細胞凋亡、IL-17信號通路、HIF-1信號通路和動脈粥樣硬化等多條關鍵通路與紅花治療缺血性腦卒中顯著相關，這表明紅花治療缺血性腦卒中的作用機制呈多成分、多靶點、多通路且相互關聯(lián)的特點。

腦組織在供血減少或者中斷后，缺血缺氧是引發(fā)組織損傷的直接原因，細胞凋亡在腦卒中缺血半暗帶的細胞生物學活動中起著關鍵作用。處于缺血半暗帶中的細胞由許多促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達共同決定細胞命運。在這些信號蛋白中，促凋亡蛋白Bax的上調和抗凋亡Bcl-2的下調會導致神經元凋亡。同時，Caspase-3位于Bax/Bcl-2的下游，并在凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。降低Bax/Bcl-2的比值，阻斷Caspase-3誘導的細胞凋亡能夠保護缺血性腦卒中缺血半暗帶中的神經元〔11〕。

短暫性缺血后，腦組織恢復血液和氧氣供應產生過量活性氧(ROS)和活性氮(RNS)自由基，攻擊重新獲得血液供應的組織內的細胞造成組織缺血再灌注損傷。自由基產生細胞氧化損傷的毒性，誘發(fā)炎癥反應，破壞血腦屏障，從而引起腦組織的水腫。在缺血性腦卒中的急性期，自由基觸發(fā)血管源性水腫，VEGF-A表達增高，MMP表達上調，VEGF-A誘導血腦屏障通透性增加；由于內皮細胞的細胞間連接斷裂和血管滲漏，VEGF-A參與了腦水腫的發(fā)展。晚期增加的VEGF-A又促進神經元保護、功能恢復和血管生成〔12〕。

PI3K與生長因子受體(如EGFR)結合后，可改變絲氨酸/AKT的蛋白結構并使其活化，從而以磷酸化形式作用于下游一系列底物，如改變凋亡相關蛋白Bad、Caspase活性，從而調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡及遷移等生物學過程。黃芩素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素等成分可作用于AKT，調節(jié)發(fā)生缺血的腦組織細胞中葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、轉錄和細胞遷移等生物學功能。

PI3K/Akt下游靶點是雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，而mTOR的下游轉錄因子則包括了HIF1α、c-Myc等分子。PI3K/AKT/mTOR信號途徑能夠促進HIF-1α的表達及穩(wěn)定。HIF-1α在體內普遍表達，在多種腫瘤、炎癥及缺血缺氧性疾病的細胞中過表達。腦組織對低氧十分敏感，氧濃度降低可誘導腦組織中HIF-1α表達顯著增加，從而促進神經細胞的凋亡，加重腦組織的損傷，這可能與HIF-1α過表達誘導了促凋亡調節(jié)蛋白Bcl2的表達有關。HIF-1α表達水平增高還會促進BNIP3的表達，調控自噬體的形成與成熟，介導了非Caspase依賴性細胞凋亡〔13〕。在發(fā)生缺氧或炎癥時，HIF-1α水平增加，啟動下游基因的轉錄表達，如VEGF〔14〕，并激活HIF-1α/VEGF信號通路，從而誘導血管生成。VEGF的產生能夠負反饋調節(jié)HIF-1α。有研究表明，缺氧能夠誘導內皮細胞產生大量的TNFα，而通過下調TNF的受體阻斷TNFα/NF-κB/HIF/VEGF通路減輕缺氧誘導的血管生成〔15〕。

缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展進程中也會出現(xiàn)明顯的炎癥和免疫反應。大鼠永久性中腦動脈栓塞(MCAO)可誘導缺血半球IL-6 mRNA表達和IL-6生物活性〔16〕；缺血損傷也增加了大腦皮質TNFα mRNA的表達，是缺血性神經炎癥反應的一部分。Aliena-Valero等〔17〕在小鼠缺血性腦卒中的模型中發(fā)現(xiàn)，內源性 IL-6能夠促進STAT3磷酸化，從而可以通過激活神經元中的IL-6/STAT3途徑、抑制VEGF-A/MMP-9信號的來保護神經，減輕腦損傷〔18〕。作為一種促炎細胞因子，IL-17在缺血性腦卒中的急性期其mRNA和蛋白表達均上調，過度表達可能與治療效果較差相關，表達降低與小鼠運動功能改善有關〔19〕，IL-17作為預后不良的重要指標。Sun等通過敲除小鼠IL-17有助于上調PI3K/AKT通路，激活神經干細胞，促進缺血性腦卒中后的神經再生，但梗死面積增加；通過上調AKT/GSK-3β和Wnt/β-catenin通路，從而對神經發(fā)生起到保護作用〔20〕。

缺血性腦卒中的病理機制十分復雜，涉及炎癥反應、氧化應激、線粒體損傷、細胞凋亡和興奮性氨基酸的毒性等許多生物學過程。而紅花的有效成分較多，可作用于AKT、IL6、TNF、VEGFA、CASP3和NOS等多靶點。運用網絡藥理學的方法發(fā)現(xiàn)紅花的有效成分通過PI3K/AKT、IL-6/STAT3、HIF-1α/VEGF、AKT/GSK-3β和Wnt/β-catenin信號通路及多通路間相互交叉、關聯(lián)，是以多成分、多靶點、多通路特點的藥理機制網絡模式抑制細胞凋亡、保護神經元、促進神經元再生，減輕腦損傷、改善神經功能缺損及降低腦卒中復發(fā)率，達到疾病治療和二級預防的效果。既往的研究對羥基紅花黃色素A的關注較多，有關槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分與缺血性腦卒中的相關性研究還很少，這為進一步的實驗探討提供了新方向。