譚滿勝，謝清豐，唐玉芬，陳紅玲

（1. 茂名市婦幼保健院遺傳優(yōu)生優(yōu)育科，廣東 茂名 525000 ；2. 茂名市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 茂名 525000）

稽留流產(chǎn)是指胚胎、胎兒死亡后未完全排出體外，仍在宮腔內(nèi)有滯留的一種特殊情況自然流產(chǎn)，因此又被稱為過期流產(chǎn)[1]?；袅鳟a(chǎn)是婦科的常見病之一，在臨床妊娠中其發(fā)生率約占16%，而近年來由于環(huán)境、社會等因素的改變，其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢[2]。因此明確稽留流產(chǎn)病因就顯得尤為重要，其可有利于為患者提供更科學(xué)、更全面的再生育風(fēng)險指導(dǎo)，并可顯著減輕患者的心理負(fù)擔(dān)。而稽留流產(chǎn)的致病因素較為復(fù)雜，與自身、社會、環(huán)境中的多個因素有關(guān)，但近年來有研究表明其中胚胎或胎兒染色體異常是最為常見的因素，可達(dá)60%[3]。此外，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測染色體的方法也逐漸多樣化，但多數(shù)檢測手段局限性較大，所以目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的工作重點(diǎn)之一就是探尋一種更有效，更便捷的染色體檢測方法。染色體拷貝數(shù)變異測序（Copy Number Vara- ition sequencing ，CNV-seq ）檢測是通過高通量測序技術(shù)來獲取樣本準(zhǔn)確的基因信息，再通過生物信息分析有效發(fā)現(xiàn)染色體畸變的一種新型檢測手段。其具有分辨率高、兼容性好、流程簡單易操作等優(yōu)點(diǎn)，可檢測絨毛組織、外周血 、臍血等樣本[4]。因此，本文就CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產(chǎn)的診斷價值進(jìn)行分析，為相關(guān)臨床檢測及病因分析提供理論基礎(chǔ)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

對2019 年1 月至2021 年3 月期間來本院就診并采用CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變的175 例稽留流產(chǎn)患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其年齡22 ～45 歲，孕周7 ～13 周，孕次1 ～4 次，產(chǎn)次0 ～3次；其中首次流產(chǎn)者35 例，連續(xù)兩次自然流產(chǎn)者80 例，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者60 例?；颊呒凹覍僮栽附邮軝z測并簽署知情同意書，研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（符合相關(guān)倫理標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為稽留流產(chǎn)的患者；有陰道流血、閉經(jīng)史、腹痛及血、尿HCG 呈陽性的患者；簽署同意書的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有HIV 的患者；有精神病或精神病史的患者；有嚴(yán)重肝腎、心腦血管疾病的患者；有孕期感染的患者。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

CNV-seq 專用試劑盒、BES4000 高通量測序平臺和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（均為博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)）。

1.4 檢測方法

1）絨毛組織收集及送檢：對患者的外陰、陰道、宮頸進(jìn)行消毒后，收集其流產(chǎn)絨毛組織，取約60g 放入生理鹽水中漂洗至無血液成分，然后放入裝有生理鹽水的10mL 離心管密封后連同檢測申請單一起送至廣東省婦幼保健院進(jìn)行檢測。2）CNV-seq 檢測流程：對送檢的絨毛組織用CNV-seq 專用試劑盒提取基因組DNA 并進(jìn)行DNA 建庫，用BES4000 高通量測序平臺進(jìn)行測序，最后對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析并判斷結(jié)果，詳見圖1。

圖1 CNV-seq 檢測流程圖

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq 檢測結(jié)果

175 例患者中，成功檢測173 例，失敗2 例（樣本質(zhì)量差，做退費(fèi)處理），檢測成功率為98.86%，檢測出染色體畸變108 例，陽性檢出率為62.43%（108/173）。

2.2 CNV-seq 陽性數(shù)目異常檢測結(jié)果

在染色體畸變中，陽性數(shù)目異常共91 例，其中包括特納綜合征6 例，同源二倍體6 例，三倍體15 例，2- 三體2 例，3- 三體5 例，22- 三體10 例等，詳見表1。

表1 CNV-seq 陽性數(shù)目異常檢測結(jié)果

2.3 CNV-seq 陽性其他異常檢測結(jié)果

染色體畸變除去單純的數(shù)目異常外，其他異常共17 例，其中包括復(fù)合異常類/ 嵌合類8 例，占7.41%（8/108），缺失類/ 重復(fù)類9 例，占8.33%（9/108），詳見表2。

表2 CNV-seq 陽性其他異常檢測結(jié)果

3 討論

自從進(jìn)入工業(yè)時代，自然環(huán)境被破壞得越來越嚴(yán)重，環(huán)境也隨之被污染，同時現(xiàn)代社會各方面競爭極為激烈，使得社會壓力越來越大，在這兩重因素促使下，稽留流產(chǎn)的發(fā)生率也隨之升高[5]?；袅鳟a(chǎn)是孕早期引起自然流產(chǎn)的主要原因之一，而患者的年齡、內(nèi)分泌、感染、遺傳等自身因素同樣會導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生?；袅鳟a(chǎn)若不及時治療，嚴(yán)重時甚至?xí){孕婦生命，因此，對稽留流產(chǎn)早預(yù)防、早診斷并明確其病因就顯得尤為重要[6-7]。有報道顯示，染色體異常是引起胚胎停育的主要原因，所以可通過對流產(chǎn)物進(jìn)行遺傳學(xué)檢測的方法來明確流產(chǎn)原因[8]。CNV-seq是一種新型染色體畸變檢測手段，其已被研究證實(shí)在疑似染色體疾病患者的染色體異常檢測、流產(chǎn)原因排查、產(chǎn)前診斷等方面具有較高的應(yīng)用價值[9]。因此，本文就CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產(chǎn)的診斷價值進(jìn)行分析，為相關(guān)臨床檢測及病因分析提供參考。

本文研究發(fā)現(xiàn)，175 例患者中，成功檢測173例，失敗2 例，檢測成功率為98.86%，檢測出染色體畸變108 例，陽性檢出率為62.43%；在染色體畸變中，陽性數(shù)目異常共91 例，其中包括特納綜合征6 例，同源二倍體6 例，三倍體15 例，2- 三體2 例，3- 三體5 例，22- 三體10 例等。其他異常共17 例，其中包括復(fù)合異常/ 嵌合類8 例，占7.41%（8/108）；缺失類/ 重復(fù)類9 例，占8.33%（9/108）。這說明CNV-seq 的異常檢出率較高，不僅可以檢測一般的染色體數(shù)目異常、缺失和重復(fù)，而且對染色體微缺失、微重復(fù)的檢測具有較高的敏感性，具有染色體核型分析無法比擬的優(yōu)勢，另外對于一定比例的嵌合體和一些復(fù)合類的異常也有較高的檢出率。本次研究中，有2 例樣本檢測失敗，經(jīng)反饋為標(biāo)本質(zhì)量差，原因一方面可能與樣本的取材不當(dāng)有一定的關(guān)系，一方面可能與樣本保存不當(dāng)或者長途運(yùn)輸歷時過長造成標(biāo)本質(zhì)量下降有關(guān)。因此，CNV-seq 檢測除了做好檢測中、檢測后的質(zhì)量控制，檢測前的質(zhì)量控制例如準(zhǔn)確取樣、正確保存、縮短轉(zhuǎn)運(yùn)時間等也是檢測成功不可忽視的重要環(huán)節(jié)。

目前對于稽留流產(chǎn)的遺傳學(xué)檢測手段很多，如G顯帶染色體核型分析、基因芯片法技術(shù)、多重探針擴(kuò)增技術(shù)等，但其檢測時間長，操作復(fù)雜，對樣本要求高，這極大提高了技術(shù)難度及成本，限制其在臨床中的廣泛應(yīng)用[10]。CNV-seq 是通過高通量測序技術(shù)來幫助臨床逐漸明確各種染色體拷貝數(shù)變異與疾病關(guān)聯(lián)的遺傳學(xué)檢測技術(shù)，與其他檢測手段相比，其具有通量高、操作簡單易上手、檢測周期短、樣本要求低等優(yōu)點(diǎn)，其明顯更具優(yōu)勢。CNV-seq 最小可檢測到100kb的CNV，這極大提高了基因組的陽性檢出率及不平衡異常的檢出率，打破了疾病研究過程中的通量限制[11]。同時其超高的精準(zhǔn)性還可以使假陽性率顯著降低，不過目前CNV-seq 檢測還存在一些局限，如不能檢出染色體平衡易位、倒位等，但相信隨著對其技術(shù)的深入研究及資料的不斷累積，CNV-seq 檢測將會為臨床提供更客觀、更準(zhǔn)確的診斷信息。

范寶光等[12]的研究表明，通過高通量基因測序技術(shù)檢測稽留流產(chǎn)絨毛組織染色體差別，對53 例患者檢測均成功，其中19 例染色體未見異常，27 例染色體數(shù)目異常，7 例染色體結(jié)構(gòu)異常，這說明高通量基因測序技術(shù)能發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)絨毛染色體微小結(jié)構(gòu)異常。趙少翠等[13]的研究表明，對孕早期胚胎稽留流產(chǎn)絨毛應(yīng)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)診斷分析，除了可以檢測染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常，還可以檢測100kb 以上的染色體微缺失、微重復(fù)，同時其可有效提高臨床診斷準(zhǔn)確性，促使臨床醫(yī)生為患者提供更科學(xué)的再生育風(fēng)險評估指導(dǎo)。研究[14-15]表明，高通量測序技術(shù)可有效檢測出稽留流產(chǎn)患者絨毛組織的染色體異常。這說明高通量測序技術(shù)具有較好的技術(shù)優(yōu)勢，可為臨床診斷及治療提供依據(jù)，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，CNV-seq 檢測絨毛組織染色體畸變對稽留流產(chǎn)具有較高的診斷價值，在明確稽留流產(chǎn)遺傳學(xué)病因、預(yù)防疾病、減輕患者負(fù)擔(dān)、為再孕夫婦提供指導(dǎo)等方面都具有重要意義，值得臨床應(yīng)用及推廣。