黎文濤，伍小瓊，王正根

（1. 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421000；2. 岳陽市人民醫(yī)院，湖南師范大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 岳陽 414000）

二十二碳六烯酸（DHA）是一種人體必需脂肪酸，屬于w-3 多不飽和脂肪酸[1]。近年來，有研究表明，w-3 多不飽和脂肪酸能夠?qū)η傲邢侔⒔Y(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制，對腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，還能夠增強(qiáng)藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果[2]。本研究分析了DHA 對人胰腺癌細(xì)胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

購買上海長海醫(yī)院的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、Patu8988，上海西唐生物科技有限公司的兔抗人Bcl-2、COX-2，Beckman Coulter Company 的羊抗兔熒光二抗，Hyclone 公司的RPMI1640 培養(yǎng)基，美國Sigma公司的DHA（純度為98%）。將DHA 用無水乙醇稀釋至100 mg/mL，充氮，避光儲存在-80℃的溫度下備用。用RPMI1640 培養(yǎng)液稀釋DHA 為不同濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在RPMI1640 培養(yǎng)基（鏈霉素100 IU/mL+ 青霉素100 IU/mL+ 丙酮酸鈉1 mmol/L+ 谷氨酰胺2 mmol/L+10% 新生牛血清）中常規(guī)培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、Patu8988，培養(yǎng)于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5%CO2）中，待細(xì)胞生長到70% ～80% 融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在此過程中充分利用0.25% 胰酶消化細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用指數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 胰腺癌細(xì)胞增殖檢測 運(yùn)用MTT 法進(jìn)行檢測，將指數(shù)生長期的SW1990、Patu8988 細(xì)胞收集起來，計(jì)數(shù)后適當(dāng)稀釋，將細(xì)胞懸液制作出來，細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，在96 孔培養(yǎng)板中接種，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后將濃度為0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的DHA 培養(yǎng)液更換過來。將0.05% 無水乙醇+ 等量培養(yǎng)液加入濃度為0 μg/mL 的DHA 培養(yǎng)液中。在37℃孵育箱（5%CO2）中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，然后將20 μL MTT（5 mg/mL）加入各孔，繼續(xù)孵育4 h，將上清液棄去，將130 μL 二甲基亞砜加入，微震蕩5 ～10 min，充分溶解孔底的結(jié)晶物，采用酶標(biāo)儀對每孔吸光度值（A490）進(jìn)行測定，每個(gè)濃度設(shè)定6 個(gè)平行孔。

1.2.3 胰腺癌細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將指數(shù)生長期的SW1990、Patu8988 細(xì)胞收集起來，在培養(yǎng)瓶中接種，細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的DHA 培養(yǎng)液更換過來，分別作用24 h、48 h、72 h 后，將細(xì)胞收集起來，PBS 洗滌2 次，將2 mL 70%乙醇（預(yù)冷）加入其中，在4℃的溫度下固定過夜。離心后將固定液除去，用PBS 洗滌，室溫下用碘化丙啶溶液（碘化丙啶胺50 mg/L+RNA ase A 50 mg/L+EDTA 0.1 mmol/L+0.1% Triton X-100+PBS）避光染色所得細(xì)胞30 min，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布進(jìn)行分析，激發(fā)、檢測光波長分別為488 nm、610 nm。

1.2.4 Bcl-2、COX-2 表達(dá)檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將指數(shù)生長期的SW1990、Patu8988 細(xì)胞收集起來，在培養(yǎng)瓶中接種，細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將0 μg/mL、50 μg/mL 的DHA 培養(yǎng)液更換過來。作用24 h 后，將細(xì)胞收集起來，PBS 洗滌，將4% 多聚甲醛加入，室溫下靜置15 min ；PBS 洗 滌，將0.1% Triton X-100 加 入，懸浮15 min ；PBS 洗滌，分測定管、同型管，將兔抗人Bcl-2、COX-2 一抗加入測定管中，室溫下靜置15 min ；PBS 洗滌，將一抗洗去，將羊抗兔熒光二抗加入測定管、同型管中，室溫下避光染色15 min ；PBS洗滌，將二抗洗去，在PBS 中懸浮細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對Bcl-2、COX-2 表達(dá)水平、蛋白熒光值的變化進(jìn)行測定，激發(fā)、檢測波長分別為492 nm、520 nm，每組設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用±s表示，用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24h、48h、72h人胰腺癌細(xì)胞存活率的比較

0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人胰腺癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞的存活率均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸降低（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人胰腺癌細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

表1 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人胰腺癌細(xì)胞存活率的比較（%，±s）

人胰腺癌細(xì)胞DHA濃度 24 h 48 h 72 h SW 1990細(xì)胞0 μg/mL 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 2.5 μg/mL 94.98±7.06 89.64±3.70 89.47±9.17 5 μg/mL 83.70±3.63 83.91±9.13 82.52±5.93 10 μg/mL 80.81±7.10 75.70±7.80 74.50±9.31 20 μg/mL 69.42±5.02 61.60±9.44 59.30±5.38 50 μg/mL 46.02±7.68 25.70±5.60 21.70±6.22 Patu 8988細(xì)胞0 μg/mL 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 2.5 μg/mL 87.35±7.90 82.03±8.04 79.87±7.42 5 μg/mL 82.80±7.46 75.54±6.28 68.44±6.94 10 μg/mL 76.26±9.32 69.32±6.96 56.88±3.94 20 μg/mL 46.20±6.26 36.96±4.06 26.18±2.90 50 μg/mL 46.08±5.98 35.91±2.90 26.02±3.17

2.2 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24h、48h、72h人胰腺癌細(xì)胞凋亡率的比較

0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人 胰 腺 癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞的凋亡率均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸升高（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人胰腺癌細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

表2 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人胰腺癌細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

人胰腺癌細(xì)胞DHA濃度 24 h 48 h 72 h SW 1990細(xì)胞0 μg/mL 0.47±0.12 0.29±0.09 0.48±0.13 10 μg/mL 0.68±0.14 0.78±0.14 0.87±0.13 20 μg/mL 0.88±0.12 1.08±0.30 2.36±0.32 50 μg/mL 3.05±1.01 7.68±1.26 13.65±2.47 0 μg/mL 0.30±0.09 0.51±0.12 0.59±0.12 10 μg/mL 0.78±0.16 3.01±1.00 13.62±2.32 20 μg/mL 2.36±0.24 5.78±1.36 26.45±4.25 50 μg/mL 19.75±3.25 35.32±5.46 53.15±8.69 Patu8 988細(xì)胞

2.3 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)48h 人胰腺癌細(xì)胞周期分布的比較

0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)48 h 人 胰 腺 癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞的G0～G1期、G2～M 期細(xì)胞占比均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸升高（P＜0.05），S 期細(xì)胞占比均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸降低（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h 人胰腺癌細(xì)胞周期分布的比較（%，±s）

表3 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h 人胰腺癌細(xì)胞周期分布的比較（%，±s）

人胰腺癌細(xì)胞DHA濃度 G0～G1期 S期 G2～M期SW 1990細(xì)胞0 μg/mL 66.62±9.45 26.86±4.26 4.23±1.25 10 μg/mL 68.75±9.36 25.54±4.32 6.56±1.25 20 μg/mL 71.14±9.25 22.15±3.26 7.65±1.85 50 μg/mL 74.42±9.26 16.86±2.36 8.56±1.63 0 μg/mL 36.86±6.45 54.35±9.47 8.65±1.56 10 μg/mL 44.05±7.32 46.03±7.56 8.85±1.42 20 μg/mL 45.03±7.65 44.06±7.14 11.75±1.96 50 μg/mL 54.75±9.25 17.02±2.36 28.03±4.26 Patu 8988細(xì)胞

2.4 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24h 人胰腺癌細(xì)胞Bcl-2、COX-2 表達(dá)的比較

0 μg/mL 的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)24 h 人 胰 腺 癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞Bcl-2、COX-2 的表達(dá)水平、蛋白熒光值均高于50 μg/mL（P＜0.05）。見表4。

表4 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 人胰腺癌細(xì)胞Bcl-2、COX-2 表達(dá)的比較（±s）

表4 不同濃度DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 人胰腺癌細(xì)胞Bcl-2、COX-2 表達(dá)的比較（±s）

人胰腺癌細(xì)胞 DHA濃度 Bcl-2 COX-2表達(dá)水平 蛋白熒光值 表達(dá)水平 蛋白熒光值SW1990細(xì)胞 0 μg/mL 4.27±0.37 0.62±0.02 86.60±0.07 4.51±0.37 50 μg/mL 0.90±0.15 0.47±0.05 45.96±6.82 1.77±0.22 Patu8988細(xì)胞 0 μg/mL 2.58±0.24 0.47±0.11 83.88±5.25 2.91±0.25 50 μg/mL 1.52±0.20 0.38±0.10 37.48±6.74 0.93±0.02

3 討論

有研究[3]表明，DHA 會顯著抑制人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、Patu8988 的增殖，同時(shí)還會對胰腺癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，途徑可能為下調(diào)Bcl-2、COX-2 表達(dá)。本研究的結(jié)果表明，0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)24 h、48 h、72 h人胰腺癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞的存活率均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸降低（P＜0.05），0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)24 h、48 h、72 h 人 胰 腺 癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞的凋亡率均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸升高（P＜0.05）。這說明，DHA 等w-3 多不飽和脂肪酸能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞生長進(jìn)行抑制，DHA 可對SW1990、Patu8988 兩種胰腺癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)呈時(shí)間- 劑量依賴性，原因可能為DHA 等w-3 多不飽和脂肪酸能夠增加腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)過氧化水平，促進(jìn)更多活性基團(tuán)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，引發(fā)核酸變性、膜穿孔等，從而造成腫瘤細(xì)胞壞死[4]。本研究的結(jié)果還表明，0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的DHA 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)48 h 人 胰 腺 癌SW1990、Patu8988 細(xì) 胞 的G0～G1期、G2～M期細(xì)胞占比均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸升高（P＜0.05），S 期細(xì)胞占比均隨DHA 培養(yǎng)液濃度的升高而逐漸降低（P＜0.05）。這說明，DHA會對胰腺癌細(xì)胞周期分布造成影響，DHA 會使胰腺癌細(xì)胞周期在G0～G1期停滯，這可能會在一定程度上抑制細(xì)胞增殖，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在腫瘤細(xì)胞永生化的過程中，Bcl-2 基因家族成員在正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的抑制凋亡與促凋亡失衡中發(fā)揮著重要作用。有研究[5]表明，腫瘤的早期表現(xiàn)包括Bcl-2 基因表達(dá)過度，其會使染色體受損，逃避凋亡進(jìn)程，從而永生化，并在癌基因的協(xié)同作用下向腫瘤發(fā)展。胰腺癌早期在胰腺上皮內(nèi)瘤樣變（PanIN）1 ～3 期進(jìn)展到浸潤型時(shí)，已經(jīng)無法在PanIN 1、2 期病變中檢測到凋亡細(xì)胞，說明在胰腺癌早期，抗凋亡機(jī)制發(fā)揮了極為重要的作用[6]。在胰腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的影響因素中，Bcl-2 表達(dá)是一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。腫瘤細(xì)胞具有極為復(fù)雜的凋亡機(jī)制，COX-2 可能在其中發(fā)揮著重要作用。COX-2 是一種誘導(dǎo)型酶，其在對花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮著重要作用，通常極低或不表達(dá)于正常組織中，高表達(dá)于細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、組織損傷中[8]。本研究的結(jié)果表明，0 μg/mL 的DHA 培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 人胰腺癌SW1990、Patu8988 細(xì)胞Bcl-2、COX-2 的表達(dá)水平、蛋白熒光值均高于50 μg/mL（P＜0.05），說明DHA下調(diào)Bcl-2、COX-2 的表達(dá)可能是其對腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)的途徑。

綜上所述，DHA 可抑制人胰腺癌細(xì)胞的生長，途徑可能為下調(diào)人胰腺癌細(xì)胞中的Bcl-2、COX-2 表達(dá)。