陳 越，謝昕言，張譽方，楊建發(fā)，賀君君，王 昂，王榮瓊

(1.云南省昆明市五華區(qū)昆明動物園，云南昆明 650021；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650212)

滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)是我國特有的一級珍稀瀕危保護動物，也是世界自然保護聯(lián)盟紅色名錄中的瀕危物種。其在系統(tǒng)發(fā)育上處于舊大陸猴與猿之間的特殊分類地位，具有極高的科研價值和觀賞價值。滇金絲猴消化道易感寄生蟲種類較多，常見寄生蟲有鉤蟲、蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、肝毛細(xì)線蟲等[1]，這些寄生蟲嚴(yán)重威脅著滇金絲猴的健康。云南地區(qū)某動物園于2021年7月救助1頭滇金絲猴，次年1月該滇金絲猴出現(xiàn)食欲減退、腹部膨脹的癥狀，經(jīng)B超、X光檢查確診該滇金絲猴患有結(jié)腸梗阻，對其進行手術(shù)后因搶救無效而死亡。對該病猴進行尸體剖檢發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸黏膜表面分布有大小相近的紐扣狀結(jié)節(jié)，且結(jié)腸段內(nèi)有大量線狀蟲體，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察初步判定為線蟲。為進一步確定該滇金絲猴感染的寄生蟲種類，將其腸道內(nèi)的蟲體取出進行形態(tài)學(xué)檢測并提取蟲體DNA進行分子生物學(xué)檢測。本研究對滇金絲猴消化道線蟲蟲體進行形態(tài)學(xué)和進一步分子生物學(xué)檢測以及種系發(fā)育分析，為滇金絲猴體內(nèi)線蟲的分類、鑒別診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體樣品 滇金絲猴消化道線蟲為2022年1月從云南省某動物園采集。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖粉、dd H2O、1×TAE緩沖液、糞便DNA提取試劑盒，均為天根生物科技有限公司產(chǎn)品；GelStain核酸染料(全式金)，豐科生物科技有限公司產(chǎn)品；2×PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000，均為寶生物工程(大連)技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物顯微鏡(B302)，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR儀(PTC-1148)，Bibby Scientific公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(WGD-30)，大韓科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；高速臺式離心機(Model CF-10)，Wise Spin公司產(chǎn)品；電子分析天平(BSA124S型)，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；旋渦混合器(QL-901)，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)；恒溫水浴箱(HH-W600)，深華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；瞬時迷你離心機(Mini-6K)，湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué) 用光學(xué)顯微鏡觀察蟲體樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍下蟲體圖片，進行初步形態(tài)學(xué)鑒定。樣品保存于裝有 700 mL/L 酒精的玻璃瓶中保存?zhèn)溆谩Ｊ车揽诰€蟲的特征為：蟲體頭部前端有一圓筒形口囊，有膨大頭泡與頸溝，頸溝位于腹面，雄蟲有發(fā)達的交合傘且有一對等長交合刺，雌蟲陰門、肛門突出，且肛門后急劇變細(xì)[2]。

1.2.2 樣品DNA制備 從700 mL/L的酒精保存液中取出單個蟲體，用雙蒸水反復(fù)沖洗3次，置于1.5 mL滅菌離心管中；用滅菌的微型剪刀將蟲體組織剪碎，反復(fù)研磨，根據(jù)試劑盒說明書加入200 μL緩沖液GA與20 μL蛋白酶K，混勻后將樣品置于56℃的水浴鍋里消化15 h～18 h；將消化好的混懸液根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取蟲體DNA，DNA樣品置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增cox1基因 參照文獻[3]的報道設(shè)計引物，擴增此線蟲的cox1基因，預(yù)期擴增的目的片段大小約為420 bp，上游引物JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)擴增體系在25 μL下進行：上、下游引物各0.5 μL，模板 DNA 1 μL，雙蒸水10.5 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL。PCR擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共36個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。同時設(shè)陰性對照。取5 μL PCR產(chǎn)物進行10 g/L TAE瓊脂糖凝膠電泳，用GelStain核酸染料染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.2.4cox1基因部分序列測定及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 將陽性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序，測序結(jié)果進行拼接，并于NCBI進行Blast在線比對分析。用MEGA6.0軟件構(gòu)建進化樹，以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)作為外群，方法為相鄰法，Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)診斷

光學(xué)顯微鏡下觀察到蟲體前端有膨大的頭泡(圖1A)，雌蟲蟲體自肛門之后急劇變細(xì)(圖1B)，雄蟲交合傘發(fā)達(圖1C)，結(jié)合文獻和寄生蟲圖譜[4]，初步鑒定為食道口線蟲(Oesophagostomum)。

A.頭泡(100×); B.雌蟲尾部(100×); C.雄蟲尾部(100×)

2.2 PCR擴增

樣品成功擴增出長度為442 bp 的基因片段，與預(yù)期cox1基因目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.樣品；-.陰性對照

2.3 cox1基因部分序列測定及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

測序結(jié)果顯示，擴增獲得的線蟲cox1基因序列片段長度為442 bp；比對結(jié)果顯示，樣品與尖尾食道口線蟲(Oesophagostomumaculeatum)相似度高達99.74%。用MEGA6.0軟件相鄰法構(gòu)建種系發(fā)育進化樹(圖3)。結(jié)果表明，本研究的樣本與Genbank中檢索到的登錄號為LC428819.1的尖尾食道口線蟲的序列匯在同一小分支，表明樣品與來自馬來西亞的婆羅洲猩猩體內(nèi)分離的蟲株親緣關(guān)系最近；其次與來自日本的獼猴體內(nèi)分離出的尖尾食道口線蟲分離株與本樣品聚在同一大分支，表明其間具有較近的親緣關(guān)系。

3 討論

尖尾食道口線蟲在金絲猴的寄生蟲感染中較為常見。食道口線蟲病感染由于對宿主的免疫反應(yīng)較弱，生前一般很難做出診斷[5]，通?；疾『飼霈F(xiàn)食欲減退或食欲廢絕，飲水量增加，稀便甚至?xí)霈F(xiàn)血便。尖尾食道口線蟲在幼蟲時期由小腸黏膜移行至大腸黏膜上，其幼蟲在腸黏膜移動時對腸壁造成損傷，通過毒素作用以及機械刺激造成腸壁充血水腫而在宿主猴的大腸內(nèi)壁上形成結(jié)節(jié)，這種結(jié)節(jié)的大量形成可導(dǎo)致宿主消化功能紊亂，吸收功能降低，最后引起宿主猴營養(yǎng)不良和脫水而死亡[6]。尖尾食道口線蟲病有明顯季節(jié)性，多發(fā)于春秋季節(jié)[7]，針對宿主沒有明顯的性別、年齡差異[8]。本研究中，該滇金絲猴生前食欲廢絕，剖檢見結(jié)腸外壁有紐扣大小的暗紅色結(jié)節(jié)，結(jié)腸內(nèi)壁有大量白色絲狀蟲體，長約8 mm～12 mm，將蟲體取出進行處理后放置光學(xué)顯微鏡下觀察，見其頭部有發(fā)達的交合傘，背板兩側(cè)各有一乳突狀突起，且有一對等長交合刺，交合刺上有橫紋，與前人文獻報道感染食道口線蟲的臨床癥狀基本一致[6,9]，可初步鑒定為食道口線蟲感染；蟲體經(jīng)PCR擴增cox1基因[10]后測序比對結(jié)果顯示也為尖尾食道口線蟲，且相似度高達99.74%，從而進一步判定該滇金絲猴感染了尖尾食道口線蟲。

▲本研究樣品 Sample of this study

尖尾食道口線蟲的感染通常是由于易感動物食用了被該蟲第3期幼蟲污染的土壤或食物引起的[10]。該蟲在宿主體內(nèi)的潛伏期為5周～7周[11]。由于金絲猴是群居動物，當(dāng)個別猴誤食尖尾食道口線蟲卵后，通過一起玩耍、進食、抱團等形式，極易增大猴群間尖尾食道口線蟲病的傳播和感染概率[6]。本研究中，該滇金絲猴發(fā)病距被救助已經(jīng)過去較長時間，因此推測該滇金絲猴有可能是在園區(qū)內(nèi)誤食了攜帶有感染性幼蟲的食物引起發(fā)病。由于尖尾食道口線蟲的幼蟲能使結(jié)腸、盲腸段出現(xiàn)纖維包囊化結(jié)節(jié)，導(dǎo)致患病猴大腸蠕動能力減弱，消化能力下降，最終導(dǎo)致食欲廢絕[12]。

做好預(yù)防措施能夠有效的防止尖尾食道口線蟲的感染。有文獻表明，大部分食道口線蟲的感染通常來源于不衛(wèi)生、過于擁擠的環(huán)境中[13]，因此要對滇金絲猴的居住環(huán)境進行定期打掃，同時也要注意猴與猴之間的飼喂距離。蟲卵會通過患病動物的糞便滯留于土壤甚至污染該區(qū)域內(nèi)的食物，因此應(yīng)當(dāng)對園區(qū)內(nèi)相關(guān)的糞污以及土壤及時進行清理和消毒，尤其是患病動物的糞便應(yīng)進行無害化處理[14]。也應(yīng)注意禁止游客隨意投喂食物導(dǎo)致發(fā)病，同時在該寄生蟲高發(fā)季節(jié)對易感動物進行驅(qū)蟲。當(dāng)發(fā)現(xiàn)其他猴類疑似癥狀時，立即采取相應(yīng)的治療措施，避免造成不必要的損失。

雖然食道口線蟲通常只在反芻動物、豬和猴子中發(fā)現(xiàn),但也有感染人的報道,特別是在非洲的某些地區(qū)具有很高的感染率[15]。而目前尖尾食道口線蟲僅在亞洲有分布[16]，該病多發(fā)于靈長類[17]，其中獼猴的感染率最高[18]。在國內(nèi)雖然目前暫未發(fā)現(xiàn)人類感染該寄生蟲的病例，但由于該寄生蟲與同一種屬的人獸共患寄生蟲猴結(jié)節(jié)線蟲基因序列相似度較高，有人獸共患的風(fēng)險[19-20]。

滇金絲猴作為我國一級珍稀瀕危保護動物，僅在云南部分地區(qū)分布，種群數(shù)量非常稀少，其保護與健康問題任重而道遠(yuǎn)。本研究有利準(zhǔn)確鑒別食道口線蟲的種類，對患病滇金絲猴對癥用藥，且對于預(yù)防和規(guī)避人獸共患風(fēng)險，保障人類健康和公共環(huán)境衛(wèi)生有重要意義。