簡永利，涂宜強，王會寶，高永安，王 蒙，于三科，宋軍科*

(1.溫州科技職業(yè)學院 動物科學學院，浙江溫州 325006；2.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；3.中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種主要寄生于人和多種動物胃腸道和呼吸道上皮細胞內的寄生性原蟲，在多數(shù)國家和地區(qū)廣泛分布[1]，引起感染宿主以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的隱孢子蟲病。目前，隱孢子蟲已鑒定40多個有效種和70多個基因型[2-3]，主要通過其卵囊污染的水源、食物或接觸感染的動物或人等多種途徑進行廣泛傳播[4]。

在家畜中，反芻動物被認為是宿主特異性和人獸共患性隱孢子蟲的重要宿主，其排出的大量卵囊可污染周圍環(huán)境[5]。奶?？筛腥镜碾[孢子蟲種類較多，微小隱孢子蟲(C.parvum)、牛隱孢子蟲(C.bovis)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)等是奶牛感染的主要常見隱孢子蟲蟲種，偶爾也有感染貓隱孢子蟲(C.felis)、人隱孢子蟲(C.hominis)、豬隱孢子蟲(C.Suis)、火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)等其他隱孢子蟲種的報道[6-7]。感染后奶牛主要表現(xiàn)腹瀉、腹痛、嘔吐、體重減輕、產奶量減少等臨床癥狀[8-9]，特別是對小于1月齡的犢牛還可能引起致死性腹瀉[10]，這不僅給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經濟損失，而且牛感染的C.parvum和C.andersoni等隱孢子蟲種類對人類健康有潛在的威脅[1,11]。對我國陜西、河南、黑龍江和寧夏等地區(qū)牛隱孢子蟲感染情況進行調查結果顯示，感染率從4.94%～47.7%不等[1,6-7]，且在不同地區(qū)，牛隱孢子蟲的種類分布、分子特征等方面存在較大差異。

奶牛產業(yè)是我國農業(yè)的重要組成部分，我國奶牛養(yǎng)殖量位居世界前列。近年來，浙江溫州地區(qū)奶牛產業(yè)在龍頭企業(yè)的帶動下不斷持續(xù)向好發(fā)展，年存欄量近1萬頭，但目前尚未有對該地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況的報道。本研究通過分子生物學技術對該地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況進行調查，分析奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布，為奶牛隱孢子蟲病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 糞便樣品共85份，分別采自位于平陽縣、瑞安市、樂清市等浙江省溫洲地區(qū)的3個奶牛場。其中，3月齡內斷奶犢牛樣品28份，3月齡～6月齡斷奶后犢牛樣品14份，6月齡～12月齡育成牛樣品26份，1歲以上成年奶牛樣品17份(表1)。除1月齡內新生犢牛分開隔離飼養(yǎng)在籠舍內，其他奶牛按照年齡段隔離混合飼養(yǎng)。在奶牛場做好自身生物安全防護措施的前提下，用一次性塑料手套直腸采集糞便，低溫運送至溫州科技職業(yè)學院實驗室，每份糞便樣品保存于離心管中，并標記動物年齡、采集地點、時間等信息，置于25 g/L重鉻酸鉀溶液中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 奶牛糞便樣品信息

1.1.2 主要試劑和儀器 25 g/L重鉻酸鉀溶液，上海試一化學試劑有限公司產品；糞樣DNA提取試劑盒，Omega生物科技公司產品；rTaqDNA 聚合酶體系，生工生物工程(上海)股份有限公司產品；瓊脂糖、DNA Marker DL 2 000，寶生生物工程(大連)有限公司產品；PCR儀為eppendorf公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 從25 g/L的重鉻酸鉀溶液中取糞樣0.2 g于1.5 mL離心管中，滅菌雙蒸水洗滌3次～4次直至上清液清亮，按照DNA試劑盒說明提取糞樣DNA，并保存于-20℃?zhèn)溆?。引物參照文獻[12]，由上海生工生物工程有限公司合成。SSUrRNA基因的PCR反應為套式PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL， dNTP 2.0 μL， MgCl22.0 μL，第1輪(或第2輪)上、下游引物各1.0 μL，rTaq酶0.125 μL，模板DNA 1.0 μL，雙蒸水補至25 μL。PCR反應程序參照文獻[13]進行。取第2輪PCR產物進行核酸電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝成像。第2輪陽性PCR產物直接送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.2 序列分析 雙向測序成功的隱孢子蟲基因序列拼接后，用Clustal X1.83軟件比對，再對照測序圖譜進行校正。校正的序列在GenBank上的Blastn進行同源性比對和分析。用MEGA6.0軟件進行種群遺傳進化分析，構建Neighbor-Joining進化樹。

2 結果

2.1 SSU rRNA基因擴增

用基于SSUrRNA基因的套式PCR對采集的85份糞樣DNA進行擴增，在29份糞便樣品中成功擴增出約830 bp的目的片段，部分代表性樣品的擴增結果見圖1。

M.DNA標準DL 2 000；1.陰性對照；2～7、9.奶牛隱孢子蟲陽性糞便樣品；8.奶牛隱孢子蟲陰性樣品；10.陽性對照

2.2 奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布

本次調查的3個奶牛場均有隱孢子蟲感染，總感染率為34.1%(29/85)。其中瑞安市奶牛場奶牛感染率為12.0%(3/25)，樂清市奶牛場為46.2%(6/13)，平陽縣為42.6%(20/47)，樂清、平陽奶牛場隱孢子蟲感染率明顯高于瑞安奶牛場。不同年齡段的奶牛均有隱孢子蟲感染，斷奶前犢牛感染率為64.3%(18/28)，其余年齡段感染率由高到低依此為成年奶牛23.5%(4/17)、斷奶后犢牛21.4%(3/14)、育成牛15.4%(4/26)(表2)。

表2 溫州地區(qū)3個奶牛場隱孢子蟲感染和蟲種分布情況

基于SSUrRNA基因的序列比對分析，結果顯示，溫州地區(qū)奶牛場共檢出4種隱孢子蟲種，即牛隱孢子蟲(C.bovis)、瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和奇異隱孢子蟲(C.occultus)。在29份陽性樣品中，C.bovis的感染數(shù)最多，占比最高，且分布范圍廣，是溫州地區(qū)奶牛場感染的優(yōu)勢蟲種。結果表明，奶牛場普遍感染2種～3種隱孢子蟲，其中瑞安牧場奶牛感染的有C.bovis和C.ryanae，樂清奶牛主要感染的有C.andersoni和C.occultus，而平陽奶牛感染有3種隱孢子蟲種，分別為C.bovis、C.ryanae和C.andersoni。另外，C.bovis、C.ryanae和C.andersoni等3個種類在斷奶前犢牛、斷奶后犢牛和育成牛都有分布，但C.bovis和C.ryanae主要集中分布于斷奶前犢牛，是斷奶前犢牛感染的優(yōu)勢蟲種。C.andersoni分布于各年齡段，但主要集中分布于斷奶前犢牛和成年奶牛。此外，在樂清牧場1個斷奶后犢牛的樣品中檢出了C.occultus。

2.3 序列分析

將29份糞便陽性樣品送上海生工生物工程技術服務有限公司雙向測序，除3個樣品測序不成功以外，其他序列拼接后再用Clustal X1.83軟件比對校正，總共得到26條序列。序列比對結果顯示，9份為牛隱孢子蟲、7份為瑞氏隱孢子蟲、9份為安氏隱孢子蟲、1份為奇異隱孢子蟲。

基于SSUrRNA基因位點對本研究中的隱孢子蟲進行分類鑒定，以卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale，GenBank登錄號： KP050371)作為外群，利用MEGA6.0軟件對獲得的序列進行種群遺傳進化樹分析(圖2)。結果表明，分別有9個序列與C.bovis、7個序列與C.ryanae、9個序列與C.andersoni、1個序列與C.occultus分別聚在同一分支上，親緣關系較近。

圖2 牛隱孢子蟲SSU rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹

3 討論

隱孢子蟲隸屬于頂復門重要原蟲，主要寄生在人和動物的胃腸道，導致宿主出現(xiàn)輕度、中度甚至重度腹瀉。研究表明，奶牛普遍感染隱孢子蟲，但不同國家或地區(qū)感染率不同。馬來西亞牛隱孢子蟲的總感染率為12.5%[14]，埃及奶牛的感染率為9.7%[15]，日本斷奶前犢牛感染率為83.8%[16]。本次調查中，85份奶牛樣品中，有29份樣品檢出隱孢子蟲陽性，3個奶牛場隱孢子蟲的總感染率達34.1%，其中樂清市和平陽縣奶牛場奶牛隱孢子蟲的感染率達40%以上。與國內奶牛隱孢子蟲感染情況相比，其感染率高于曾經在寧夏(1.61%，23/1366)、四川省(14.4%，40/278)、廣東省(24.0%，93/388)的調查結果[17-19]，也高于在牦牛(20.92%)、肉牛(10.47%)、水牛(15.50%)的調查結果[7]。本研究中，奶牛隱孢子蟲感染率明顯高于其他地區(qū)，這可能與該地區(qū)濕熱的氣候、地理環(huán)境、飼養(yǎng)方式、動物品種與年齡、檢測方法等因素有關。

研究表明，隱孢子蟲的感染與日齡相關，隨著奶牛日齡增加，隱孢子蟲感染率呈明顯下降趨勢[4,15]。本次調查中，各年齡段的奶牛均存在隱孢子蟲感染，斷奶前犢牛感染率最高(64.3%)，而斷奶后犢牛(21.4%)和育成牛(15.4%)的感染率稍低，這也與此前的研究報道結果相一致[19-20]，但成年奶牛的感染率(23.5%)略高于斷奶后犢牛和育成牛。此外，有調查結果顯示，牛隱孢子蟲種類分布也具有一定的年齡相關性，斷奶前犢牛主要感染C.parvum，而斷奶后犢牛感染有C.bovis和C.ryanae，而C.andersoni則主要感染育成牛和成年牛[4,6,19-20]。本研究表明，溫州地區(qū)3個奶牛場的奶牛感染的隱孢子蟲種類有4種，分別為C.bovis、C.andersoni、C.ryanae和C.occultus，其中斷奶前犢牛感染3種隱孢子蟲，即C.bovis、C.ryanae和C.andersoni，C.bovis和C.ryanae是斷奶前犢牛感染的優(yōu)勢蟲種，這與我國陜西、四川等地區(qū)調查的結果基本一致[21-22]，而與河南、新疆等地報道不同，斷奶前犢牛主要感染的是C.parvum[3,23]。C.andersoni在各年齡段奶牛均有分布，但主要集中分布于斷奶前犢牛和成年奶牛。

因C.occultus與C.suis遺傳進化關系較近，此前曾被命名為C.suis-like，后來發(fā)現(xiàn)其卵囊比C.suis小，具有明顯形態(tài)學差異，因此， Kvác M在2018年將其命名為一個新的有效種[24]。C.occultus可感染牛、牦牛、水牛、老鼠等廣泛的宿主，但主要感染的宿主為老鼠。我國也有牛、牦牛、野鼠感染的情況[25-26]，廣西也有兒童感染C.occultus的首例報道[27]。本次調查中，樂清牧場的1個斷奶后犢牛樣品中檢出了C.occultus，提示存在人獸共感染的風險，建議該牧場需加強奶牛糞便管理工作，避免造成食物、水源的污染。

C.parvum是一種重要的人獸共患原蟲[27]，主要感染斷奶前犢牛，近年來新疆、江蘇、河北等多地報道了新生犢牛因感染C.parvum而暴發(fā)隱孢子蟲病的案例[3,9,28]。而本次調查中，并未檢測到奶牛感染C.parvum，一方面可能是由于斷奶前犢牛排出的C.bovis和C.ryanae卵囊量較多，而用于多種隱孢子蟲鑒定的分子生物學技術優(yōu)先擴增DNA含量較高的樣本，另一方面也提示該地區(qū)奶牛傳播微小隱孢子蟲對人的風險較低。