劉 丹，孟江海，曹 斌，李 燦，曾 維，紀(jì)春曉，陳 韜*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南省獸藥工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128)

新一代測序技術(shù)極大地拓展了人們對腸道微生物群在人類健康和疾病中作用的認(rèn)識。豬是人類重要的蛋白質(zhì)來源和人類疾病的生物醫(yī)學(xué)模型，使豬腸道微生物群越來越受到關(guān)注。特別是在豬的關(guān)鍵生長階段，腸道微生物在豬的健康和生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用[1]。由于各種應(yīng)激、腸道屏障功能降低和病原體感染增加，斷奶與腸道微生物群失調(diào)有關(guān)[2]。通過益生菌和益生元調(diào)節(jié)豬腸道微生物以維持健康微生物群可有效預(yù)防病原體感染和促進(jìn)有益細(xì)菌豐度[3]。有研究收集273份直腸拭子和糞便分別進(jìn)行測序和糞便微生物群移植，共檢測到19個菌門，其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)最多，不同階段健康豬微生物群可能是由飼料或豬生理特性差異決定的[4]。對來自法國、丹麥和中國的287頭豬的糞便進(jìn)行宏基因組測序，確定了770萬個非冗余基因，代表了719個宏基因組物種[5]。在人類基因目錄中發(fā)現(xiàn)的96%的功能途徑都存在于豬腸道微生物目錄中，這證實(shí)了豬在生物醫(yī)學(xué)研究中的潛在用途[6]。仔豬體內(nèi)腸道微生物群被認(rèn)為是其疾病發(fā)生和健康平衡的關(guān)鍵[8]。因此，腸道微生物在豬的健康和生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，分析豬腸道微生物群落的組成和演替機(jī)制，可有效促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。

傳統(tǒng)分子生物技術(shù)多以檢測糞便中的菌群為主，而對結(jié)腸內(nèi)容物的檢測相對較少。近年來，新一代高通量測序技術(shù)的成熟，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分子生物技術(shù)手段對腸道微生物群的研究，能夠更全面、客觀、準(zhǔn)確地反映腸道微生物群的真實(shí)情況[9]。據(jù)了解，目前對豬出生到斷奶后的腸道微生物群的組成和多樣性，在不同日齡仔豬腸道微生物群的縱向變化較少有系統(tǒng)的研究。本試驗(yàn)主要選取不同日齡(0、5、10、15、20、25、30 d)健康二元仔豬，收集其結(jié)腸內(nèi)容物，用16S rRNA基因高通量測序方法，探究不同日齡仔豬腸道微生物群的菌群組成、分布及其多樣性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 從湖南新祥和農(nóng)牧科技有限公司隨機(jī)選擇不同日齡(0、5、10、15、20、25、30 d)的健康二元仔豬(大約克 × 長白豬)各3頭，總共21頭。健康二元仔豬在斷奶前飼喂常規(guī)教槽料，斷奶后飼喂常規(guī)乳豬料。

1.1.2 主要試劑與儀器 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix，New England Biolabs公司產(chǎn)品；GeneJETTM Gel Extraction Kit 瓊脂凝膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 建庫試劑盒，Thermo Scientific公司產(chǎn)品。Qubit@ 2.0 Fluorometer熒光定量儀、Ion S5TM XL高通量測序系統(tǒng)和超低溫冰箱，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；SX300 高壓滅菌鍋，Tomy公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 通過肌肉注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉仔豬，收集仔豬結(jié)腸內(nèi)容物2 g～3 g，裝入2 mL無菌EP管中，并迅速置于液氮中進(jìn)行速凍，隨后保存在-80℃冰箱備用。

1.2.2 DNA提取 采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨)對樣本進(jìn)行基因組DNA提取，得到所有樣品的基因組DNA，并用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，再用Agilent 5400全自動毛細(xì)管電泳檢測DNA的完整性。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和16S rRNA測序 使用引物序列：806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，對細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 1 min；98℃ 10 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 5 min；10℃保存。PCR產(chǎn)物混合后用濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,用凝膠回收試劑盒(Gene JETTM gel extraction kit)回收，并構(gòu)建文庫(Ion plus fragment library kit)，再通過Qubit@ 2.0 fluorometer (thermo scientific)和qPCR定量，合格后用Ion S5TM XL高通量測序系統(tǒng)進(jìn)行測序。

1.2.4 生物信息分析 通過生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)，從而獲取準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果，再使用Barcode拆分獲得各樣本數(shù)據(jù)后用FLASH(V1.2.7)對每個樣本的Reads進(jìn)行拼接，得到原始數(shù)據(jù)，再對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的拼接、過濾，去除干擾數(shù)據(jù)得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。參照Qiime(V1.9.1)的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行排序與去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析，篩選每個OTUs的代表性序列，對每個OTU的代表序列做物種注釋。為研究不同OTUs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及不同樣本間的優(yōu)勢菌群差異，用MUSCLE(Version 3.8.31)軟件進(jìn)行多序列比對分析，得到所有OTUs代表序列，后對各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，再使用R軟件進(jìn)行α多樣性組間差異分析與β多樣性分析。通過T-test檢驗(yàn)，Wilcox秩和檢驗(yàn)與Tukey檢驗(yàn)分析組間物種多樣性差異是否顯著。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)比較不同日齡α多樣性指數(shù)組間差異，統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 DNA樣品質(zhì)檢結(jié)果

DNA樣品質(zhì)檢結(jié)果顯示，除3個樣品不合格外，其他樣本均檢測合格，檢測不合格的3個樣品用備份樣品重新質(zhì)檢，所有樣品均檢測合格。

2.2 OTUs聚類分析

試驗(yàn)共采集樣本21個，原始數(shù)據(jù)總reads共獲得1 872 460條原始測序數(shù)據(jù)，通過雙端拼接，獲得1 761 558條序列，經(jīng)質(zhì)控、嵌合體過濾，獲得1 281 153條reads用于后續(xù)的OTUs注釋分析，平均每個樣本61 007條；OTUs的總數(shù)目為12 306個，平均每個樣本545個OTUs。其中，30 d(斷奶后)樣品具有最高數(shù)量的OTUs(OTUs平均數(shù)為689)。每個樣本的公共和特有的OTU數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果被用來組成圖1，圖1顯示0 d中特有718個OTUs，5 d中特有362個OTUs，10 d中特有32個OTUs，15 d中特有56個OTUs，20 d中特有208個OTUs，25 d中特有314個OTUs，30 d中特有135個OTUs，表明7個日齡仔豬腸道中的微生物菌群存在差異。

每個橢圓代表不同日齡的仔豬。重疊和不重疊部分分別代表公共和特有的OTUs。一個OTU代表一種菌群。重疊部分中的數(shù)字代表組間共公的OTU總數(shù)，不重疊部分的數(shù)字代表不同日齡特有的OTU數(shù)。其中N00、N05、N10、N15、N20、N25、N30分別表示0 d～30 d的仔豬日齡

2.3 豬腸道菌群多樣性分析

通過Alpha多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)樣本Coverage均超過99.7%，說明了此次測序結(jié)果基本反映了腸道內(nèi)微生物的狀況。由表1分析物種多樣性差異可知，25 d仔豬Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)要顯著低于30 d仔豬(P<0.05)，表明25 d時群落多樣性顯著低于30 d仔豬。同時，25 d仔豬的Simpson指數(shù)也要顯著低于5、10、20 d仔豬的，因此，5、10、20 d仔豬腸道菌群的多樣性也要顯著高于25 d仔豬的(P<0.05)。30 d時，物種觀察指數(shù)和Chao1指數(shù)最高，表明群落樣品中包含的物種總數(shù)最多，物種豐富度最高。除此之外，Observed species指數(shù)和Chao1指數(shù)在0 d～20 d時降低，在20 d～30 d時升高，表明在0 d～20 d時，物種豐富度呈現(xiàn)降低趨勢，在20 d～30 d時，物種豐富度呈現(xiàn)增高趨勢。

表1 不同日齡仔豬Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

采用非加權(quán)組平均法UPGMA分析進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證(圖2)。結(jié)果顯示，不同日齡各個階段腸道微生物菌群聚類為兩大簇，0日齡和25日齡的樣本為一簇，其中N00.2為離散樣本，其他各個日齡的樣本為一簇，0日齡和25日齡與其他各個日齡的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

圖2 不同日齡仔豬樣品聚類圖

2.4 豬腸道菌群的組成

通過OTU樣本的群落豐度對樣本中的不同菌群，在門水平和屬水平進(jìn)行差異性分析，生成相對豐度柱狀堆積圖，從而分析不同日齡的樣本之間菌群分布和相對豐度變化情況。

仔豬0 d～30 d在門水平上腸道菌群相對豐度分析見圖3。在門水平新生仔豬腸道菌群主要由Firmicutes(43.5%)、Bacteroidota(26.9%)兩個門組成，約占70.4%，但是其在每個日齡中的所占比例有所不同，F(xiàn)irmicutes的相對豐度在0 d(36.9%)～5 d(52.4%)時有上升趨勢(P>0.05)，在5 d～20 d的相對豐度基本維持穩(wěn)定，差異變化不明顯(P>0.05)，在25 d(18.7%)時顯著下降(P<0.05)，30 d(47.7%)的相對豐度開始上升趨于穩(wěn)定(P>0.05)。Bacteroidota的相對豐度在各個日齡中差異并不顯著(P>0.05)，從出生0 d(14.7%)～10 d(43.9%)整體呈現(xiàn)上升趨勢(P>0.05)，20～25 d(18.9%)時呈現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。其中變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度從0 d(35.6%)下降到20 d(1.65%)，20 d(1.65%)上升到25 d(30%)。梭桿菌門(Fusobacteriota)的相對豐度從0 d上升到25 d(21.7%)。螺旋體菌門(Spirochaetota)和廣古菌門(Euryarchaeota)在30 d的相對豐度分別為5.84%、4.7%，在其他日齡時均少于1%。放線菌門(Actinobacteriota)、互養(yǎng)菌門(Synergistota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)在不同日齡間的差異并不顯著(P>0.05)。

圖3 門水平上的物種相對豐度

仔豬0～30 d在屬分類水平上的菌屬相對豐度分布見圖4。在屬分類水平上前10類菌屬分別為青枯菌屬(Ralstonia)、埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、理研菌科-RC9菌屬(Rikenellaceae-RC9-gut-group)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、普雷沃式菌屬(Prevotella)、密螺旋體菌屬(Treponema)。斷奶(25 d)前，仔豬腸道中優(yōu)勢菌種以Lactobacillus(占前20 d的全部菌屬的19.7%)、Bacteroides(占前20 d的全部菌屬的7.2%)、Escherichia-Shigella(占前20 d的全部菌屬的7.2%)為主，斷奶后的腸道菌群變化明顯，斷奶后Ralstonia、Prevotella、Ruminococcaceae-UCG-005、Alloprevotella、Treponema、Fusobacterium為優(yōu)勢菌群。0 d時Escherichia-Shigella顯著高于30 d(P<0.05)；0 d～20 d時，菌屬的變化差異不顯著(P>0.05)，20 d時，Lactobacillus要顯著高于25 d和30 d(P<0.05)；25 d CHKCI001顯著高于10 d～20 d(P<0.05)，而Eubacterium顯著高于其他日齡(P<0.05)，其中Ralstonia、Rothia、CAG-873在25 d的相對豐度均比較20 d時有所上升；30 d中Alloprevotella、Prevotella、Treponema、Ruminococcaceae-UCG-005、CHKCI001的相對豐度比較0 d～25 d時均有所上升(P<0.05)。

圖4 屬水平上的物種相對豐度

3 討論

本研究對不同日齡仔豬樣本菌群相對豐度分析發(fā)現(xiàn)，在門水平進(jìn)行差異性研究，其Firmicutes(43.5%)、Bacteroidota(26.9%)、Proteobacteria(11.5%)這3個門占據(jù)腸道微生物的82%，這與文獻(xiàn)[10-11]報道一致。其中Firmicutes和Bacteroidota是腸道內(nèi)2個優(yōu)勢菌門，約占70.4%[10]。主要成因可能是由于Firmicutes屬于革蘭氏陽性菌，具有十分重要的作用，例如屬于厚壁菌門的乳酸桿菌屬，可阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，抑制內(nèi)毒素的產(chǎn)生，維持腸道的微生態(tài)平衡[11]；而Bacteroidota不但能夠抵御病原菌的入侵，還能夠降解大量的多糖以及分解碳水化合物[12]。研究表明0 d仔豬腸道的優(yōu)勢菌群主要是Firmicutes、Bacteroidota和Proteobacteria，但是不同菌門在不同樣品中所占比例不一樣，這與仔豬取樣來自于不同欄舍有關(guān)。而哺乳期間(5～20 d)的仔豬腸道菌群，F(xiàn)irmicutes比例有所增加，Bacteroidota比例有所減少，但二者依然是優(yōu)勢菌門，與文獻(xiàn)[13]報道一致，主要是由于厚壁菌門的乳酸桿菌隨著進(jìn)食母乳的增加逐漸占據(jù)優(yōu)勢，迫使Bacteroidota由于競爭抑制而減少。同期Proteobacteria的相對豐度則顯著下降，這種變化可能主要與Proteobacteria中多數(shù)細(xì)菌為兼性或者專性好氧有關(guān)，當(dāng)腸道中的氧被好氧細(xì)菌消耗殆盡時，好氧細(xì)菌將會被兼性厭氧菌和專性厭氧菌取代[14]。研究中仔豬斷奶(25 d)時，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidota所占比例均顯著減少，而Proteobacteria、Fusobacteriota的相對豐度顯著上升，這與現(xiàn)實(shí)情況相符。許多養(yǎng)殖場為提高生產(chǎn)效率，對25 d左右仔豬進(jìn)行斷奶，由于此時仔豬腸道微生物的組成以及各方面均未發(fā)育成熟，又受到環(huán)境、飲食等外界因素的影響，此時仔豬極易發(fā)生斷奶應(yīng)激，腸道菌群及結(jié)腸代謝產(chǎn)物也會發(fā)生顯著變化[11-14]，致使仔豬腸道菌群失調(diào)，而多數(shù)屬于病原菌屬的Proteobacteria和Fusobacteriota開始增加。斷奶后1周左右時(30 d)，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidota的相對豐度逐漸恢復(fù)到之前的比例，這可能是由于仔豬逐漸習(xí)慣周圍環(huán)境、適應(yīng)新的飲食以及腸道進(jìn)行自我調(diào)整而使腸道菌群趨于穩(wěn)定。另外，在屬水平，Bacteroides、Lactobacillus、Escherichia-Shigella、Ralstonia、Clostridium、Rikenellaceae-RC9-gut-group、Prevotella為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌屬，占腸道微生物的48.8%，與文獻(xiàn)[15]研究結(jié)果一致。

對于0 d仔豬而言，腸道組織中最開始占據(jù)優(yōu)勢的菌種是Escherichia-Shigella、乳酸桿菌屬Lactobacillus、Bacteroides，究其原因可能是通過垂直傳播母豬將這些菌屬帶給仔豬。同時，有研究證實(shí)了仔豬出生時仔豬的糞便微生物菌群與產(chǎn)仔母豬陰道的微生物菌群相似[16-17]。斷奶后仔豬(25 d)受到斷奶應(yīng)激的影響，仔豬腸道內(nèi)的乳酸桿菌屬和擬桿菌屬顯著下降；而Ralstonia、Clostridium、CAG-873顯著上升。其中的Lactobacillus和Bacteroides通常被用于評價腸道的健康水平。斷奶后仔豬腸道的健康水平開始出現(xiàn)下降是Ralstonia、Clostridium、CAG-873對腸道造成了有害作用。有研究已證明Fusobacterium具有致病性，可與腸道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相互作用，發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)和過敏活性，還與炎癥性腸病和腹瀉在內(nèi)的嚴(yán)重胃腸疾病相關(guān)。斷奶后1周(30 d)，斷奶仔豬度過應(yīng)激階段，開始適應(yīng)新的飲食，而此時腸道菌群主要由Bifidobacterium、Alloprevotella、Treponema、Prevotella、Methanobrevibacter、CHKCI001等菌種組成，其中Prevotella剛出生時相對豐度比較低，但斷奶后，由于飲食中膳食纖維的增加，Prevotella作為膳食纖維發(fā)酵菌迅速增加，并且Prevotella能降解多糖，有助于增加糖原儲存[18]。同時，Bifidobacterium作為益生菌，可以調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的體內(nèi)平衡，并促進(jìn)腸免疫球蛋白A(immunoglo bulin A,IgA)的產(chǎn)生。除此之外，還存在一些有害菌，使仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài)，有些類似成年豬腸道組織。

本研究隨機(jī)選擇不同日齡的健康二元仔豬(大約克 × 長白豬)為研究對象，對新生仔豬腸道菌群組成以及新生仔豬不同發(fā)育階段腸道菌群的分布和變化進(jìn)行分析，仔豬斷奶后的腸道菌群結(jié)構(gòu)與仔豬哺乳期的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，同一日齡段的仔豬腸道菌群組成也存在個體差異。處于不同日齡仔豬的腸道微生物，隨著日齡的增加多樣性具有顯著性變化。不僅如此，仔豬在不同的生長日齡，雖然腸道菌群在不斷的發(fā)展變化，但Firmicutes和Bacteroidota作為核心菌群是一直存在的，斷奶前仔豬腸道中Lactobacillus、Bacteroides等與碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的菌屬豐度較高，斷奶后Prevotella、Ruminococcaceae-UCG-005、Alloprevotella等與纖維消化有關(guān)的菌屬豐度較高。這說明腸道菌群的微生物組成在仔豬生長的不同階段是動態(tài)變化的。