李樹純,秦 濤,陳素娟,彭大新*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸困難和發(fā)熱等癥狀[1-2]，PRRSV具有變異性強(qiáng)、毒株種類多、流行面廣等特點(diǎn)，該病的出現(xiàn)給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。目前臨床防控PRRS的主要措施是采取疫苗免疫配合抗菌藥物治療繼發(fā)的細(xì)菌感染，疫苗以PRRS減毒活疫苗最為普遍。但由于國(guó)內(nèi)疫苗生產(chǎn)廠家多，使用的疫苗毒株不同，再加上PRRSV復(fù)制具有中和抗體依賴性增強(qiáng)(antibody dependent enhancement，ADE)作用和各個(gè)豬場(chǎng)免疫程序的差異，導(dǎo)致PRRS減毒活疫苗的安全性和有效性在養(yǎng)豬行業(yè)內(nèi)一直存在著較大爭(zhēng)議[5-6]。

目前國(guó)內(nèi)規(guī)模豬場(chǎng)常見的PRRS減毒活疫苗免疫程序?yàn)槟肛i和商品豬一起免疫，母豬群普免每年3次～4次，1次1頭份；仔豬14日齡左右免疫1次，1次1頭份。由于規(guī)模豬場(chǎng)母豬群體免疫PRRS減毒活疫苗的比例較高，而不同豬場(chǎng)背景和不同PRRS疫苗毒株等因素都導(dǎo)致了各種各樣的PRRS減毒活疫苗母豬群免疫安全性問題，母豬群初次免疫PRRS減毒活疫苗或者更換PRRS減毒活疫苗免疫導(dǎo)致的妊娠后期母豬(妊娠80 d～100 d)流產(chǎn)是最常見問題之一。本研究通過對(duì)華東地區(qū)不同PRRS免疫背景的規(guī)模豬場(chǎng)妊娠后期母豬免疫PRRS VR-2332株弱毒疫苗進(jìn)行試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)妊娠后期母豬免疫PRRS VR-2332株疫苗的安全性及對(duì)其生產(chǎn)性能的影響，為母豬群PRRS疫苗免疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗來源 VR-2332株減毒活疫苗(批號(hào)2451294A)，勃林格殷格翰動(dòng)物保健(美國(guó))有限公司產(chǎn)品；TJM-F92株減毒活疫苗(批號(hào)201705013)，華威特(江蘇)生物制藥有限公司產(chǎn)品；R98株減毒活疫苗(批號(hào)170203)，瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；JXA1株減毒活疫苗(批號(hào)151268)，廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)?zāi)肛i來源 試驗(yàn)?zāi)肛i分別來自華東地區(qū)A、B、C、D 4個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)，均為二胎新美系長(zhǎng)大二元品種，各豬場(chǎng)母豬群豬瘟、豬偽狂犬病等常規(guī)疫苗免疫背景清楚，免疫方案類似，均為普免，1年3次免疫，其中A和D豬場(chǎng)試驗(yàn)?zāi)肛i未免疫PRRS疫苗，B豬場(chǎng)試驗(yàn)?zāi)肛i試驗(yàn)前3個(gè)月免疫過TJM-F92株P(guān)RRS疫苗，C豬場(chǎng)試驗(yàn)?zāi)肛i試驗(yàn)前3個(gè)月免疫過R98株P(guān)RRS疫苗。

1.1.3 試驗(yàn)豬場(chǎng)背景 A、B、C、D 4個(gè)試驗(yàn)豬場(chǎng)規(guī)模分別為1 800、1 500、900、680頭基礎(chǔ)母豬，4個(gè)豬場(chǎng)生產(chǎn)模式類似，均為兩點(diǎn)式飼養(yǎng)，外來人員進(jìn)生產(chǎn)區(qū)需隔離洗浴。4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)前妊娠母豬均無明顯PRRS臨床癥狀，其中C場(chǎng)此階段產(chǎn)房初生弱仔臍帶血有經(jīng)典毒株P(guān)RRSV陽性檢出，同時(shí)母豬群PRRS抗體離散度平均超過60%。A場(chǎng)豬群未免疫過PRRS疫苗；B場(chǎng)母豬群最開始使用JXA1株高致病性PRRS減毒活疫苗，目前更換使用TJM-F92毒株1年時(shí)間，母豬群普免，3次/年，1次1頭份2 mL，仔豬不免疫PRRS疫苗；C場(chǎng)母豬群一直使用R98株P(guān)RRS減毒活疫苗，母豬群普免，4次/年，1次1頭份2 mL，仔豬不免疫PRRS疫苗；D場(chǎng)母豬群未免疫PRRS疫苗2年，2年前一直用TJM-F92株P(guān)RRS減毒活疫苗，普免，3次/年，1次1頭份2 mL，仔豬不免疫PRRS疫苗。

1.1.4 主要試劑和儀器 PRRS抗體ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)40959-V931)，美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品；MK3酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；單道、多道微量移液器，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 疫苗免疫方案 對(duì)4個(gè)豬場(chǎng)母豬群試驗(yàn)前2個(gè)月的PRRS抗體抽樣檢測(cè)報(bào)告及各場(chǎng)異常豬PRRS抗原檢測(cè)報(bào)告進(jìn)行分析，了解各場(chǎng)母豬群試驗(yàn)前的PRRS感染狀態(tài)，參照文獻(xiàn)[7]標(biāo)準(zhǔn)豬群PRRSV的感染狀態(tài)進(jìn)行分類。

每個(gè)豬場(chǎng)選取抽樣檢測(cè)中正常生產(chǎn)狀態(tài)的懷孕后期母豬(妊娠80 d～100 d)20頭，約為450日齡，隨機(jī)分成2組(試驗(yàn)組10頭，對(duì)照組10頭)，其所處的環(huán)境和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件基本一致。試驗(yàn)組懷孕后期母豬免疫PRRS減毒活疫苗VR-2332株，1頭份/頭，對(duì)照組不免疫。跟蹤所有試驗(yàn)組和對(duì)照組母豬的流產(chǎn)數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)、死胎數(shù)、弱仔數(shù)和分娩后20 d PRRS抗體水平。

1.2.2 PRRSV血清抗體檢測(cè) 參照美國(guó)IDEXX PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒說明書，對(duì)送檢樣品血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。該試劑盒只檢測(cè)針對(duì)PRRSV的N蛋白抗體，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將樣品稀釋液40倍稀釋待檢樣品(對(duì)照無需稀釋)，取出抗體包被板，在記錄表上記錄樣品的位置。加入100 μL沒有稀釋的陰性和陽性對(duì)照，每個(gè)檢測(cè)加2孔；對(duì)應(yīng)孔中加入稀釋好的樣品100 μL，25℃孵育30 min，棄各孔液體，使用約300 μL洗滌液洗滌板孔4次，每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，25℃孵育30 min，用洗滌液再次洗滌；每孔加入100 μL TMB底物液，25℃孵育15 min，每孔加入100 μL終止液，終止反應(yīng)。測(cè)量樣本和對(duì)照在630 nm處的吸光值，計(jì)算結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：S/P值<0.4為陰性，S/P值≥0.4為陽性。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果用Minitab19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用單變量方差分析比較，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)前母豬群PRRS抗體抽檢結(jié)果

4個(gè)豬場(chǎng)母豬群的抗體S/P平均值分別為0.64、1.46、1.79和0.95；離散度分別為53.27%、49.61%、65.18%和51.71%；感染狀態(tài)分為陽性穩(wěn)定Ⅱ類和陽性不穩(wěn)定Ⅰ類Ⅱ類(表1)。

表1 4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)前母豬群PRRS抗體抽檢結(jié)果

2.2 流產(chǎn)數(shù)跟蹤結(jié)果

對(duì)4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的懷孕后期母豬跟蹤至分娩，均未發(fā)現(xiàn)有母豬流產(chǎn)情況，表明懷孕母豬免疫PRRS弱毒疫苗VR-2332株后安全性良好，未出現(xiàn)流產(chǎn)情況。

2.3 產(chǎn)仔數(shù)跟蹤結(jié)果

4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組懷孕后期母豬分娩后產(chǎn)仔數(shù)跟蹤統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均產(chǎn)仔數(shù)分別為12頭和11.9頭、11.7頭和12.3頭、11.8頭和11.1頭、11.9頭和12.5頭(圖1)，試驗(yàn)組和對(duì)照組懷孕后期母豬的產(chǎn)仔數(shù)差異不顯著(P>0.05)。表明懷孕后期母豬免疫PRRS VR-2332株弱毒疫苗后對(duì)其產(chǎn)仔數(shù)無顯著影響。

2.4 死胎數(shù)跟蹤結(jié)果

4個(gè)豬場(chǎng)中，A場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均死胎數(shù)分別為14頭和3頭；B場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均死胎數(shù)分別為6頭和5頭；C場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均死胎數(shù)分別為8頭和12頭；D場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均死胎數(shù)分別為3頭和4頭。死胎數(shù)結(jié)果分析表明，A場(chǎng)試驗(yàn)組懷孕母豬分娩后死胎數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組平均死胎數(shù)差異不顯著(圖2)。

*差異顯著(P<0.05)

2.5 弱仔數(shù)跟蹤結(jié)果

4個(gè)豬場(chǎng)中，A場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均弱仔數(shù)分別為26頭和8頭；B場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均弱仔數(shù)分別為11頭和13頭；C場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均弱仔數(shù)分別為14頭和18頭；D場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的母豬平均弱仔數(shù)分別為15頭和10頭。弱仔數(shù)結(jié)果分析表明，A場(chǎng)試驗(yàn)組母豬平均弱仔數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組平均弱仔數(shù)差異不顯著(圖3)。

*差異顯著(P<0.05)

2.6 各試驗(yàn)豬場(chǎng)母豬分娩后20 d PRRS抗體水平檢測(cè)結(jié)果

4個(gè)豬場(chǎng)試驗(yàn)組母豬的S/P值陽性率為100%且離散度較小，對(duì)照組母豬的S/P值離散度較大，其中A場(chǎng)試驗(yàn)組母豬和對(duì)照組母豬PRRS抗體臨床參數(shù)差異顯著(P<0.05)，其他豬場(chǎng)試驗(yàn)組與對(duì)照組母豬PRRS抗體參數(shù)均無顯著差異。4個(gè)場(chǎng)試驗(yàn)組母豬的S/P值陽性率、S/P平均值及離散度等PRRS抗體參數(shù)均優(yōu)于對(duì)照組，其中A場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組的PRRS抗體參數(shù)差異最大，A場(chǎng)對(duì)照組母豬PRRS抗體陽性率和S/P值均值最低，分別為60%和0.72，同時(shí)離散度最大為76.81%；D場(chǎng)試驗(yàn)組母豬PRRS抗體離散度最低，為28.06%；試驗(yàn)組母豬S/P值基本都在0.4≤S/P<2.5的區(qū)間。各豬場(chǎng)試驗(yàn)組和對(duì)照組懷孕后期母豬分娩后20 d PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果表明，免疫PRRS VR-2332疫苗的試驗(yàn)組母豬的抗體參數(shù)明顯優(yōu)于未免疫的對(duì)照組(表2)。

表2 4個(gè)豬場(chǎng)母豬分娩后PRRS抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

PRRS一直以來都是困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要繁殖障礙性傳染病之一[8]，目前國(guó)內(nèi)一些規(guī)模豬場(chǎng)在正常生產(chǎn)過程中，還是會(huì)偶爾出現(xiàn)母豬群或者保育群PRRSV循環(huán)感染的問題。規(guī)模豬場(chǎng)PRRS發(fā)病的原因很多，比如后備母豬引種、外購精液攜帶PRRSV，不同豬群混群等原因都可以造成豬場(chǎng)PRRS發(fā)病。導(dǎo)致豬群發(fā)病的PRRSV毒株也很多，比如經(jīng)典毒株、高致病性毒株、NADC30-like及NADC34-like毒株等[9-10]。生產(chǎn)實(shí)踐中，利用PRRS弱毒活疫苗免疫預(yù)防PRRS疾病的暴發(fā)是規(guī)模豬場(chǎng)最常用的方法之一[11]。由于PRRSV的病毒特性及毒株的復(fù)雜性，目前市面上沒有一個(gè)理想的疫苗可以完全解決規(guī)模場(chǎng)PRRS疾病困擾[12]。規(guī)模豬場(chǎng)如果不免疫商品化PRRS疫苗，一旦出現(xiàn)PRRS暴發(fā)，會(huì)給豬場(chǎng)帶來巨大損失，這也導(dǎo)致了臨床上規(guī)模豬場(chǎng)常常需要對(duì)豬群進(jìn)行商品化PRRS疫苗免疫或者更換不同類型疫苗來降低豬場(chǎng)PRRS的發(fā)生[13]。許多規(guī)模場(chǎng)在更換PRRS疫苗過程中，會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定狀況，如懷孕后期母豬流產(chǎn)、產(chǎn)弱仔增多、保育豬死亡率增高等情況。PRRS疫苗在國(guó)內(nèi)外規(guī)模豬場(chǎng)免疫應(yīng)用相關(guān)研究很多，母豬群不建議普免大部分商品化PRRS疫苗，仔豬在4周齡左右免疫效果最好[14]，而VR-2332株疫苗說明書上顯示，該疫苗用于3周齡以上健康豬，母豬在配種前3周～4周進(jìn)行免疫，由于現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，規(guī)模場(chǎng)豬群PRRS感染情況復(fù)雜以及大環(huán)境中常存在PRRS野毒流行，VR-2332株疫苗常出現(xiàn)在母豬群的普免程序中[15]。

為進(jìn)一步了解VR-2332株疫苗對(duì)妊娠后期母豬的安全性和生產(chǎn)性能的影響，篩選了4個(gè)免疫背景不一樣的規(guī)模豬場(chǎng)，進(jìn)行妊娠后期母豬PRRS VR-2332疫苗免疫研究。對(duì)于未免疫過PRRS疫苗的規(guī)模豬場(chǎng)A場(chǎng)(PRRS陽性穩(wěn)定場(chǎng))，妊娠后期母豬免疫VR-2332株疫苗后，流產(chǎn)率、產(chǎn)仔數(shù)與對(duì)照組無顯著差別，但死胎數(shù)和弱仔數(shù)比對(duì)照組均有顯著增加，提示對(duì)從未免疫過PRRS疫苗的規(guī)模場(chǎng)，妊娠后期母豬群初次免疫VR-2332株疫苗時(shí)，可能會(huì)存在死胎數(shù)和弱仔數(shù)增加的風(fēng)險(xiǎn)，產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)損失。未免疫過PRRS疫苗的規(guī)模豬場(chǎng)D場(chǎng)(PRRS陽性穩(wěn)定場(chǎng))，妊娠后期母豬免疫VR-2332疫苗后，所有生產(chǎn)性能與對(duì)照組無顯著差別，表明不同未免疫規(guī)模豬場(chǎng)的懷孕母豬免疫VR-2332疫苗可能存在不同結(jié)果。對(duì)于免疫抗體參數(shù)較好的B場(chǎng)和C場(chǎng)，懷孕母豬免疫VR-2332疫苗后，無流產(chǎn)情況，死胎數(shù)和弱仔數(shù)均比對(duì)照組還要少，安全性和生產(chǎn)性能良好。盡管規(guī)模豬場(chǎng)C場(chǎng)為PRRS不穩(wěn)定豬場(chǎng)，在免疫VR-2332疫苗后，豬群不一定都導(dǎo)致PRRS癥狀加劇，死淘率增加，豬群也有可能得到較好較快的恢復(fù)，該結(jié)果與文獻(xiàn)[16]研究結(jié)果一致。因此，妊娠后期母豬免疫PRRS VR-2332疫苗對(duì)安全性和生產(chǎn)性能影響與高水平的免疫抗體有關(guān)，與是否為PRRS陽性穩(wěn)定群關(guān)系不密切。試驗(yàn)組和對(duì)照組母豬分娩后20 d血清PRRS抗體水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組母豬PRRS抗體S/P值更理想，且離散度低，為豬場(chǎng)防控PRRS提供了重要啟示。

本研究選擇了4個(gè)免疫背景不同的規(guī)模豬場(chǎng)進(jìn)行了妊娠后期母豬PRRS VR-2332疫苗小群免疫試驗(yàn)，證明PRRS VR-2332疫苗對(duì)抗體陽性率高的豬場(chǎng)妊娠后期母豬安全性和生產(chǎn)性能無影響。