潘鵬宇，韓金澤，殷建豪，謝艾伶，吳鳳明，劉鼎闊，孫英峰，尤春雪，于曉雪*，李留安*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)與動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2.天津市廣源畜禽養(yǎng)殖有限公司，天津 301806；3.鼎正新興生物技(天津)有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBDV引起的高度傳染性的免疫抑制性疾病[1,2]。該病使3周齡～12周齡雛雞法氏囊萎縮甚至壞死，雞只嚴(yán)重免疫抑制或死亡，對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)造成威脅。疫苗接種是預(yù)防該病的最有效措施。B87株IBDV是我國廣泛使用的IBDV疫苗株，該疫苗通過接種SPF雞胚，收獲感染雞胚，經(jīng)研磨、添加適宜穩(wěn)定劑、冷凍真空干燥等步驟制備，但生產(chǎn)工藝繁雜，成本較高。DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞是能無限繁殖的細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于多種病毒增殖、重組蛋白表達(dá)、動(dòng)物與人類病毒病疫苗生產(chǎn)等領(lǐng)域。本試驗(yàn)使用IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞，利用免疫熒光法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等比較兩種細(xì)胞對(duì)病毒的易感性，旨在為IBD疫苗規(guī)?；a(chǎn)篩選合適細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與毒株 DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞，保存于天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；IBDV活疫苗株B87，青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 RNAprep pure總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液、1×PBS緩沖液、DAPI溶液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Bovine Serum Albumin、FITC標(biāo)記山羊抗雞lgY，西格瑪集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；All-in-OneTMFirst-Stand cDNA Synthesis Kit，美國GeneCopoeia(中國)廣州復(fù)能基因有限公司產(chǎn)品；Anti-dsRNA mAb SCICONS J2(IgG2a)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；抗IBDV雞血清，保存于天津農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室。

1.1.3 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；溫度梯度定量PCR儀，美國艾爾特公司(ALT)產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì)，香港基因有限公司產(chǎn)品；正置倒置一體熒光顯微鏡，美國EchoLaboratories公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CPE觀察比較 DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板，每種細(xì)胞3個(gè)重復(fù)孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%～80%后接種IBDV疫苗株B87(MOI=1)，24 h后觀察并記錄CPE。

1.2.2 免疫熒光檢測 細(xì)胞爬片經(jīng)無水乙醇超聲30 min，高溫蒸汽滅菌并烘干后，置24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，分別接種相同細(xì)胞量DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞，細(xì)胞生長至70%～80%接種IBDV疫苗株B87，培養(yǎng)24 h，PBS清洗3次；40 mg/L多聚甲醛固定35 min，棄固定液，PBS清洗3次；1 mL/L Triton X-100 PBS室溫通透7 min，PBS清洗3次，50 g/L BSA封閉2 h。

J2抗體(dsRNA單克隆抗體，1∶500稀釋)或抗IBDV雞血清孵育1.5 h，PBS清洗2次～3次；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體或FITC標(biāo)記山羊抗雞lgY抗體孵育1 h，PBS清洗3次； DAPI染色液(1∶1 000稀釋)孵育5 min，PBS清洗4次；爬片取出后加入抗淬滅性溶劑封片，晾干后熒光顯微鏡觀察。

1.2.3 TCID50檢測 IBDV疫苗株B87感染DF-1或Vero細(xì)胞(MOI=0.1)24 h后，反復(fù)凍融3次，離心，取上清液測定TCID50。

DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞分別接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，生長至70%～80%后，DMEM維持液(20 mL/L胎牛血清，10 mL/L雙抗)10倍系列稀釋待測病毒液，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，取1×10-1～1×10-88個(gè)稀釋度病毒液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，對(duì)照組只加維持液100 μL/孔，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后進(jìn)行IFA檢測。

棄96孔板培養(yǎng)液，PBS清洗3次，40 mg/L多聚甲醛固定，PBS清洗3次，加入抗IBDV雞血清(1∶500稀釋)，25 μL/孔，4℃過夜；次日，PBS清洗3次，F(xiàn)ITC-標(biāo)記羊抗雞lgY抗體(1∶1 000稀釋)孵育1 h，PBS清洗3次，置熒光顯微鏡下觀察記錄陽性孔，Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.4VP2基因表達(dá)量檢測 參照文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道的引物序列合成實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞24 h后，PBS清洗2次，加入350 μL Trizol裂解液，渦旋振蕩，12 000 r/min離心2 min；取上清加入等量700 mL/L乙醇溶液，12 000 r/min離心1 min；棄上清加入350 μL去蛋白液，12 000 r/min離心1 min；棄上清加入80 μL DNaseI工作液室溫靜置15 min；加入350 μL去蛋白液，12 000 r/min離心1 min；棄上清，加入500 μL漂洗液靜置2 min，12 000 r/min離心1 min；反復(fù)操作2次后室溫放置晾干，加50 μL RNase-Free ddH2O。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，置-20℃保存待用。以獲得的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，15 μL PCR反應(yīng)體系包括：2×All-in-OneTMqPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板5.5 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 60 min；95℃ 15 s，55℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃ 15 s。

表1 引物序列信息

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用spss23.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞CPE程度對(duì)比

IBDV B87株分別感染DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞，24 h后觀察CPE，可見未接毒的DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞為成纖維狀貼壁，細(xì)胞形態(tài)為梭形。接毒后，兩種細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)改變，發(fā)生皺縮脫落，與DF-1細(xì)胞相比，Vero細(xì)胞CPE程度低于DF-1細(xì)胞(圖1)。

A.DF-1細(xì)胞未攻毒組；B.DF-1細(xì)胞攻毒組；C.Vero細(xì)胞未攻毒組；D.Vero細(xì)胞攻毒組

2.2 IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞中病毒基因組dsRNA對(duì)比

圖2和圖3顯示，DF-1細(xì)胞(圖2D～圖2F)中綠色熒光強(qiáng)度高于Vero細(xì)胞中(圖2A～圖2C)的熒光強(qiáng)度，且差異顯著(P<0.05)。說明DF-1細(xì)胞對(duì)IBDV B87株易感性強(qiáng)于Vero細(xì)胞，且dsRNA在兩種細(xì)胞中有相似的細(xì)胞質(zhì)定位。

圖2 IFA檢測IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞中基因組dsRNA水平(10×)

圖3 IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞中基因組dsRNA熒光強(qiáng)度水平

2.3 IBDV B87株感染后DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞病毒載量對(duì)比

IBDV B87株感染后，DF-1細(xì)胞(圖4A)中指示病毒量的熒光密度(雞抗IBDV血清標(biāo)記)高于Vero細(xì)胞(圖4B)。DF-1細(xì)胞的病毒滴度(105.423±0.03296TCID50/0.1 mL)極顯著高于Vero細(xì)胞中病毒滴度(102.592±0.03428TCID50/0.1 mL，P<0.01)(圖5A)，且DF-1細(xì)胞VP2基因表達(dá)量顯著高于Vero細(xì)胞(圖5B)(P<0.05)。此結(jié)果表明，IBDV B87株對(duì)DF-1細(xì)胞中病毒侵染能力顯著高于Vero細(xì)胞中，表明DF-1細(xì)胞對(duì)IBDV的易感性更強(qiáng)。

A.IFA檢測IBDV B87株感染DF-1細(xì)胞病毒量；B.IFA檢測IBDV B87株感染Vero細(xì)胞病毒量

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

3 討論

IBD的防控主要通過接種IBD疫苗實(shí)現(xiàn)。以IBDV活疫苗株B87生產(chǎn)的疫苗是我國家禽養(yǎng)殖中常用的疫苗之一，通常是接種易感SPF雞胚制備而成，成本較高，因此尋求高效增殖IBDV方式、降低疫苗生產(chǎn)成本具有重要意義。DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞是疫苗研制、病毒增殖、病毒致病機(jī)理探究等領(lǐng)域常用細(xì)胞系。研究發(fā)現(xiàn)IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞中可大量增殖[5]。Vero細(xì)胞是具有無限增殖能力的非洲綠猴腎臟上皮細(xì)胞[6]，已報(bào)道對(duì) IBDV BJ836株高度敏感[7]。雖然IBDV可天然靶向未成熟的雞法氏囊B淋巴細(xì)胞，但I(xiàn)BDV弱毒株也能在DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞中體外增殖[8]。本試驗(yàn)以相同感染復(fù)數(shù)的IBDV疫苗株B87感染DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其在DF-1細(xì)胞中感染性更強(qiáng)，表明較Vero細(xì)胞而言，DF-1細(xì)胞更適用于進(jìn)行IBDV疫苗株B87增殖，未來將開展試驗(yàn)對(duì)比DF-1細(xì)胞和SPF雞胚增殖該疫苗株效率，為替代雞胚進(jìn)行疫苗生產(chǎn)、降低成本提供參考。

IBDV侵染宿主細(xì)胞時(shí)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞嗜性差異。細(xì)胞嗜性的差異主要是由于不同宿主細(xì)胞受體介導(dǎo)引起的，目前已知的受體主要包括SlgM免疫球蛋白、熱休克蛋白90、整合素α4β1、Toll樣受體等。除此以外，VP2為IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白，可影響病毒的功能，也與IBDV毒力和細(xì)胞嗜性相關(guān)[8-9]，其氨基酸位點(diǎn)Q253H、D279N及A284T被認(rèn)為是決定IBDV細(xì)胞嗜性的分子基礎(chǔ)[10-11]。有研究證明，Q253H和A284T雙突變毒株可在CEF中有效復(fù)制，定點(diǎn)突變vvIBDV P07突變株D279N可使IBDV適應(yīng)雞胚成纖維細(xì)胞生長，引起細(xì)胞嗜性的改變[12-13]。本研究檢測到DF-1細(xì)胞中VP2基因表達(dá)量顯著高于Vero細(xì)胞，說明IBDV疫苗株B87在DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞中的增殖表現(xiàn)出細(xì)胞嗜性差異。病毒滴度方面，DF-1細(xì)胞中病毒載量更高，也說明該細(xì)胞系對(duì)IBDV疫苗株B87的易感性更強(qiáng)。IBDV疫苗株B87感染兩種細(xì)胞系表現(xiàn)出不同的增殖效果，一方面可能是毒株在不同細(xì)胞中的細(xì)胞嗜性差異所造成，另一方面可能是由于DF-1細(xì)胞與Vero細(xì)胞中的IBDV受體存在差異，造成病毒吸附、侵入及增殖作用不同，這些需要更多的試驗(yàn)證據(jù)。

本研究結(jié)果表明，與Vero細(xì)胞相比，IBDV疫苗株B87在DF-1細(xì)胞中感染性更強(qiáng)，提示DF-1細(xì)胞可作為工具細(xì)胞進(jìn)行IBDV增殖及致病機(jī)理研究。