劉 威，蔣鵬程,2，楊克禮，袁芳艷，周丹娜，劉澤文，高 婷，郭 銳，孫 裴，田永祥*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuro pneumonia,CCPP)是山羊的一種急性或慢性高度接觸性傳染病，感染羊常發(fā)生高熱、胸外膜炎和纖維素性肺炎等癥狀[1-2]，世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)將其列為法定報告動物傳染病[3]。山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是引起CCPP的常見病原體之一[4]。Mccp最早在肯尼亞從急性感染胸膜肺炎的山羊中被分離得到[5]，隨后阿曼、阿聯(lián)酋、埃塞俄比亞、尼日爾、突尼斯、土耳其、蘇丹、乍得等國家均報道成功分離Mccp，我國2007年首次成功分離，用病原學(xué)方法證實(shí)為 CCPP 病原[6]。近年在我國河南、新疆、黑龍江、甘肅、內(nèi)蒙古、湖北等16個省或自治區(qū)均報道有CCPP病例，是影響我國山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大疾病之一[7-8]。

山羊支原體山羊肺炎亞種、絲狀支原體絲狀亞種SC型、山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體絲狀亞種LC型和絲狀支原體山羊亞種均屬于絲狀支原體簇，簇成員之間血清學(xué)性質(zhì)相似，引起的臨床癥狀也十分類似[9-14]。針對該病病原復(fù)雜、臨床鑒別難的特點(diǎn)，建立一種敏感、特異的Mccp檢測方法尤為重要，診斷靶標(biāo)的挖掘是檢測方法建立的關(guān)鍵。研究表明，豬肺炎支原體P36乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)蛋白存在決定種屬特異性的抗原決定簇[15]，是豬肺炎支原體的一個重要診斷靶標(biāo)，廣泛應(yīng)用在豬肺炎支原體的血清學(xué)診斷方法中。研究表明，利用P36建立的豬肺炎支原體血清學(xué)檢測方法，在檢測豬絮狀支原體、豬鼻支原體、豬圓環(huán)病毒時不存在交叉反應(yīng)[16]，抗P36的多克隆抗體與近源菌株也沒有交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出了很高的種屬特異性[17]。山羊支原體山羊肺炎亞種的LDH還未見報道。本研究以編碼Mccp LDH的MCCG-0521基因?yàn)檠芯繉ο?，擬采用生物信息學(xué)方法分析Mccp LDH的特性，對LDH基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后構(gòu)建LDH的原核表達(dá)載體，以期獲得LDH的原核表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、基因組DNA及載體 大腸埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存；山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)87001基因組DNA由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈。

1.1.2 主要試劑 羊抗鼠IgG和鼠源抗His-tag單克隆抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色試劑，Thermo公司產(chǎn)品；Ni-NTA Agarose，GE公司產(chǎn)品；快速定點(diǎn)突變試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DNA聚合酶、T4連接酶、核酸內(nèi)切酶，TaKaRa公司產(chǎn)品；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱(DW-86L626)，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；超凈臺(SW-CJ-1FD)，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超高壓低溫細(xì)胞破碎儀(JN-MINI)，廣州聚能公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(GenoSens1880)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；制冰機(jī)(SIM-F140LADL)，大連松下電器公司產(chǎn)品；梯度PCR 儀(SimpliAmp)，ABI公司產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)(5810R)，德國 Eppendorf 公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)(GelDocTMXR)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 Mccp87001株LDH基因在NCBI中的登陸號為AJK51481.1，LDH的跨膜區(qū)域?yàn)?-29位氨基酸，因此PCR擴(kuò)增引物根據(jù)其胞外區(qū)核酸序列(88 bp-951 bp)設(shè)計。上游引物L(fēng)DH-F為：5′-TCTGGATCCATGGCAGAACACTATGT-3′，引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物L(fēng)DH-R為：5′-CTCGTCGACTTATTAAAATAAATGTTTAAC-3′，引入SalⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以山羊支原體山羊肺炎亞種87001株基因組DNA為模板，用Primer Star DNA聚合酶對LDH基因的胞外區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 5 min；98℃ 10 s,51℃ 15 s,72℃ 1min,35個循環(huán)；72℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳后，將大小正確的PCR條帶切膠后，通過DNA回收試劑盒進(jìn)行回收與純化。

用BamHⅠ和SalⅠ分別對pET-30a(+)載體和上述純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架和目的基因片段，并用T4連接酶于4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序鑒定無誤的重組質(zhì)粒命名為pET30a-LDH。

1.2.3 LDH的密碼子改造 UGA在支原體中翻譯為色氨酸，而在大腸埃希氏菌中卻翻譯為終止密碼子。用Atermis可視化軟件對LDH的密碼子進(jìn)行分析，在LDH基因中發(fā)現(xiàn)了3處UGA,設(shè)計3對引物(表1)，并用定點(diǎn)突變試劑盒進(jìn)行LDH的密碼子改造，改造后的重組質(zhì)粒命名為pET30a-△LDH。

表1 LDH基因密碼子改造的引物序列

1.2.4 pET30a-△LDH的誘導(dǎo)表達(dá)及目的蛋白純化 將pET30a-△LDH轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)或Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱中，當(dāng)培養(yǎng)物OD600nm值達(dá)到0.6時，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h或22℃誘導(dǎo)16 h，同時設(shè)置空載體和未誘導(dǎo)對照組。SDS-PAGE檢測重組質(zhì)粒表達(dá)情況。

pET30a-△LDH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)后，12 000 r/min離心10 min收集菌體，采用高壓細(xì)胞破碎儀破碎菌體，離心后沉淀通過尿素溶解，并與Ni-NTA Agarose混勻，過柱純化，用不同濃度的咪唑洗脫，洗脫液用SDS-PAGE檢測。純化后蛋白置于0.01 mol/L PBST (pH 8.0)中，于4℃透析，透析過程中通過磁力攪拌棒持續(xù)攪拌促進(jìn)溶液交換，并隔段時間更換洗脫液，透析完成后將蛋白保存在-80℃冰箱備用。

1.2.5 Western blot驗(yàn)證 LDH蛋白通過SDS-PAGE分離后，利用Western blot轉(zhuǎn)膜儀器轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，PBST洗5次，每次3 min，隨后用10 mL 30 g/L脫脂奶粉封閉，一抗采用鼠源anti-His tag的單克隆抗體(1∶5 000稀釋，37℃孵育1 h)，二抗用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000稀釋，37℃孵育1 h)，PBST洗膜5次，每次3 min，去除未結(jié)合的抗體，并使用底物化學(xué)發(fā)光ECL顯色和圖像獲取。

2 結(jié)果

2.1 LDH蛋白序列生物信息學(xué)分析

用TMHMM-2.0分析了LDH蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示LDH的胞外區(qū)為1-6位氨基酸、跨膜區(qū)為7-29位氨基酸、胞外區(qū)為30-317位氨基酸(圖1)。用SignalP -5.0分析了LDH的信號肽區(qū)域，結(jié)果顯示LDH的信號肽位于1-23位氨基酸(圖2)。采用NetOGlyc-4.0分析了LDH胞外區(qū)的O-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果表明LDH存在3處潛在的O-糖基化位點(diǎn)，位于第22、26、108位氨基酸。

圖1 LDH蛋白跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

圖2 LDH蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

2.2 pET30a-LDH重組載體的構(gòu)建及密碼子改造

以山羊支原體山羊肺炎亞種87001株基因組DNA為模板，用Primer Star DNA聚合酶對LDH基因的胞外區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其連接至pET-30a(+)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-LDH，序列測定分析后證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。針對LDH基因中的3處TGA通過快速定點(diǎn)突變試劑盒依次將其突變?yōu)門GG。密碼子改造后的重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測定，測序結(jié)果證實(shí)LDH中473、761、779 nt處的A成功突變?yōu)镚(圖3)，該重組質(zhì)粒命名為pET30a-△LDH。

圖3 密碼子改造前后的序列比對

2.3 LDH融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

pET30a-△LDH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析表達(dá)情況，結(jié)果顯示,pET30a-△LDH轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，在37℃誘導(dǎo)4 h和22℃誘導(dǎo)16 h條件下，在約34 ku處均可見一條蛋白條帶，蛋白大小與理論值一致，表明密碼子改造后的pET30a-△LDH在大腸埃希氏菌 Rosetta中成功表達(dá)；而pET30a-△LDH轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后，在37℃誘導(dǎo)4 h和22℃誘導(dǎo)16 h后均未見目的蛋白的表達(dá)(圖4)。

2.4 融合蛋白的純化

pET30a-△LDH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，采用Ni-NTA Agarose過柱純化，不同濃度咪唑的洗脫產(chǎn)物用SDS-PAGE跑膠檢測，經(jīng)PBST透析和蔗糖濃縮后獲得純化的LDH蛋白(蛋白濃度為0.75 mg/mL，大小約為34 ku)，置-80℃保存，用于后續(xù)功能的研究(圖5A)。

以鼠源anti-His tag的單克隆抗體(1∶5 000稀釋)為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，Western blot結(jié)果顯示，在約34 ku處有一條蛋白條帶，蛋白大小與預(yù)期一致(圖5B)。

A.LDH蛋白的純化；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Ni2+柱親和層析純化后的蛋白；B.Western blot驗(yàn)證；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET30a-△LDH誘導(dǎo)3 h；2.pET30a誘導(dǎo)3 h

2.5 LDH主要抗原域預(yù)測

用Jameson-Wolf對LDH胞外區(qū)的288個氨基酸進(jìn)行抗原域的預(yù)測，結(jié)果表明LDH的主要抗原域位于：Phe9-Leu18、Ile34-Val47、Thr51-Ala70、Glu71-Gly87、Thr119-Gly131、Leu134-Ala143、Glu148-Val154、Glu179-Ala192、Val217-Leu225、Leu231-Tyr241、Asp260-Val283(圖6)。

2.6 LDH的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用DNAStarProtean對LDH胞外區(qū)的288個氨基酸進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。Chou-Fasman法共預(yù)測了9個α螺旋中心，12個β折疊區(qū)段，19個T轉(zhuǎn)角區(qū)段；Garnier-Robson法共預(yù)測了13個α螺旋中心，20個β折疊區(qū)段，6個T轉(zhuǎn)角區(qū)段。Chou-Fasman和Gamier-Robson同時預(yù)測的α螺旋中心有8處，即Asn16-Asp9、Glu60-Met65、Ala70-Val80、Ala124-Leu126、Leu178-Ile184、Val189-Ala192、Glu221-Leu231、Ile2571-Phe269；同時預(yù)測的β折疊區(qū)段有12處。蛋白骨架的柔性區(qū)域，用Karplus-Schulz法進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明LDH有16處柔性區(qū)域，同時用Emini方法分析了LDH中特定區(qū)域位于表面的可能性(圖6)。

Alpha helix：α螺旋；Beta-pleated sheet：β折疊；Turn：T轉(zhuǎn)角；Flexible regions：柔性區(qū)域；Antigenic index：主要抗原域；Surface probability：表面可及性

3 討論

支原體相對病毒和細(xì)菌而言整體研究相對滯后，其密碼子使用與常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)存在差異，給支原體功能基因的研究造成了阻礙。L-乳酸脫氫酶是L-lactate dehydrogenase基因編碼的產(chǎn)物，研究表明，豬肺炎支原體的L-乳酸脫氫酶具有種屬特異性的抗原決定簇[17]，是其重要的診斷靶標(biāo)，廣泛應(yīng)用在豬肺炎支原體的血清學(xué)檢測方法中。然而，山羊支原體山羊肺炎亞種的LDH還未見報道?；虮磉_(dá)產(chǎn)物的成功獲得是進(jìn)一步研究其功能的前提，然而UGA在支原體中翻譯為色氨酸，在大腸埃希氏菌中為終止密碼子，導(dǎo)致含有UGA密碼子的支原體基因在大腸埃希氏菌中無法正確表達(dá)，給基因功能的研究造成了阻礙。

本研究以Mccp的MCCG-0521 LDH為研究對象，通過生物信息學(xué)方法，分析了其跨膜區(qū)、信號肽等，并選取其胞外區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)。在完成了基因的克隆后，我們將LDH中的3處TGA進(jìn)行了定點(diǎn)突變，使TGA突變?yōu)門GG，以期使LDH基因能在大腸埃希氏菌BL21 (DE3)或Rosetta中正確表達(dá)。在原核表達(dá)時，我們首先將重組質(zhì)粒pET30a-△LDH轉(zhuǎn)化入E.coliBL21 (DE3)中，然而經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE并未檢測到目的條帶。隨后，我們嘗試了E.coliRosetta菌株，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞后，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h以及22℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，出現(xiàn)了一條約34 ku的條帶，大小與預(yù)期一致。Western blot進(jìn)一步證實(shí)LDH在大腸埃希氏菌系統(tǒng)中正確表達(dá)。

B細(xì)胞抗原受體或抗體可以特異性識別和結(jié)合抗原中的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，該線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)稱為B細(xì)胞表位。研究表明，轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域常位于蛋白的表面，易與抗體結(jié)合，B細(xì)胞表位位于這些區(qū)域的可能性較大[18]。通過分析LDH蛋白的轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲、親水性區(qū)域、柔性區(qū)域，預(yù)測了LDH可能的B細(xì)胞表位，結(jié)果顯示該蛋白的B細(xì)胞表位極可能位于Pro10-Glu14、Gly37-Cys42、Gly53-Leu63、Thr78-Gly84、Leu134-Ser140、Gln183-Val189、Arg219-Ala223、Leu231-Tyr241、Asp260-Asp270這些區(qū)段。綜上所述，本研究以山羊支原體山羊肺炎亞種MCCG-0521基因?yàn)檠芯繉ο?，通過定點(diǎn)突變技術(shù)完成了該基因的密碼子改造，使其具備在大腸埃希氏菌系統(tǒng)中表達(dá)的可能，隨后通過不同感受態(tài)細(xì)胞的篩選以及誘導(dǎo)條件的摸索，最終獲得了MCCG-0521基因的體外表達(dá)產(chǎn)物，分析了其編碼氨基酸的二級結(jié)構(gòu)和可能的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位，LDH表達(dá)產(chǎn)物的成功獲得為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。