黃婧潔，李 苗，陳瑩嫻，鐘雅蘭，張婷婷，姜廷超男，李建成*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)為人工合成的抗菌藥，它能抑制細(xì)菌DNA螺旋酶[1]，干擾DNA合成，具有抗菌譜廣、高效、低毒等特點(diǎn)，廣泛用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖[2-4]。沙拉沙星是喹諾酮類化合物第三代產(chǎn)品——氟喹諾酮類藥物的一種，是第一個(gè)被美國(guó)批準(zhǔn)用于食品動(dòng)物的氟喹諾酮類藥物，有報(bào)道表明沙拉沙星(sarafloxacin, SAR)在體內(nèi)分布極為廣泛，組織穿透力強(qiáng)具有較強(qiáng)的抗菌活性，可用于全身及深部組織感染的治療[5]，因此在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛?？梢宰鳛榉Z酮類藥物的代表藥物進(jìn)行研究，但該類藥物有潛在的致癌性和遺傳毒性，誘發(fā)低血糖[6]，并進(jìn)一步危害人類的身體健康[7]，因此其殘留監(jiān)控和檢測(cè)必不可少。目前，氟喹諾酮藥物常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[8-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-13]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[14]、毛細(xì)管電泳法(CE)[15]、膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)、化學(xué)發(fā)光法(CL)[16-17]、比色法[18]等。與其他方法相比，免疫法具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物的快速檢測(cè)。

免疫磁珠(immunomagnetic beads, IMB)是發(fā)展起來的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)，是運(yùn)用核-殼的合成方法合成含有超順磁性物質(zhì)的高分子表面覆蓋的復(fù)合材料，其穩(wěn)定性好、能進(jìn)行后期標(biāo)記，利用這些物質(zhì)表面的功能基團(tuán)如氨基、羧基、巰基等進(jìn)行抗體的共價(jià)或者非共價(jià)偶聯(lián)[19-21]，可用于結(jié)合相應(yīng)的抗原或抗體，在外加磁場(chǎng)下做定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離，檢測(cè)的目的[22-24]。童麗[25]運(yùn)用免疫磁珠結(jié)合化學(xué)發(fā)光法，實(shí)現(xiàn)了赭曲霉毒素a的快速檢測(cè)。免疫磁珠最近也被證明是能檢測(cè)人類腫瘤的標(biāo)志物，具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)[26-28]。Olejnik等[29]和Tian等[30]對(duì)免疫磁珠凈化和SPE前處理進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，免疫磁珠清除法有較高的準(zhǔn)確性和特異性，且材料可以重復(fù)使用。與傳統(tǒng)的親水親油平衡柱凈化法相比，該方法的抑制效率和靈敏度均有所提高，此外免疫磁珠凈化法簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好，滿足國(guó)內(nèi)外殘留檢測(cè)的要求，在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的前景，為復(fù)雜基質(zhì)中藥物殘留的分析提供了一種新方法，新思路。

本研究建立了一種高效、簡(jiǎn)便的基于免疫磁珠凈化的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)檢測(cè)雞肉、雞肝和魚肉中氟喹諾酮類藥物的檢測(cè)方法。將代表藥物沙拉沙星單克隆抗體固定在直徑為2.8 μm的羧基化磁珠表面。簡(jiǎn)單提取后，藥物被免疫磁珠特異性吸附，上清液被磁選去除。在icELISA之前，通過甲醇洗脫釋放保留在磁珠上的分析物，分別對(duì)免疫磁珠制備、免疫磁珠凈化和icELISA條件進(jìn)行了優(yōu)化，該法準(zhǔn)確可靠，方便快速，靈敏高效，可滿足11種氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)的要求，在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

羧基磁珠：生物級(jí)，蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；沙拉沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、培氟沙星、奧比沙星、依諾沙星、鹽酸二氟沙星、達(dá)氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、鹽酸金霉素、美他環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、吉他霉素、替米考星、羅紅霉素：標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、蔗糖、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、疊氮化鈉(NaN3)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、Tween-20、嗎琳乙磺酸(MES)、0.1 mol·L-1鹽酸溶液、濃硫酸溶液、Proclin 300：生物級(jí)，美國(guó)Sigma公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、甲醇、乙腈：生物級(jí)，阿拉丁公司；沙拉沙星單克隆抗體、沙拉沙星包被原(SAR-OVA)、底物顯色液(A/B液)、羊抗鼠IgG，北京維德維康生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：美國(guó) Thermo公司。

試驗(yàn)所用雞肉、雞肝、魚肉為市場(chǎng)購(gòu)買，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)為氟喹諾酮類藥物陰性。0.1 mol·L-1MEST緩沖液、0.1 mol·L-1PBS緩沖液、0.1 mol·L-1碳酸鹽緩沖液(CB液，包被用)均為實(shí)驗(yàn)室配制。磁珠用封閉液(0.1 mol·L-1，500 mL 0.01 mol·L-1PBST中加入25 g脫脂奶粉，混勻備用)；ELISA用封閉液(0.05 mol·L-1，Na2HPO4·12H2O 5.8 g，NaH2PO4·2H2O 0.693 g，蔗糖 50 g，酪蛋白 2.5 g，小牛血清50 mL，Proclin 500 mL，加蒸餾水水定容至1 L)；酶稀釋液(750 mL蒸餾水中加入Na2HPO4·12H2O 4.35 g，NaH2PO4·2H2O 0.65 g，甘油50 mL，恒溫加熱攪拌12 h，待冷卻室溫后加入小牛血清200 mL、Proclin 300 mL，混合均勻，4 ℃保存?zhèn)溆?。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Multiskan FC酶聯(lián)免疫測(cè)定儀：美國(guó)Thermo公司；Quattro LC超高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó) Waters 公司；Mag-12-1-2磁分離架：深圳市博爾熙科技發(fā)展有限公司；BE-1200z旋轉(zhuǎn)混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Primo R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)賀力氏臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；PHSJ-3F pH檢測(cè)儀：上海雷磁儀器有限公司；WH-I 型微型漩渦混合儀：上海儀電分析儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RP508恒溫?fù)u床：上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 制備免疫磁珠與條件優(yōu)化

1.3.1 磁珠活化 取100 μL(10 mg·mL-1)羧基化磁珠于 2 mL圓底離心管內(nèi)，渦旋混勻10 s，置于磁分離架上磁性分離3 min，去除上清。加入200 μL MEST (pH 7.2)洗滌磁珠，渦旋混勻 10 s，磁分離去除上清，重復(fù)洗滌3次。加入新鮮配置EDC(10 mg·mL-1)和 NHS(10 mg·mL-1)各 100 μL活化磁珠，置于垂直混合儀上，25 ℃活化30 min。加入MEST 200 μL洗滌磁珠，渦旋混勻10 s，磁分離去除上清，重復(fù)洗滌2次后，去上清備用。

1.3.2 抗體與磁珠偶聯(lián)及優(yōu)化 分別添加5、10、15、20、25 μg 5個(gè)水平的沙拉沙星單克隆抗體至上述離心管，控制單一變量，添加五個(gè)pH(4.4～8.4)水平的PBST緩沖液使總體積為100 μL，渦旋混勻室溫孵育時(shí)間分別為30、60、90、120 min。離心管置于磁力架上分離3 min，收集上清液和第1次PBST緩沖液清洗的上清(使用BCA試劑盒測(cè)定上清液中沙拉沙星單克隆抗體的濃度，每種上清液做3份平行，取平均值根據(jù)體積100 μL，計(jì)算上清液中的抗體剩余量，按式(1)計(jì)算偶聯(lián)率)，重復(fù)洗滌3次。在旋渦混合儀上加入200 μL PBST緩沖溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.4，5%脫脂奶粉)封閉1 h后磁分離去上清， 0.01 mol·L-1PBST緩沖液洗滌3次后，根據(jù)磁珠使用說明，用200 μL PBST(含0.02 mL·L-1Proclin 300，0.1 mL·L-1BSA)重懸磁珠能維持磁珠性能穩(wěn)定，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(1)

1.3.3 免疫磁珠穩(wěn)定性測(cè)定 取200 μL濃度為1 mol·L-1的NaCl溶液對(duì)偶聯(lián)了抗體的磁珠分別洗脫3次、5次，除去磁珠表面結(jié)合很松散的抗體，通過使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)NaCl溶液連續(xù)洗脫后上清中剩余抗體量，從而確定抗體偶聯(lián)量。按式(2)計(jì)算免疫磁珠偶聯(lián)抗體的穩(wěn)定性。

(2)

其中，φ表示免疫磁珠穩(wěn)定性(%)，z1為洗脫后免疫磁珠上偶聯(lián)的抗體量，z2為洗脫前免疫磁珠上偶聯(lián)的抗體量。

1.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1 免疫磁珠捕獲抗原與抗原洗脫的優(yōu)化 吸取已經(jīng)制備好的免疫磁珠1.5 mg (50 μL)于1.5 mL尖底離心管中，用500 μL PBST (pH 6.4)洗滌，重復(fù)3 次，置于磁力架上分離，棄上清備用。分別取1、10、100 ng·mL-1的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL加入上述離心管，確定最佳抗原添加量，室溫孵育時(shí)間分別為20、30、40 min，磁力架分離收集上清。用 PBST (pH 6.4) 洗滌 4 次，分別取400 μL, 60～100 mL·L-15個(gè)不同濃度甲醇水溶液洗脫抗原，37 ℃洗脫6 min，磁力架分離并收集上清。用500 μL PBST(含0.02 mL·L-1NaN3，0.5 mL·L-1BSA)重懸磁珠，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。免疫磁珠捕獲抗原和抗原洗脫的情況分別用吸附率式(3)和洗脫率式(4)來評(píng)價(jià)。

(3)

(4)

1.4.2 沙拉沙星單克隆抗體交叉反應(yīng)率 采用icELISA方法，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品分別為不同濃度的10種常見的氟喹諾酮類藥物，3種四環(huán)素類藥物和2種大環(huán)內(nèi)酯類藥物，計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)物的IC50。用式(5)計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)率：

(5)

1.4.3 icELISA方法的優(yōu)化 SAR-OVA稀釋至實(shí)際濃度約為4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1，SAR單抗分別稀釋1 000倍、3 000倍、9 000倍、27 000倍，根據(jù)OD450 nm為1.5左右時(shí)ELISA試驗(yàn)靈敏度較高，選擇抗體的最佳稀釋倍數(shù)為3 000，濃度約為1.5 μg·mL-1，包被原的濃度選擇2 μg·mL-1。用免疫磁珠凈化抗原后，建立icELISA方法來檢測(cè)抗原量。將2 μg·ml-1SAR-OVA以100 μL·孔-1加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，37 ℃溫育2 h。以PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)為洗液，洗滌兩遍，甩干。封閉：加入150 μL·孔-1的封閉液，37 ℃溫育1 h，直接甩干。沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品以50 μL·孔-1加入96孔酶標(biāo)板，零標(biāo)孔加入PBS，每孔各加2 μg·mL-1沙拉沙星單抗50 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌4次，甩干。加入酶標(biāo)二抗(酶稀液1∶5 000倍稀釋)100 μL·孔-1，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌4次，甩干。加入新鮮配置底物顯色液A液和B液(1∶1)混合液100 μL·孔-1，室溫避光反應(yīng)15 min后加入濃硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)得OD450 nm。為了提高檢測(cè)的靈敏度，對(duì)用單抗建立的 icELISA 方法進(jìn)行優(yōu)化，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，優(yōu)化過程中設(shè)立3個(gè)平行，1個(gè)空白對(duì)照。ELISA結(jié)果的IC50通過軟件origin8.5計(jì)算，抑制率通過以下公式(6)計(jì)算：

(6)

以單一變量的原則，通過對(duì)包被條件(4 ℃包被過夜、室溫包被2 h和37 ℃包被2 h)、包被液(CB溶液和PBS溶液)與封閉液(0.2%和0.5%脫脂奶粉水溶液、0.05 mol·L-1BSA封閉液)、封閉時(shí)間(30、60、90、120 min)、緩沖液中離子濃度(0、0.01、0.05、0.2 mol·L-1的PBS緩沖液)及二抗最佳反應(yīng)時(shí)間(15、30、60 min)分別優(yōu)化。根據(jù)上述優(yōu)化試驗(yàn)選出的最佳icELISA條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。

1.4.4 樣品的添加回收試驗(yàn)

1.4.4.1 樣品前處理：稱取均質(zhì)后的雞肉、雞肝、魚肉樣品各(1.0±0.02) g，置于50 mL離心管中，空白雞肉、雞肝中加入甲醇，魚肉中加入乙腈，各8 mL，勻質(zhì)儀24 000 r·min-1混合10 s，旋渦震蕩5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清至10 mL離心管中，37 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL 2.5 mL·L-1的甲醇-PBST(含0.25%甲醇的PBST溶液)復(fù)溶。

1.4.4.2 基質(zhì)加標(biāo)：向待檢樣品加入適量沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、10 ng·mL-1。向免疫磁珠離心管中加入500 μL上述制備的待檢樣品，渦旋混勻，37 ℃搖床上反應(yīng)30 min，磁分離后，用PBST溶液洗滌免疫磁珠3次。再向磁珠中加入500 μL 90 mL·L-1甲醇水，重懸磁珠，渦旋混勻，37 ℃搖床上反應(yīng)30 min以洗脫抗原，磁分離架分離保存上清液，所述上清液即為icELISA待檢樣品。以添加濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450 nm值為縱坐標(biāo)，用Origin8.5軟件進(jìn)行非線性擬合分析，得到雞肉、雞肝和魚肉基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析基質(zhì)效應(yīng)大小。

1.4.4.3 檢測(cè)限的確定：分別測(cè)定20份空白雞肉、雞肝和魚肉樣品，經(jīng)前處理后進(jìn)行icELISA檢測(cè)，取OD450 nm的平均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，對(duì)應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度即為檢測(cè)限(LOD)[31]。

1.4.4.4 準(zhǔn)確度與精密度的測(cè)定：分別在空白雞肉、雞肝和魚肉樣品中添加經(jīng)2.5 mL·L-1甲醇-PBST溶液(含0.25%甲醇的PBST溶液)稀釋的沙拉沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、培氟沙星、奧比沙星、依諾沙星、鹽酸二氟沙星、達(dá)氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星11種標(biāo)準(zhǔn)品，至終濃度分別為1、2和4 μg·kg-1，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)平行，經(jīng)前處理后稀釋10倍進(jìn)行icELISA檢測(cè)，測(cè)定樣品OD450 nm值，根據(jù)建立的基質(zhì)加標(biāo)曲線計(jì)算出各個(gè)樣品中藥物濃度，計(jì)算添加回收率式(7)和變異系數(shù)。

(7)

1.4.5 與儀器方法比較 取10份經(jīng)LC-MS/MS確證為氟喹諾酮類藥物陰性的雞肉樣品，加入沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品使其濃度分別為1.0、2.0和4.0 μg·kg-1，同時(shí)使用本研究所建立的icELISA方法和GB 31650—2019《動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)-高效液相色譜法》(農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008)標(biāo)準(zhǔn)[32]進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)2種測(cè)定方法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 免疫磁珠制備條件優(yōu)化

選用5個(gè)水平的沙拉沙星單克隆抗體添加量與羧基磁珠偶聯(lián)，結(jié)果見圖1a，當(dāng)抗體添加量達(dá)到15 μg時(shí)，偶聯(lián)率達(dá)到最大。本試驗(yàn)選擇添加15 μg的抗體與磁珠偶聯(lián)。反應(yīng)體系中的pH會(huì)影響抗體氨基和羧基磁珠的反應(yīng)程度，過酸或過堿條件會(huì)影響抗體的活性，通過在pH 5個(gè)水平的PBST緩沖液中偶聯(lián)磁珠與抗體，確定偶聯(lián)緩沖液的最佳pH。所測(cè)得的偶聯(lián)率見圖1b，pH在4.4左右時(shí)，抗體與免疫磁珠偶聯(lián)率最高?？贵w與磁性微球偶聯(lián)的時(shí)間結(jié)果見圖1c，偶聯(lián)率隨時(shí)間增加而逐漸升高，偶聯(lián)時(shí)間在90～120 min時(shí)，偶聯(lián)率增加不明顯。為了達(dá)到最佳效果同時(shí)節(jié)省時(shí)間成本，選擇偶聯(lián)時(shí)間為90 min，對(duì)偶聯(lián)抗體的磁珠洗脫3、5次穩(wěn)定性分別為99.96%和89.34%，為保證磁穩(wěn)定性，磁珠重復(fù)利用次數(shù)為3次。

2.2 免疫磁珠凈化條件優(yōu)化

本研究選擇1、10、100 ng·mL-13個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液沙拉沙星，用吸附率來評(píng)價(jià)不同濃度抗原中免疫磁珠對(duì)抗原的吸附情況。如圖1 d所示，隨著抗原添加濃度的增大，抗原吸附率也隨之增大，在沙拉沙星藥物添加量為1 ng·mL-1濃度時(shí)，抗原吸附率為53.31%，說明本研究制備的免疫磁珠可捕獲到微量的藥物分子。圖1e展示了抗原捕獲反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果。在40 min時(shí)，抗原吸附率達(dá)到最大。選擇不同濃度的甲醇水作為洗脫液，優(yōu)化結(jié)果見圖1f。

圖中數(shù)值表示(每個(gè)數(shù)值代表3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值)：a. 不同抗體添加量下的偶聯(lián)率；b. 不同pH緩沖液下的偶聯(lián)率；c. 不同偶聯(lián)時(shí)間下的偶聯(lián)率；d. 不同抗原添加量的抗原吸附率；e. 不同時(shí)間下的抗原吸附率；f. 不同洗脫液下免疫磁珠洗脫率

2.3 沙拉沙星單克隆抗體交叉反應(yīng)率

交叉反應(yīng)率是評(píng)價(jià)單克隆抗體特異性的重要標(biāo)志，本研究的沙拉沙星單克隆抗體具有廣譜性，與10種氟喹諾酮類藥物具有良好的交叉反應(yīng)，可用于氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)。與四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物均沒有交叉反應(yīng)，說明該抗體具有良好的特異性，結(jié)果見表1。

表1 沙拉沙星單克隆抗體的交叉反應(yīng)率測(cè)定結(jié)果

2.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的優(yōu)化

為了提高檢測(cè)的靈敏度，根據(jù)IC50和零標(biāo)孔OD450(B0)，確定最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明。選擇37 ℃孵育2 h作為包被條件、最佳包被液為CB液、將BSA作為封閉液封閉1 h，緩沖液PBS最佳離子濃度為0.01 mol·L-1，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間37 ℃溫育30 min，二抗反應(yīng)時(shí)間30 min，在此條件下初步建立基于免疫磁珠清除的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。

2.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)上述優(yōu)化試驗(yàn)選出的最佳icELISA條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。IC50值為0.732 81，方法的線性范圍為0.56～3.21 ng·mL-1。

圖2 沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

向空白樣品中加入一定量的沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品制備梯度濃度的待檢樣品，與圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，分析基質(zhì)效應(yīng)大小。結(jié)果如圖3，基質(zhì)加標(biāo)IC50為0.822 6～0.930 7 ng·mL-1，線性范圍為0.53～3.78 ng·mL-1，可以看出二者基本一致，免疫磁珠凈化效果較好，基質(zhì)對(duì)icELISA的影響可以忽略。

圖3 雞肉、雞肝、魚肉基質(zhì)中沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

每個(gè)水平做3個(gè)平行。將各樣品測(cè)得的OD450 nm值，代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出添加回收率[33-34]，結(jié)果見表2。氟喹諾酮類藥物在雞肉、雞肝、魚肉的檢測(cè)限均不超過1.33、2.17、2.31 μg·kg-1，添加回收率均在76.83%～98.70%，且日間日內(nèi)變異系數(shù)均不超過15%。符合對(duì)殘留檢測(cè)方法準(zhǔn)確度 (60%～120%)和精密度的要求(<20%)。

表2 沙拉沙星、環(huán)丙沙星等11種氟喹諾酮類藥物在空白樣品添加回收結(jié)果

(續(xù)表2 Continued)

(續(xù)表2 Continued)

2.8 與儀器方法進(jìn)行比較

根據(jù)本研究建立的免疫磁珠凈化icELISA方法檢測(cè)雞肉中氟喹諾酮類藥物，與HPLC方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果相關(guān)性分析如圖4所示，按照國(guó)標(biāo)方法GB 31650—2019規(guī)定的HPLC方法得到雞肉中檢測(cè)限為1.7 μg·kg-1，本文“2.7”部分測(cè)定本方法的雞肉檢測(cè)限為1.33 μg·kg-1，該方法與儀器分析結(jié)果高度一致(相關(guān)系數(shù)R2=0.993)，說明經(jīng)免疫磁珠進(jìn)行前處理的icELISA方法結(jié)果可靠，可以用于氟喹諾酮類藥物在實(shí)際樣品中的殘留檢測(cè)。

圖4 本方法與儀器方法的相關(guān)性分析

3 討 論

氟喹諾酮類藥物具有致癌性和致突變性，危及消費(fèi)者健康及生命安全，目前食品中氟喹諾酮類藥物檢測(cè)方法主要是儀器方法，但該方法價(jià)格昂貴，前處理過程復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。為了提高效率，降低檢測(cè)成本，本研究開發(fā)了一種免疫磁珠凈化的前處理過程，結(jié)合ELISA實(shí)現(xiàn)了氟喹諾酮類藥物的快速檢測(cè)。

免疫磁珠凈化方法將固化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合于一體，在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化和分子生物學(xué)等方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用。該分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的快速富集與分離，提高了免疫測(cè)定的靈敏度[35-36]，縮短了檢測(cè)時(shí)間[37]。免疫磁珠的合成是建立磁珠凈化方法的核心，高質(zhì)量的抗體對(duì)于免疫富集的特異性與準(zhǔn)確性具有重要意義[38]，抗體添加量及偶聯(lián)時(shí)間直接影響偶聯(lián)率從而影響檢測(cè)方法的靈敏度。

本研究制備的免疫磁珠中沙拉沙星抗體偶聯(lián)量約為15 mg·g-1。φ值為89.9%，說明該免疫磁珠的穩(wěn)定性良好，本研究中通過90%甲醇溶液洗脫免疫磁珠上的抗原，在保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠的前提下，該免疫磁珠可重復(fù)使用3 次。結(jié)果顯示，本研究建立的氟喹諾酮類藥物免疫檢測(cè)方法，在雞肉、雞肝、魚肉的檢測(cè)限分別為1.33、2.17、2.31 μg·kg-1，本研究較好地簡(jiǎn)化前處理步驟，省去萃取步驟，與儀器方法相比，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間；與生物學(xué)方法相比[39]，克服了試劑及環(huán)境的污染；與全基因測(cè)序相比，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求不高。但不足之處在于，該檢測(cè)方法對(duì)于抗體特異性要求較高，因此在抗體方面還有待進(jìn)一步研究，總之，本研究建立了一種快速簡(jiǎn)便，靈敏度高、選擇性好的雞肉、雞肝和魚肉中氟喹諾酮類藥物的檢測(cè)方法。

4 結(jié) 論

本研究建立的磁珠凈化與檢測(cè)一體化icELISA法檢測(cè)氟喹諾酮類藥物操作簡(jiǎn)便，僅用一個(gè)磁力架就能完成前處理，經(jīng)過免疫磁珠對(duì)樣本中待測(cè)物質(zhì)的特異性捕獲，濃縮富集，既提高了靈敏度，又有效地降低了基質(zhì)的影響，降低假陽性率，大大提高了檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。因此進(jìn)一步探究免疫磁珠凈化在實(shí)際殘留檢測(cè)中的應(yīng)用具有重要意義。同時(shí)證實(shí)了磁珠富集與icELISA聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用效果，檢測(cè)結(jié)果與HPLC法結(jié)果一致，通過偶聯(lián)不同的單克隆抗體，以期可建立更多的藥物殘留量檢測(cè)方法，為保障動(dòng)物性食品安全提供新思路。