楊艷北，許 晶，劉婉萍，陶艾妮，馮育林，孫 勇，王 闖，劉 建

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站/正邦集團(tuán)有限公司博士后工作站，南昌 330000；2.南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330000；3.南昌師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330000； 4.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，南昌 330000)

阿奇霉素屬于人用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為畜禽禁用獸藥。目前，阿奇霉素違規(guī)用于畜禽養(yǎng)殖，雖然國(guó)家明令禁止，但是養(yǎng)殖戶仍將阿奇霉素等人用抗生素添加于飼料中或通過其他途徑使用，導(dǎo)致人用抗生素被濫用于畜禽，已成為威脅畜禽產(chǎn)品安全的新隱患[1]。阿奇霉素的濫用，致使養(yǎng)豬環(huán)境中出現(xiàn)大量殘留，導(dǎo)致豬鏈球菌2型與低濃度阿奇霉素有機(jī)會(huì)長(zhǎng)期共存，豬鏈球菌2型改變自身狀態(tài)以應(yīng)對(duì)阿奇霉素的選擇壓力[2]。環(huán)境中殘留的低濃度抗生素會(huì)改變細(xì)菌的棲息環(huán)境，對(duì)細(xì)菌的生存構(gòu)成嚴(yán)重威脅，極易產(chǎn)生耐藥菌株[3-4]。

莢膜多糖是豬鏈球菌2型的主要毒力因子，位于細(xì)胞表面，能讓豬鏈球菌2型逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)致病性感染，具有抗吞噬、黏附和定植等多種生理功能。莢膜多糖在豬鏈球菌2型生長(zhǎng)、繁殖和應(yīng)對(duì)不良環(huán)境過程中起著關(guān)鍵作用，受cps基因調(diào)控。豬鏈球菌2型cps基因由cpsA～cpsV共22個(gè)基因組成，主要發(fā)揮糖鏈長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)、糖基的聚合、多糖的運(yùn)輸和特化修飾等重要生物學(xué)功能[5-6]。

細(xì)菌對(duì)抗生素的外排作用是細(xì)菌多重耐藥的重要機(jī)制。細(xì)菌外排泵是存在于細(xì)胞膜上的，具有外排功能的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，使菌體內(nèi)藥物濃度降低而導(dǎo)致耐藥，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于細(xì)菌多重耐藥的主動(dòng)外排泵[7-9]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過ATP結(jié)合和水解推動(dòng)藥物自由排出。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用的底物種類較多，除抗生素外，還包括氨基酸、糖類、離子和多糖類化合物等[10-13]。

本研究用低濃度阿奇霉素處理豬鏈球菌2型，利用蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)，篩選關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白，測(cè)定豬鏈球菌2型的莢膜多糖含量和藥物敏感性，為進(jìn)一步研究環(huán)境中低濃度抗生素對(duì)微生物的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鏈球菌2型ATCC700794購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。Todd-Hewitt肉湯(THB)培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物科技有限公司。阿奇霉素(ABT070-5 g)購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 阿奇霉素對(duì)豬鏈球菌2型最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

MIC的測(cè)定，以大腸埃希菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質(zhì)控菌，嚴(yán)格按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行，待豬鏈球菌2型增至108cfu·mL-1后，稀釋為105～106cfu·mL-1，接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照 CLSI-VET01S[14]。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)篩選關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白

試驗(yàn)分組：豬鏈球菌2型在含有1/4 MIC阿奇霉素的THB中，37 ℃培養(yǎng)72 h后，8 000 r·min-1離心10 min，用離心管收集菌體，用生理鹽水沖洗3次，于-80 ℃冰箱中備用，作為處理組。以無阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型作為對(duì)照組。iTRAQ 試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，方法如下。

將上述樣品裂解，超聲破碎，取上清，Bicinchoninic Acid Assay法測(cè)定蛋白濃度。樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。樣品酶解后，OD280 nm肽段定量。樣品按照 AB 公司試劑盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit (AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記。將試驗(yàn)標(biāo)記后的肽段混合，進(jìn)行SCX預(yù)分級(jí)。樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后，用Q-Exactive質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。在蛋白質(zhì)定量過程中，要求每個(gè)蛋白至少包含2個(gè)唯一肽段。當(dāng)差異倍數(shù)>1.1且P<0.05時(shí)，認(rèn)為該蛋白差異顯著。利用Proteome Discoverer軟件對(duì)鑒定的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分類注釋，包括分子功能、細(xì)胞組分和生物過程。

1.4 莢膜多糖含量測(cè)定

試驗(yàn)分組：豬鏈球菌2型在含有1/4 MIC阿奇霉素的 5 L THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h后，離心收集菌體，作為處理組。在相同環(huán)境下培養(yǎng)5 L豬鏈球菌2型，并離心收集菌體，作為對(duì)照組(無阿奇霉素)。莢膜多糖提取及測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行，方法如下，略有改動(dòng)。

莢膜多糖提取：離心獲得的菌體，分別在生理鹽水中沖洗、離心，懸浮于含有溶菌酶的100 mL甘氨酸緩沖液(甘氨酸0.1 mol·L-1，溶菌酶1 mg·mL-1，pH 9.2)，37 ℃作用6 h，離心取上清。取50 mL上清，加入終濃度為100 μg·mL-1蛋白酶K，55 ℃作用2 h，然后加入脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，37 ℃作用1 h，然后加入蛋白酶K，并在上清中加入終濃度為0.1 mol·L-1的CaCl2，攪拌1 h，再加入終濃度為25%的無水乙醇，4 ℃放置2 h，離心除去上清液中沉淀出來的核酸，之后加入終濃度為80%無水乙醇，4 ℃放置過夜沉淀，得到處理組和對(duì)照組莢膜多糖。

采用硫酸-苯酚法測(cè)定莢膜多糖含量：取處理組和對(duì)照組莢膜多糖，分別配成5.0 mg·mL-1溶液。取2 mL上述溶液，依次加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL濃硫酸，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min。測(cè)定上述溶液中OD490 nm吸光度，用于反映處理組和對(duì)照組莢膜多糖含量。

1.5 藥物敏感性

以1/4 MIC 阿奇霉素作為誘導(dǎo)藥物，人工誘導(dǎo)豬鏈球菌2型。將100 μL豬鏈球菌2型，在含有1/4 MIC阿奇霉素的10 mL THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，將其作為下一代誘導(dǎo)的母菌，一共盲傳誘導(dǎo)15代(誘導(dǎo)菌株)。將誘導(dǎo)菌株在不含阿奇霉素的液體培養(yǎng)基中盲傳10代，即為第25代菌株(恢復(fù)菌株)。依次取第5、10、15和25代的菌株，測(cè)定其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)、氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、鏈霉素、安普霉素、慶大霉素)、喹諾酮類抗生素(諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星)的MIC。無阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型作為對(duì)照組。MIC的測(cè)定參照“本研究方法1.2”進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 阿奇霉素對(duì)豬鏈球菌2型MIC的測(cè)定

阿奇霉素對(duì)豬鏈球菌2型ATCC 700794的MIC 是0.007 812 5 mg·L-1，根據(jù)美國(guó) CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)，阿奇霉素的敏感折點(diǎn)為 0.5 mg·L-1，因此豬鏈球菌2型 ATCC 700794 對(duì)阿奇霉素敏感(非耐藥菌株)。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)篩選關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白

2.2.1 蛋白樣品定量結(jié)果 樣品經(jīng)裂解后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。處理組蛋白質(zhì)濃度為2.94 μg·μL-1，對(duì)照組蛋白質(zhì)濃度為2.31 μg·μL-1。樣品濃度符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2.2 SDS-PAGE電泳 蛋白樣品經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離后，如圖1所示，樣品條帶分離清晰，較為均一，蛋白質(zhì)樣品符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.處理組；2.對(duì)照組

2.2.3 酶解肽段濃度測(cè)定 酶解后肽段以O(shè)D280 nm吸收值評(píng)估其相對(duì)濃度，以相關(guān)系數(shù)OD280 nm=1.1 為 1 μg·μL-1，將吸光度值換算為蛋白質(zhì)濃度。處理組酶解肽段濃度為2.15 μg·μL-1，對(duì)照組酶解肽段濃度為1.98 μg·μL-1。

2.2.4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 SCX分級(jí)并脫鹽后的10個(gè)樣品經(jīng)質(zhì)譜分析及Mascot查庫(kù)，結(jié)果合并后，以Peptide FDR≤0.01篩選過濾。結(jié)果顯示，唯一肽段為15 919個(gè)，蛋白質(zhì)組為1 565個(gè)。

2.2.5 定量分析結(jié)果 本研究分為兩組，一組為處理組(1/4 MIC阿奇霉素)，二組為對(duì)照組(無阿奇霉素)。定量時(shí)分別以每組的對(duì)照組為內(nèi)參，各組蛋白質(zhì)的比值均采取各通道標(biāo)簽與內(nèi)參的比值。本研究中共鑒定到的蛋白質(zhì)組為1 565個(gè)，其中，各通道標(biāo)記標(biāo)簽皆有定量信息的蛋白質(zhì)有1 501個(gè)。

2.2.6 生物信息學(xué)分析 本研究中共鑒定到1 501個(gè)蛋白質(zhì)，按照差異倍數(shù)>1.1且P<0.05進(jìn)行篩選，共得到差異表達(dá)蛋白174個(gè)，差異表達(dá)蛋白占總鑒定蛋白的11.6%。大多數(shù)鑒定出的差異表達(dá)蛋白具有催化活性，參與代謝過程，屬于膜蛋白(圖2)。低濃度阿奇霉素將全面影響豬鏈球菌2型催化活性和代謝過程。膜蛋白對(duì)于豬鏈球菌2型適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用。總之，豬鏈球菌2型通過改變自身蛋白質(zhì)組的表達(dá)量，以適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力。

圖2 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型差異表達(dá)蛋白GO分析

2.2.7 關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白的iTRAQ鑒定 利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)，本研究分析處理組(1/4 MIC阿奇霉素)和對(duì)照組(無阿奇霉素)的關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白，如表1所示。3個(gè)莢膜多糖蛋白(M1VJJ3、G8DTL7、M1VE09)上調(diào)表達(dá)。8個(gè)莢膜多糖蛋白(K0FG35、M1VRI8、M1VK55、M1VE47、E9 NQ13、M1VRH4、M1VRG0、E9 NQ29)下調(diào)表達(dá)。9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(R4 NLJ6、A4VW83、G5L0Q7、A4 W271、G7S3 W1、G7SAB5、A4VTM2、G7S5E3、G7SD52)上調(diào)表達(dá)。1個(gè)50S核糖體蛋白(A4 W1B7)上調(diào)表達(dá)。4個(gè)50S核糖體蛋白(G5L0U4、A4VYQ7、G7S1 W2、A4VSF4)下調(diào)表達(dá)。4個(gè)30S核糖體蛋白(A4 W3Q2、A4VYR6、A4 W3 W8、R4 NLK5)下調(diào)表達(dá)。1個(gè)核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶(G7SM56)上調(diào)表達(dá)。1個(gè)核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶(A4 W3H4)下調(diào)表達(dá)。1個(gè)DNA回旋酶(R4 NVK5)上調(diào)表達(dá)。1個(gè)DNA聚合酶IV(G5KZN4)下調(diào)表達(dá)。

表1 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白

2.3 莢膜多糖含量測(cè)定

采用硫酸-苯酚法測(cè)定處理組(1/4 MIC 阿奇霉素)和對(duì)照組(無阿奇霉素)莢膜多糖含量，以O(shè)D490 nm吸光度反映莢膜多糖含量。結(jié)果顯示，1/4 MIC 阿奇霉素處理的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量與對(duì)照組相比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，莢膜多糖含量未發(fā)生大幅度變化(圖3)。

圖3 低濃度阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量測(cè)定

2.4 藥物敏感性

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定誘導(dǎo)菌株(第 5、10、15 代)以及恢復(fù)菌株(第25代)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類抗生素的 MIC。根據(jù)美國(guó) CLSI 判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，豬鏈球菌2型ATCC 700794對(duì)紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素、氧氟沙星敏感，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、鏈霉素、安普霉素、慶大霉素耐藥。誘導(dǎo)菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)、部分氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、鏈霉素)、部分喹諾酮類抗生素(諾氟沙星)的藥物敏感性與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。誘導(dǎo)菌株對(duì)部分抗生素的敏感性降低。誘導(dǎo)菌株恢復(fù)正常培養(yǎng)后，誘導(dǎo)菌株的藥物敏感性與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。誘導(dǎo)菌株對(duì)抗生素的敏感性迅速恢復(fù)到原始菌株?duì)顟B(tài)(圖4)。

圖4 豬鏈球菌2型對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(A)、氨基糖苷類(B)、喹諾酮類(C)抗生素的藥物敏感性

3 討 論

豬鏈球菌2型為應(yīng)對(duì)阿奇霉素的選擇壓力，3個(gè)莢膜多糖蛋白(基因名：cps6J、cps1/2H、cps30N)上調(diào)表達(dá)，8個(gè)莢膜多糖蛋白(基因名：cpsR、cps28Q、cps28H、cps33F、cps16F、cps26L、cps22M、cps16U)下調(diào)表達(dá)，阿奇霉素處理后的豬鏈球菌2型莢膜多糖含量未發(fā)生大幅度變化。cpsF基因編碼鼠李糖轉(zhuǎn)移酶，功能是催化和添加鼠李糖。cpsH基因編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，參與半乳糖的合成。cpsJ基因編碼N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，該酶參與合成N-乙酰葡萄糖胺寡聚物。cpsK基因編碼β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶將半乳糖苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移到葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖上。cpsN基因編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶，參與唾液酸寡糖合成。cpsQ基因編碼尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺-2-異構(gòu)酶，該酶是唾液酸合成的起始限速酶。cpsR基因編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶將唾液酸生成O-乙?；膯瘟姿岚?N-乙酰神經(jīng)氨酸。cpsL基因、cpsM基因、cpsU基因編碼產(chǎn)物尚不清楚，功能也尚不清楚[17-24]。豬鏈球菌2型為適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力，影響莢膜多糖蛋白的表達(dá)，從而提高其在環(huán)境中的生存能力。

豬鏈球菌2型為應(yīng)對(duì)阿奇霉素的選擇壓力，9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)表達(dá)，推測(cè)這些ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白涉及到細(xì)菌多重耐藥的主動(dòng)外排功能。9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致豬鏈球菌2型對(duì)多種抗生素的敏感性下降，其中，ABC型多藥轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP酶(A4VW83)已被證實(shí)是細(xì)菌多重耐藥的主動(dòng)外排泵，屬于細(xì)菌的一種防御機(jī)制[25]。ABC超家族ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(G7SD52)上調(diào)表達(dá)約5.6倍，上調(diào)表達(dá)量最為顯著，推測(cè)該蛋白對(duì)于豬鏈球菌2型外排阿奇霉素起著關(guān)鍵作用。豬鏈球菌2型為適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力，大量表達(dá)多重耐藥的主動(dòng)外排泵(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于豬鏈球菌2型適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用。用低濃度阿奇霉素處理豬鏈球菌2型，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種抗生素的敏感性下降，存活下來的菌株，恢復(fù)正常培養(yǎng)后，藥物敏感性恢復(fù)。與低濃度阿奇霉素共存時(shí)，豬鏈球菌2型的生理適應(yīng)性，例如開啟外排泵系統(tǒng)，足以應(yīng)對(duì)阿奇霉素的選擇壓力，消除阿奇霉素后，容易恢復(fù)藥物敏感性。外排作用雖然只是賦予了細(xì)菌低水平的耐藥，但為染色體突變導(dǎo)致的高水平耐藥提供了寶貴的時(shí)間。

豬鏈球菌2型為應(yīng)對(duì)阿奇霉素的選擇壓力，1個(gè)50S核糖體蛋白(A4 W1B7)上調(diào)表達(dá)，4個(gè)50S核糖體蛋白(G5L0U4、A4VYQ7、G7S1 W2、A4VSF4)下調(diào)表達(dá)，4個(gè)30S核糖體蛋白(A4 W3Q2、A4VYR6、A4 W3 W8、R4 NLK5)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶(G7SM56)上調(diào)表達(dá)，1個(gè)核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶(A4 W3H4)下調(diào)表達(dá)。豬鏈球菌2型為適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力，改變核糖體蛋白表達(dá)量，從而提高其在環(huán)境中的生存能力。

4 結(jié) 論

蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)顯示，低濃度阿奇霉素將全面影響豬鏈球菌2型催化活性和代謝過程。膜蛋白，例如藥物外排泵蛋白，對(duì)于豬鏈球菌2型適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力具有重要作用?？傊?，豬鏈球菌2型通過改變自身蛋白質(zhì)組的表達(dá)量，以適應(yīng)阿奇霉素的選擇壓力。與低濃度阿奇霉素共存時(shí)，豬鏈球菌2型開啟外排泵系統(tǒng)，會(huì)增加細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。