郭紫晶，陳 飛，張志雄，柏 玲，張志東，李彥敏

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室OIE/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，主要感染豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物[1]。FMD被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的傳染病，我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物疫病，對(duì)動(dòng)物貿(mào)易和國(guó)家經(jīng)濟(jì)構(gòu)成持續(xù)的威脅。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有7個(gè)血清型(O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型)，不同的血清型之間互不交叉保護(hù)[2]。由于FMDV易感動(dòng)物種類繁多、病原變異大、免疫逃逸和免疫抑制等因素，因此很難控制和根除[3]。

FMDV在與宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的過(guò)程中，已經(jīng)進(jìn)化出逃避宿主免疫應(yīng)答的多種機(jī)制[4-8]。T細(xì)胞在機(jī)體抵御病毒入侵、免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其增殖能力和效應(yīng)功能的降低均能引起宿主免疫抑制[9-11]。有研究表明，豬感染FMDV后1 d(1 dpi)，其外周血T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)刺激的增殖顯著下降，并且這種免疫抑制狀態(tài)持續(xù)到10 dpi，為FMDV感染早期在體內(nèi)的快速?gòu)?fù)制和傳播提供了絕佳的機(jī)會(huì)和環(huán)境[12-13]。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，其幾乎可以由所有免疫細(xì)胞產(chǎn)生[14]。IL-10增高是FMDV感染豬、牛和小鼠等易感動(dòng)物后常見的特征之一，其與FMDV引起的免疫抑制密切相關(guān)[15-17]。研究表明，從FMDV感染豬的外周血中分離樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)，將其與未感染豬的T細(xì)胞進(jìn)行體外混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，DCs可以產(chǎn)生大量的IL-10，體外抗體阻斷IL-10可以恢復(fù)T細(xì)胞的增殖，提示IL-10在該過(guò)程中具有重要的作用[15]。然而，增高的IL-10在體內(nèi)是否影響外周血T細(xì)胞的增殖尚不清楚。IFN-γ、TNF-α和 IL-2作為免疫應(yīng)答重要的細(xì)胞因子，其有助于清除進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒。研究表明，T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、TNF-α和 IL-2的水平在一定程度上反映T細(xì)胞的效應(yīng)功能[18-20]。目前，F(xiàn)MDV對(duì)外周血T細(xì)胞效應(yīng)功能的影響未見報(bào)道，并且IL-10是否影響FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞的效應(yīng)功能也不清楚。作者實(shí)驗(yàn)室最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV能引起小鼠血清中IL-10顯著增高，其通過(guò)調(diào)控淋巴細(xì)胞減少癥進(jìn)而造成免疫抑制[17]。因此，本研究的目的是探究IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞增殖及其表達(dá)IFN-γ、TNF-α和 IL-2的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57/BL6小鼠(4～5周齡)購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。IL-10敲除(IL-10-/-)的C57/BL6小鼠購(gòu)買于賽業(yè)生物科技有限公司(廣州，中國(guó))。

1.1.2 病毒 FMDV O血清型(O/BY/CHA/2010)毒株，來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 主要試劑及儀器 小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒(天津?yàn)?，KITLTS1092)；PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa，RR036A)；Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(TaKaRa，RR390A)；TRIzoL(InvitrogenTM，10296028)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(日本同仁，CK04)；刀豆蛋白(ConA)(Sigma，11028-71-0)；Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A)(Biolegend, 423303)；eBioscienceTMFoxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液套件(InvitrogenTM，00-5523-00)；APC anti-mouse TNF-α (BD，MCA500APC)；TNF-α isotype control(Biolegend，400411)；APC anti-mouse IFN-γ (Biolegend，100307)；IFN-γ isotype control(Biolegend，400411)；PE/Cy7 anti-mouse IL-2 (Biolegend，505810)；IL-2 isotype control(Biolegend，400617)；Percp anti-mouse CD8 (Biolegend，100732)；FITC anti-mouse CD4 (BD，MCA4635F)；TruStain FcXTMPLUS anti-mouse CD16/32(Biolegend，156604)。CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter Inc., 上海, 中國(guó))；qPCR 儀(Agilent Technologies, Stratagene M×3005P)，超微量分光光度計(jì)(GE，NanoVue Plus)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，Varioskan LUX)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar，IC1000)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠攻毒與對(duì)照試驗(yàn) 小鼠頸背部皮下感染FMDV(0.05 mL)，每只小鼠5×105.5TCID50，這是導(dǎo)致4～6周齡C57BL/6小鼠死亡的最低感染劑量[17]。皮下注射0.05 mL的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)，作為對(duì)照組。所有FMDV感染性試驗(yàn)均在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物生物安全防護(hù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL-3)進(jìn)行。動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格按照《中華人民共和國(guó)動(dòng)物倫理程序和指南》的規(guī)定進(jìn)行，并經(jīng)過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展本研究中的相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2.2 樣本收集 隨機(jī)分配5只和15只小鼠作為對(duì)照組和感染組，感染后每隔12 h觀察并記錄小鼠的臨床癥狀和存活率。根據(jù)FMDV感染小鼠的存活曲線，隨機(jī)分配9和72只小鼠分別作為對(duì)照組和感染組(n=9)，在不同時(shí)間點(diǎn)[12、24、36、48和60 hpi(hours post infection)](采集對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠的全血，分離血清，檢測(cè)血清中病毒RNA載量。隨機(jī)分配9和60只小鼠分別作為對(duì)照組和感染組(n=9)，在不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36和48 hpi)采集對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠的外周血，用于檢測(cè)外周血T細(xì)胞的增殖。隨機(jī)分配9和24只小鼠分別作為對(duì)照組和感染組(n=9)，在48 hpi，采集每組小鼠的外周血，用于檢測(cè)外周血T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子。隨機(jī)分配9、24和24只小鼠分別作為對(duì)照組、FMDV感染同型對(duì)照組和FMDV感染抗IL-10受體(IL-10R)組(n=9)。同樣的，隨機(jī)分配9、24和24只小鼠分別作為對(duì)照組和FMDV感染野生型組和FMDV感染IL-10-/-組(n=9)。在48 hpi，采集每組小鼠的外周血，用于檢測(cè)外周血T細(xì)胞增殖及其表達(dá)的細(xì)胞因子。

1.2.3 體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào) 根據(jù)先前的研究報(bào)道[17]，在FMDV感染的第-1天和第0天，小鼠腹腔注射200 μginvivoanti-mouse IL-10R(clone 1B1.3A)用于體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；同樣地，注射相同劑量的invivorat IgG1 isotype control(clone HRPN)用于小鼠的同型對(duì)照。

1.2.4 RNA提取及cDNA的合成 取100 μL血清加入700 μL TRIzol，渦旋后室溫靜置5 min。加入200 μL 氯仿，渦旋混勻后冰上靜置5 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清，加入等體積的異丙醇，冰上靜置10 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；棄掉上清，加入1 mL 70%的DEPC無(wú)水乙醇。4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，自然晾干，定量RNA 濃度。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒的說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)FMDV 檢測(cè)FMDV的方法采用先前的報(bào)道，該方法的靶基因是FMDV 3D基因[21]。引物序列如下：3D sense Primer:5′-ACTGGGTTTTAYAAACCTGTGATG-3′，3D anti-sense Primer: 5′-TCAACTTCTCCTGKAT GGTCCCA-3′，Probe: 5′-ATCCTCTCCTTTGCACGC-3。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，Probe引物1 μL模板 2 μL，用 Rnase free H2O補(bǔ)齊到 25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30，共 40 個(gè)循環(huán)。

1.2.6 CCK-8檢測(cè)T細(xì)胞的增殖 根據(jù)小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒的說(shuō)明書，分別從對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠(12、24、36和48 hpi)的外周血中分離小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。用含有10% FBS、1%雙抗(青霉素和鏈霉素)和5 μg·mL-1ConA(用于刺激T細(xì)胞增殖)的RPMI-1640培養(yǎng)基分別重懸對(duì)照小鼠的PBMC和FMDV感染小鼠的PBMC，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀將PBMC的濃度均調(diào)整為1×105cells·mL-1。向平底96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板中接種100 μL的細(xì)胞懸液，每孔約為1×104個(gè)細(xì)胞。37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，孵育結(jié)束前4 h每孔加入10 μL CCK-8試劑(含有水溶性四唑鹽——WST-8，線粒體中的脫氫酶可以還原WST-8為黃色甲臜，甲臜的量與活細(xì)胞數(shù)量呈相關(guān)性)，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的OD值(A)。根據(jù)CCK-8檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，計(jì)算細(xì)胞的增殖率(%)。即，增殖率=(AConA-A空白)/(A對(duì)照-A空白)。AConA表示具有細(xì)胞、CCK-8溶液和ConA的孔的OD值；A空白表示具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的OD值；A對(duì)照表示具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有ConA的孔的OD值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、TNF-α和 IL-2 分別從對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠(48 hpi)的外周血中分離小鼠的PBMC。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞懸液，900 μL·孔-1，每孔約含有1×106個(gè)細(xì)胞；將含有Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)的100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，使刺激體系為1 mL。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱刺激6 h，刺激結(jié)束后收集細(xì)胞并以350g離心5 min，棄上清液。PBS洗3次后，用100 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入2 μL anti-mouse CD16/32冰上靜置10 min以封閉FC受體；之后加入FITC anti-mouse CD4 和 Percp anti-mouse CD8抗體進(jìn)行細(xì)胞表面分子的標(biāo)記，冰上避光孵育20 min，PBS洗3次。

將Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子緩沖液套件中的10×破膜液配制成使用濃度。在最后一次洗滌后，保留約100 μL殘余體積，并輕輕的重懸細(xì)胞。加入200 μL IC固定液室溫下避光孵育40 min。350g離心5 min，棄上清。加入200 μL破膜液，350g離心5 min，棄上清。用100 μL 1×破膜液重懸細(xì)胞，加入2 μL anti-mouse CD16/32抗體避光冰上靜置10 min以封閉FC受體。之后，分別加入2 μL的APC anti-mouse IFN-γ、APC anti-mouse TNF-α和PE/Cy7 anti-mouse IL-2抗體4 ℃避光孵育20 min。設(shè)置空白管、單染管和同型對(duì)照管(FMO)。PBS洗3次后，過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 FMDV感染小鼠的生存曲線與血清中病毒RNA載量的測(cè)定

FMDV感染4～5周齡的C57BL/6小鼠最初表現(xiàn)嗜睡、精神沉郁和厭食，這些癥狀在本研究中被判定為輕微的臨床癥狀。隨后小鼠出現(xiàn)呼吸窘迫、毛發(fā)皺褶和駝峰姿勢(shì)，這些癥狀被判定為嚴(yán)重的臨床癥狀。FMDV感染小鼠在36 hpi開始出現(xiàn)死亡，急性感染導(dǎo)致小鼠在72 hpi內(nèi)全部死亡(圖1A)。觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV感染小鼠在表現(xiàn)出呼吸窘迫等嚴(yán)重臨床癥狀后的4～6 h內(nèi)死亡。FMDV感染小鼠在36、48、60和72 hpi的存活率分別為86.67%(13/15)、53.30%(8/15)、13.33%(2/15)和0(0/15)(圖1A)。以上結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)MDV能致死C57BL/6小鼠。接下來(lái)，通過(guò)RT-qPCR分別測(cè)定FMDV感染小鼠在12、24、36、48和60 hpi血清中病毒RNA水平。結(jié)果顯示，最早在36 hpi能在FMDV感染小鼠的血清中檢測(cè)到病毒RNA序列，其血清病毒RNA載量約為(2.41±1.30)×107copies·100 μL-1；在60 hpi，血清中病毒RNA載量最高約為4.31×108copies·100 μL-1，且該小鼠表現(xiàn)出呼吸窘迫等嚴(yán)重的臨床癥狀(圖1B)。小鼠出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間與血清中檢測(cè)到FMDV RNA的時(shí)間一致，并且當(dāng)血清中的病毒RNA載量較高時(shí)，其相應(yīng)的臨床癥狀更為嚴(yán)重。因此，F(xiàn)MDV感染小鼠的疾病進(jìn)程與血清中病毒載量有關(guān)。

A. 對(duì)照小鼠(n=5)和FMDV感染小鼠(n=15)的生存曲線；B. 對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠在12、24、36、48和60 hpi的血清中FMDV RNA載量(n=9)

2.2 FMDV對(duì)小鼠外周血T細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果表明，與對(duì)照小鼠[細(xì)胞增殖率(2.99±0.17)%]相比，F(xiàn)MDV感染小鼠在12、24、36和48 hpi，外周血T細(xì)胞的增殖能力均顯著下降，細(xì)胞增殖率分別為(2.37±0.15)%(P<0.05)、(2.07±0.16)%(P<0.01)、(2.41±0.13)%(P<0.05)和(2.08±0.15)%(P<0.01)(圖2)。由此可見，F(xiàn)MDV能抑制小鼠外周血T細(xì)胞增殖。

圖2 CCK-8檢測(cè)對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞的增殖

2.3 FMDV對(duì)小鼠外周血CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠中CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的能力。結(jié)果顯示，與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α的水平顯著降低[對(duì)照組vs感染組：(33.06±2.11)%vs(21.43±2.02)%，P<0.01](圖3)。與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠的外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的水平有降低趨勢(shì)，但差異不顯著[對(duì)照組vs感染組：(36.16±2.82)%vs(32.72±3.85)%，P=0.482 3](圖3)。與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠的外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-2的水平顯著降低[對(duì)照組vs感染組：(16.78±1.25)%vs(9.70±1.36)%，P<0.01](圖3)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)MDV能抑制小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-2。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠(48 hpi)的外周血CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2

2.4 FMDV對(duì)小鼠外周血CD8+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的影響

同樣地，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平。結(jié)果表明，與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α的水平顯著降低[對(duì)照組vs感染組：(23.29±1.79)%vs(16.63±1.32)%，P<0.01](圖4)。與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠(48 hpi)外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ的水平也顯著降低[對(duì)照組vs感染組：(93.12±1.86)%vs(75.30±2.34)%，P<0.000 1](圖4)。與對(duì)照小鼠相比，F(xiàn)MDV感染小鼠(48 hpi)的外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)IL-2的水平顯著降低[對(duì)照組vs感染組：(22.57±1.38)%vs(12.13±0.92)%，P<0.000 1](圖4)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)MDV感染抑制小鼠的外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照小鼠和FMDV感染小鼠(48 hpi)的外周血CD8+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2

2.5 IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞增殖的影響

接下來(lái)，采用invivoanti-mouse IL-10R抗體和IL-10-/-小鼠，進(jìn)一步探究IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，與FMDV感染同型對(duì)照組的小鼠相比[增殖率：(1.95 ± 0.19)%]，F(xiàn)MDV感染抗IL-10R抗體處理小鼠的T細(xì)胞增殖顯著增高[增殖率：(2.48 ± 0.15)%,P<0.05](圖5A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與FMDV感染野生型的小鼠相比[增殖率：(1.94 ± 0.18)%]，F(xiàn)MDV感染IL-10-/-小鼠的T細(xì)胞增殖也顯著增高[增殖率：(2.88 ± 0.21)%,P<0.01](圖5B)。以上的結(jié)果表明，體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或敲除IL-10有助于恢復(fù)FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞的增殖。

A. FMDV感染用In vivo rat IgG1 同型對(duì)照處理的小鼠和用In vivo anti-mouse IL-10R抗體處理的小鼠的外周血T細(xì)胞的增殖(48 hpi)；B. FMDV感染野生型小鼠和IL-10-/-小鼠的外周血T細(xì)胞的增殖(48 hpi)

2.6 IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的影響

為了探究IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的影響。首先分析體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)是否影響FMDV感染小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2。結(jié)果表明，與FMDV感染同型對(duì)照組的小鼠相比，F(xiàn)MDV感染抗IL-10R抗體處理小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平差異均不顯著[TNF-α，IsotypevsIL-10R：(19.90±1.86)%vs(22.36±1.86)%，P=0.359 6；IFN-γ，IsotypevsIL-10R：(29.46±2.38)%vs(29.93±2.13)%，P=0.882 8；IL-2，Isotype vs IL-10R：(9.467±1.313)%vs(10.61±1.23)%，P=0.532 5](圖6A、C、E)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與FMDV感染野生型小鼠相比，F(xiàn)MDV感染IL-10-/-小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平差異也均不顯著[TNF-α，Wild typevsIL-10-/-：(19.93±1.44)%vs(22.38±2.01)%，P=0.337 4；IFN-γ，Wild typevsIL-10-/-：(30.13±2.49)%vs(30.32±2.41)%，P=0.957 2；IL-2，Wild typevsIL-10-/-：(10.46±1.16)%vs(10.58±1.23)%，P=0.943 1](圖6B、D、F)。以上的結(jié)果表明，體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或敲除IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血CD4+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2無(wú)影響。

2.7 IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血CD8+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的影響

同樣地，首先分析體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)是否影響FMDV感染小鼠外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2。結(jié)果表明，與FMDV感染同型對(duì)照組的小鼠相比，F(xiàn)MDV感染抗IL-10R抗體處理小鼠的外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平差異均不顯著[TNF-α，IsotypevsIL-10R：(14.36±1.51)%vs(15.12±1.53)%，P=0.725 5；IFN-γ，IsotypevsIL-10R：(82.49±1.96)%vs(82.52±1.85)%，P=0.990 3；IL-2，IsotypevsIL-10R：(12.14±1.20)%vs(15.30±1.22)%，P=0.084 0](圖7A、C、E)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與FMDV感染野生型小鼠相比，F(xiàn)MDV感染IL-10-/-小鼠外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2的水平差異也不顯著[TNF-α，Wild typevsIL-10-/-：(16.24±1.67)%vs(16.6±1.29)%，P=0.868 2；IFN-γ，Wild typevsIL-10-/-：(81.36±2.27)%vs(82.51±2.10)%，P=0.714 1；IL-2，Wild typevsIL-10-/-：(11.36±1.27)%vs(12.69±1.19)%，P=0.453 0](圖7B、D、F)。以上的結(jié)果表明，體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或敲除IL-10對(duì)FMDV感染小鼠外周血CD8+T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2無(wú)影響。

A、C、E. FMDV感染用in vivo rat IgG1 同型對(duì)照處理的小鼠和用in vivo anti-mouse IL-10R抗體處理的小鼠的外周血CD8+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2(48 hpi)；B、D、F. FMDV感染野生型小鼠和IL-10-/-小鼠的外周血CD8+ T細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IFN-γ和IL-2(48 hpi)。

3 討 論

T細(xì)胞在機(jī)體抵御病毒入侵、免疫監(jiān)視和抗腫瘤免疫等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9-11]。其中，CD4+T細(xì)胞活化后主要分化為Th1和Th2，分別參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫；CD8+T細(xì)胞是主要通過(guò)直接殺傷或誘導(dǎo)病毒感染的靶細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞免疫作用[10-11]，CD4+和CD8+T的數(shù)量和功能的改變直接影響機(jī)體免疫的狀態(tài)[9-11]。作為重大動(dòng)物疫病FMD的病原，F(xiàn)MDV感染能抑制豬的外周血T細(xì)胞增殖，其被認(rèn)為是FMDV逃避宿主免疫應(yīng)答造成免疫抑制的重要方式之一[12-13]。本研究證明，F(xiàn)MDV感染小鼠的外周血T細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖顯著降低，表明FMDV感染損傷小鼠的外周血T細(xì)胞的增殖能力。此外，F(xiàn)MDV感染對(duì)淋巴結(jié)或者脾臟中淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)的影響有待于進(jìn)一步研究。有研究表明，F(xiàn)MDV感染豬會(huì)引起DCs表達(dá)的IL-10顯著增高，體外抗體阻斷IL-10能恢復(fù)T細(xì)胞增殖，提示IL-10在FMDV感染抑制T細(xì)胞增殖中具有重要的作用[15]。本研究結(jié)果證明，體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或者敲除IL-10小鼠有助于恢復(fù)FMDV感染抑制外周血T細(xì)胞的增殖。最近的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-6受體(IL-6R)可以通過(guò)恢復(fù)T細(xì)胞增殖等方式提高COVID-19患者外周血淋巴細(xì)胞的數(shù)量[22]。阻斷IL-6R被作為重癥COVID-19患者的治療策略之一，如托利單抗、沙利單抗和西妥昔單抗等藥物[23]。因此，阻斷IL-10R可能為FMD新型防控產(chǎn)品的研發(fā)提供新的思路。

研究表明，T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力在一定程度上反映T細(xì)胞的效應(yīng)功能，其在抗病毒細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[18-20]。IL-2通過(guò)與淋巴細(xì)胞表面IL-2R結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞增殖、分化及成熟，因而在機(jī)體細(xì)胞免疫中起到重要的調(diào)節(jié)作用[24]。IFN-γ在抗病毒感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和促進(jìn)T細(xì)胞分化等方面起著不可或缺的作用。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在與靶細(xì)胞表面死亡受體結(jié)合后可以激活Caspase家族，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，因而在抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[25]。本研究首次揭示，F(xiàn)MDV感染抑制小鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、TNF-α和 IL-2，其嚴(yán)重?fù)p害CD4+和CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能，造成宿主的免疫抑制。

T細(xì)胞激活需要兩種信號(hào)：第一信號(hào)由TCR識(shí)別APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物(p-MHC)所啟動(dòng)；第二信號(hào)由T細(xì)胞和APC間共信號(hào)分子的相互作用所啟動(dòng)[26]。共信號(hào)分子包括共刺激分子和共抑制分子，其在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、亞群分化、效應(yīng)功能和存活方面起著關(guān)鍵作用[27]。CD28與CD80/86 的相互作用屬于共刺激信號(hào)，是抗原刺激T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子必不可少的信號(hào)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可以通過(guò)抑制CD28刺激所誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖[28]。另外，PD-1通過(guò)AKT、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和磷脂酰肌醇磷脂酶C-γ(PLCγ)等信號(hào)通路抑制IFN-γ和IL-2的表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。作者實(shí)驗(yàn)室最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV感染能引起小鼠的外周血T細(xì)胞共抑制分子上調(diào)表達(dá)，包括CTLA-4、LAG-3、2B4和TIGIT，并且IL-10能調(diào)控這些共抑制分子的表達(dá)[17]。因此，IL-10是否通過(guò)共抑制分子調(diào)控T細(xì)胞增殖及其潛在的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或者敲除IL-10不影響FMDV感染小鼠的外周血T細(xì)胞的表達(dá)效應(yīng)分子，表明IL-10并不介導(dǎo)FMDV感染抑制外周血T細(xì)胞的表達(dá)IFN-γ、TNF-α和 IL-2，推測(cè)存在其他潛在的因子調(diào)控這些免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)。有必要進(jìn)一步研究FMDV感染抑制T細(xì)胞增殖和抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的分子機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究首次證明FMDV抑制小鼠外周血T細(xì)胞增殖及其表達(dá)效應(yīng)功能相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2，體內(nèi)阻斷IL-10/IL-10R信號(hào)或者敲除IL-10不影響CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、TNF-α和IL-2，但有助于恢復(fù)FMDV感染小鼠外周血T細(xì)胞的增殖。