陳俊貞，權(quán) 冉，付 強(qiáng)，葛麗娟，袁圓圓，張成遠(yuǎn)，李建林，史慧君

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)與豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、羊邊界病病毒(border disease virus，BDV)同屬于黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pesztivirus)[1]，是牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)的主要病原，易感動(dòng)物有牛、羊、駱駝等[2]。BVDV感染后會(huì)損傷機(jī)體的呼吸和生殖系統(tǒng)[3]，且病毒會(huì)攻擊免疫系統(tǒng)，使機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制[4]，隨后出現(xiàn)繼發(fā)感染，對(duì)組織、器官等造成嚴(yán)重?fù)p傷。近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，進(jìn)出口運(yùn)輸頻繁，促進(jìn)了BVDV的傳播，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重危害，并且對(duì)相關(guān)生物制品的安全性產(chǎn)生了不利影響。BVDV病毒的致病機(jī)制復(fù)雜，感染范圍較廣[5]，明確該病毒的感染機(jī)制可以為預(yù)防和治療BVD提供高效的方法和新的思路。

熱休克蛋白90 β家族成員1(heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1)是一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導(dǎo)的蛋白[6]，屬于熱休克蛋白90(heat shock protein 90 kDa，HSP90)家族，在蛋白折疊和質(zhì)量控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]，對(duì)Ca2+穩(wěn)態(tài)、ERS以及宿主防御有重要影響[7-8]。HSP90家族的分子伴侶活性對(duì)于病毒蛋白的組裝、成熟和維持都有重要作用，如在麻疹和尼帕病毒的L聚合酶折疊中的作用[9]，并且能夠參與到柯薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和鼻病毒等小核糖核酸病毒的衣殼加工和組裝[10]。有研究顯示，調(diào)控HSP90B1表達(dá)可以抑制黃病毒的復(fù)制，包括登革熱病毒和寨卡病毒[11]，能夠?qū)е氯嗣庖呷毕莶《?human immunodeficiency virus，HIV)感染細(xì)胞中CD4受體的表達(dá)顯著增加[12]，HSP90B1蛋白表達(dá)的差異可能是PEDV致病性差異的原因之一[13]，還有研究發(fā)現(xiàn)病毒糖蛋白E2能夠激活ERS反應(yīng)并誘導(dǎo)HSP90B1的轉(zhuǎn)錄，敲低HSP90B1能夠抵消E2的抗細(xì)胞凋亡作用[14]。課題組以往研究使用BVDV感染胎牛腎細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)細(xì)胞后進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，結(jié)果與空白組相比HSP90B1極顯著性差異表達(dá)，以此推測(cè)HSP90B1可能是影響B(tài)VDV復(fù)制的關(guān)鍵基因之一，使用BVDV感染MDBK細(xì)胞后，通過(guò)蛋白和mRNA水平檢測(cè)了HSP90B1的表達(dá)，再利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除MDBK細(xì)胞的HSP90B1基因，構(gòu)建HSP90B1 KO細(xì)胞，感染BVDV后，通過(guò)免疫熒光，qRT-PCR，病毒滴度以及CPE檢測(cè)病毒的復(fù)制情況，結(jié)果顯示BVDV感染MDBK細(xì)胞后，HSP90B1的蛋白水平和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著性上升，敲除MDBK細(xì)胞的HSP90B1基因能夠顯著性抑制BVDV的復(fù)制，為研究BVDV的致病機(jī)制以及BVD的綜合防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒及細(xì)胞

BVDV TC分離株由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室冉多良教授惠贈(zèng)[15]；pSPAX2、pMD2.G、lentiCRISPR v2、pLenti-GFP質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司；胎牛腎細(xì)胞和人胚腎293T細(xì)胞(Human embryo kidney 293T，HEK-293T)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

兔抗GRP94抗體(bs-0194R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、RIPA裂解液、BeyoECL Moon化學(xué)發(fā)光試劑盒和嘌呤霉素購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、固體瓊脂粉購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol購(gòu)自Ambion公司；高糖DMEM和胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自BI公司；Endofree PlasmidMiniprep Kit購(gòu)自BIOMIGA公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)和0.25%Trypsin-EDTA購(gòu)自GIBCO公司；T4 DNA Ligase和BsmBⅠ購(gòu)自New England Biolabs公司；聚乙烯亞胺(Poly ethylenimine，PEI)購(gòu)自Polysciences公司；GAPDH MAb、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和Cy3標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自Proteintech公司；J2 anti-dsRNA IgG2a單克隆抗體(MAb)購(gòu)自Scicons公司；聚凝胺購(gòu)自Sigma公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

將MDBK細(xì)胞按3×105個(gè)·孔-1的密度接種至6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度約70%時(shí)，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染細(xì)胞，分別于24、36和48 h時(shí)，加入TRIzol裂解液提取細(xì)胞和培養(yǎng)液的總核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)，測(cè)定濃度后將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以此為模板，按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)配制體系[16]，qRT-PCR檢測(cè)HSP90B1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 Western blot檢測(cè)HSP90B1蛋白表達(dá)水平

將1×106個(gè)MDBK細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，感染10 000 TCID50BVDV TC株，48 h后加入600 μL含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，測(cè)定濃度后變性60 μg總蛋白，利用Western blot檢測(cè)HSP90B1蛋白含量，一抗分別為GRP94抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，二抗為山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)。

1.5 構(gòu)建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質(zhì)粒

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中牛源HSP90B1的基因序列(登錄號(hào)：282646)，使用Benchling(www.benchling.com)和Chop-Chop(www.chopchop.cbu.uib.no)設(shè)計(jì)HSP90B1-sgRNA和Scramble序列(表1)，送至金唯智生物(蘇州)科技有限公司合成；將合成的HSP90B1-sgRNA和Scramble的Forward、Reverse各取10 μL(100 μmol·L-1)，37 ℃孵育30 min，95 ℃孵育5 min后梯度降溫至25 ℃(5 ℃·min-1)，合成雙鏈sgRNA。利用限制性?xún)?nèi)切酶BsmBⅠ酶切l(wèi)entiCRISPR v2質(zhì)粒，利用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，回收12 000 bp處的目的條帶，將合成的雙鏈sgRNA連接至回收的線性載體中構(gòu)建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質(zhì)粒；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，對(duì)轉(zhuǎn)化后的lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA菌液進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定。

表1 sgRNA序列

1.6 HSP90B1 KO/Scramble細(xì)胞構(gòu)建及檢測(cè)

6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用0.1%明膠包被30 min后，接種3×105個(gè)HEK-293T細(xì)胞，培養(yǎng)至匯合度約80%時(shí)，將3 μg pSPAX2、1.5 μg pMD2.G和3 μg lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA質(zhì)粒在1.5 mL離心管中混勻，加入37.5 μL PEI (1 mg·mL-1)，細(xì)胞棄原培養(yǎng)液，加入2.5 mL DMEM和上述混合液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h后更換含10% FBS的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集上清液得到慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA。同時(shí)轉(zhuǎn)染pLenti-GFP質(zhì)粒，包裝GFP慢病毒，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，估算慢病毒包裝效率。

向慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA加入聚凝胺(終濃度為8 μg·mL-1)后懸浮感染MDBK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立GFP對(duì)照組以觀察慢病毒感染效率；細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換含10% FBS的新鮮培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入終濃度為3 μg·mL-1的嘌呤霉素，連續(xù)篩選4代獲得HSP90B1 KO細(xì)胞和Scramble陽(yáng)性細(xì)胞。分別收集5×106個(gè)HSP90B1 KO和Scramble細(xì)胞，提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，檢測(cè)HSP90B1的敲除效率。

1.7 細(xì)胞生長(zhǎng)情況檢測(cè)

按3×105個(gè)細(xì)胞·孔-1的密度將HSP90B1 KO、Scramble和MDBK細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后24、48、72、96、120 h時(shí)用0.25% Trypsin-EDTA完全消化后收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入1 mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平

分別接種3×105個(gè)·孔-1HSP90B1 KO和Scramble細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h時(shí)收集細(xì)胞及培養(yǎng)液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平[17]。

1.9 免疫熒光檢測(cè)BVDV dsRNA含量

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪爬片并用1%明膠包被30 min，按1×105個(gè)·孔-1的密度將HSP90B1 KO和Scramble細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h后收集爬片；PBS清洗后，加入200 μL 4%多聚甲醛，室溫條件下固定15 min；清洗后加入200 μL含1%山羊血清的封閉液，室溫孵育1 h；清洗3次后加入J2 anti-dsRNA IgG2a單克隆抗體(1∶1 200)，4 ℃孵育過(guò)夜；清洗并加入Cy3標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(1∶200)，室溫下避光孵育1 h；PBS清洗，滴加5 μL抗熒光猝滅封片劑，將爬片置于封閉液上進(jìn)行封片；利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布情況及強(qiáng)度。

1.10 BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞后病毒滴度檢測(cè)

以3×105個(gè)·孔-1的密度將HSP90B1 KO細(xì)胞和對(duì)照組Scramble細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染細(xì)胞，于感染后12、24、36、48 h收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，置于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，液體轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，收集上清，采用Reed-Muench法測(cè)定各上清液中的病毒滴度。

1.11 BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞CPE情況

按3×105個(gè)·孔-1的密度接種HSP90B1 KO和Scramble細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度約70%時(shí)，接種10 000 TCID50的BVDV TC株感染細(xì)胞，于感染后12、24、36和48 h時(shí)，使用倒置顯微鏡(TE2000U)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effects，CPE)，并拍照進(jìn)行對(duì)比。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0 for Windows(SPSS Inc. Chicago，IL，USA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(*.P<0.05；**.P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

為檢測(cè)BVDV感染MDBK對(duì)HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，使用BVDV TC株感染MDBK細(xì)胞后不同時(shí)間收集細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，與空白組相比病毒感染24 h時(shí)HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，36和48 h時(shí)極顯著升高(P<0.01)，表明BVDV感染MDBK細(xì)胞導(dǎo)致HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄增加。

*. P<0.05; **. P<0.01；下同

2.2 Western blot檢測(cè)HSP90B1蛋白表達(dá)

為進(jìn)一步檢測(cè)BVDV感染MDBK細(xì)胞對(duì)HSP90B1表達(dá)的影響，使用BVDV TC株感染MDBK細(xì)胞48 h后提取蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果與空白組相比BVDV感染細(xì)胞后細(xì)胞中的HSP90B1蛋白表達(dá)水平明顯增加(圖2)，表明BVDV感染MDBK細(xì)胞使MDBK細(xì)胞內(nèi)HSP90B1蛋白的表達(dá)量升高。

A. Western blot檢測(cè)結(jié)果；B. 灰度值分析

2.3 lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

為構(gòu)建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質(zhì)粒，利用限制性?xún)?nèi)切酶BsmBⅠ酶切l(wèi)entiCRISPR v2質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示得到兩條大小不同的條帶，一條在12 000 bp，一條在2 000 bp(圖3)，與預(yù)期結(jié)果一致，回收12 000 bp處的目的條帶，將連接構(gòu)建的重組質(zhì)粒lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落PCR后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒中HSP90B1 sgRNA 和Scramble sgRNA是否連接成功，結(jié)果在260 bp處顯示條帶(圖4)，同時(shí)送至公司進(jìn)行測(cè)序并使用Snapgene (v4.2.4)軟件繪制圖譜，以上結(jié)果表明lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Marker. DL10000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. 酶切后lentiCRISPR v2

Marker. DL500 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～12. lentiCRISPR v2-HSP90B1-sgRNA；13. 陰性對(duì)照

2.4 HSP90B1 KO/Scramble細(xì)胞構(gòu)建及檢測(cè)

為得到HSP90B1 KO/Scramble細(xì)胞，轉(zhuǎn)染包裝HSP90B1-sgRNA、Scramble-sgRNA和GFP慢病毒，懸浮感染MDBK細(xì)胞，使用熒光倒置顯微鏡觀察GFP對(duì)照組的感染效率，結(jié)果在顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)量約為50%，表明感染效率為50%(圖5)；加入終濃度為3 μg·mL-1的嘌呤霉素，連續(xù)篩選4代獲得陽(yáng)性細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot，結(jié)果與對(duì)照組相比HSP90B1蛋白的表達(dá)量明顯降低(圖6)，表明HSP90B1 KO細(xì)胞構(gòu)建成功。

A. 明場(chǎng)下HEK-293T；B. 熒光通路下HEK-293T；C. 合并圖。掃描文章首頁(yè)OSID碼可查看彩圖

A. Western blot檢測(cè)結(jié)果；B. 灰度值分析

2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)情況檢測(cè)

為檢測(cè)敲除HSP90B1基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的影響，將相同數(shù)量的不同細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分時(shí)間段利用0.25%Trypsin-EDTA消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示相同時(shí)間的Scramble、HSP90B1 KO細(xì)胞的數(shù)量與MDBK細(xì)胞相比未見(jiàn)差異(圖7)，表明敲除HSP90B1對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

圖7 細(xì)胞生長(zhǎng)情況檢測(cè)結(jié)果

2.6 qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平

為檢測(cè)HSP90B1對(duì)BVDV 5′UTR RNA表達(dá)的影響，于BVDV感染后不同時(shí)間收集細(xì)胞及培養(yǎng)液，提取總RNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平，結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組Scramble細(xì)胞相比，病毒感染HSP90B1 KO細(xì)胞12 h后BVDV 5′UTR RNA水平顯著降低(P<0.05)，感染36 h后極顯著性降低(P<0.01)，表明敲除HSP90B1基因會(huì)抑制BVDV 5′UTR RNA的表達(dá)水平。

圖8 qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞中BVDV 5′UTR RNA

2.7 免疫熒光檢測(cè)BVDV dsRNA含量

為明確HSP90B1對(duì)BVDV dsRNA在細(xì)胞中形成的影響，BVDV感染HSP90B1 KO和Scramble細(xì)胞后不同時(shí)間收集細(xì)胞爬片，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布及強(qiáng)度，結(jié)果BVDV dsRNA呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核顯示紅色熒光。與對(duì)照組相比，HSP90B1 KO細(xì)胞中的綠色熒光明顯減少(圖9)，表明敲除HSP90B1能夠減少BVDV dsRNA在細(xì)胞中的形成。

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2.8 BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞后病毒滴度檢測(cè)

為驗(yàn)證HSP90B1對(duì)BVDV子代病毒形成的影響，BVDV TC株感染HSP90B1 KO細(xì)胞和對(duì)照Scramble細(xì)胞后，分別于12、24、36、48 h收集病毒液，利用Reed-Muench法測(cè)定不同病毒液中的病毒滴度，結(jié)果在BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞12 h后與對(duì)照組相比，病毒滴度顯著降低(P<0.05)，感染36 h后病毒滴度極顯著性降低(P<0.01)(圖10)，表明敲除HSP90B1能夠抑制BVDV子代病毒的形成。

圖10 BVDV感染HSP90B1 KO后病毒滴度檢測(cè)

2.9 BVDV感染HSP90B1 KO細(xì)胞CPE情況

為驗(yàn)證HSP90B1對(duì)BVDV致細(xì)胞病變能力的影響，使用BVDV TC感染HSP90B1 KO細(xì)胞和對(duì)照Scramble細(xì)胞后，于不同時(shí)間利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，結(jié)果BVDV感染對(duì)照組Scramble細(xì)胞12和24 h后出現(xiàn)明顯CPE，而HSP90B1 KO細(xì)胞很難觀察到CPE，感染36和48 h HSP90B1 KO細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，但對(duì)照組Scramble細(xì)胞已出現(xiàn)大量CPE并有細(xì)胞脫落(圖11)，結(jié)果表明敲除HSP90B1能夠降低BVDV的致細(xì)胞病變能力。

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3 討 論

牛病毒性腹瀉病毒是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、個(gè)體極小的微生物[18]，由于病毒缺少細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征，導(dǎo)致其必須依賴(lài)于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和增殖，病毒從進(jìn)入細(xì)胞，到細(xì)胞內(nèi)的組裝、復(fù)制、合成等都需要細(xì)胞內(nèi)基因的輔助[19]。HSP90B1是一種熱休克蛋白，主要參與ERS和細(xì)胞凋亡過(guò)程，Sengupta等[20]發(fā)現(xiàn)HSP90B1在日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染的小鼠大腦和Neuro2a細(xì)胞中顯示出差異性，并強(qiáng)調(diào)了其在黃病毒感染期間對(duì)ER膜重塑和ERS的重要性[12]；Zhong等[21]通過(guò)STRING分析，發(fā)現(xiàn)HSPA5、HSPA1B、HSP90B1和HSPA6四種熱休克蛋白可能與MDBK細(xì)胞中山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)的增殖有關(guān)；本研究組前期使用BVDV TC感染MDBK細(xì)胞后進(jìn)行蛋白質(zhì)譜篩選差異基因，結(jié)果顯示HSP90B1具有顯著性差異(未發(fā)表)。為驗(yàn)證蛋白質(zhì)譜的結(jié)果，本研究使用qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染MDBK細(xì)胞后HSP90B1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果感染24 h時(shí)HSP90B1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，36和48 h時(shí)極顯著升高(P<0.01)，利用Western blot檢測(cè)BVDV感染MDBK細(xì)胞后HSP90B1蛋白表達(dá)水平，顯示感染后HSP90B1蛋白的表達(dá)量明顯升高；表明BVDV感染能夠誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞中HSP90B1的表達(dá)，猜測(cè)HSP90B1基因可能會(huì)影響B(tài)VDV的復(fù)制。

為研究基因?qū)Σ《镜挠绊?，Liang等[22]敲低三基序蛋白26(tripartite motif containing 26，TRIM26)發(fā)現(xiàn)，TRIM26參與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的復(fù)制，并且減少TRIM26的表達(dá)能夠降低HCV RNA和NS3蛋白表達(dá)水平；Mladinich等[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)現(xiàn)C-C基序趨化因子配體5(C-C motif chemokine ligand 5，CCL5)是寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)持久性需要的重要因素；Isken等[24]敲除DNAJC14研究了該基因?qū)τ谖敛《綬NA復(fù)制的影響。為研究HSP90B1基因?qū)VDV復(fù)制的影響，作者應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除MDBK細(xì)胞的HSP90B1基因，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)敲除效率，結(jié)果顯示HSP90B1 KO細(xì)胞中的HSP90B1蛋白表達(dá)極明顯降低，表明HSP90B1基因被敲除，成功構(gòu)建HSP90B1 KO細(xì)胞，為后期研究HSP90B1對(duì)BVDV的復(fù)制提供細(xì)胞基礎(chǔ)。分不同時(shí)間段進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示相同時(shí)間生長(zhǎng)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯差異，表明敲除HSP90B1基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

利用BVDV TC感染HSP90B1 KO和對(duì)照組Scramble細(xì)胞后，進(jìn)行病毒含量檢測(cè)。宋爽等[25]依據(jù)高度保守的BVDV 5′UTR基因，進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，用熒光定量PCR檢測(cè)BVDV，顯示該方法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)BVDV 5′UTR RNA水平，結(jié)果與對(duì)照組相比，病毒感染HSP90B1 KO細(xì)胞12和24 h后BVDV 5′UTR RNA水平顯著降低(P<0.05)，36和48 h后極顯著降低(P<0.01)；間接免疫熒光法在臨床中能夠高效快速地檢測(cè)BVDV分子，并且具有較高的特異性和可靠性，利用免疫熒光染色后BVDV dsRNA呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核顯示紅色熒光與對(duì)照組相比HSP90B1 KO細(xì)胞中的綠色熒光明顯減少；病毒滴度及CPE也是顯示病毒表達(dá)量的方法之一，利用病毒滴度及CPE檢測(cè)感染HSP90B1 KO細(xì)胞后的病毒含量，與對(duì)照組相比感染HSP90B1 KO細(xì)胞的病毒滴度在12 h后顯著降低(P<0.05)，36 h后極顯著降低(P<0.01)，CPE結(jié)果顯示在感染12 h后對(duì)照組Scramble細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，而HSP90B1 KO細(xì)胞很難觀察到CPE，感染36 h后HSP90B1 KO細(xì)胞出現(xiàn)CPE，但此時(shí)對(duì)照組Scramble細(xì)胞已出現(xiàn)大量CPE并有細(xì)胞脫落；以上結(jié)果顯示HSP90B1 KO細(xì)胞中的病毒含量明顯少于對(duì)照組Scramble細(xì)胞，表明敲除HSP90B1基因能夠抑制BVDV的復(fù)制。

HSP90B1主要富集于ERS和細(xì)胞凋亡通路，有研究顯示BVDV感染能夠誘導(dǎo)ERS信號(hào)通路的激活[26]，而且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡糖苷酶的活性，能夠阻止BVDV E2蛋白在高爾基體內(nèi)的加工，并且降低病毒粒子的感染性[27]，以此推測(cè)HSP90B1基因可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路影響B(tài)VDV的復(fù)制，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

BVDV感染MDBK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)HSP90B1表達(dá)；CRISPR/Cas9成功敲除MDBK細(xì)胞的HSP90B1基因，構(gòu)建HSP90B1 KO細(xì)胞，敲除HSP90B1能夠抑制BVDV的復(fù)制。