孫飛雁，葉京飛，魏 宇，王子賢，張金玉，邴麗媛，孟婷婷，王 帥，趙立峰，孫 亮，郭 利*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 132101； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130122；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118； 4.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；5.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，長(zhǎng)春133000)

牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)引起的犢牛腹瀉、呼吸道為主要臨床特征的牛病毒性傳染病[1]。Mebus等[2]最早于1972年在牛腹瀉病例的糞便中分離到BCoV。BCoV屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬單股正鏈RNA病毒，有囊膜，具有多形性，是目前自然界已知的最大RNA病毒[3]，分屬于冠狀病毒屬中的β類。冠狀病毒屬分為α、β、γ、δ類，其中，β類主要感染哺乳動(dòng)物[4]。BCoV與人冠狀病毒OC43(HCoV-OC43)的基因具有較高相似性，是否存在跨種傳播仍需進(jìn)一步研究。BCoV編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(N)、嵌膜蛋白(M)、血凝素-酯酶蛋白(HE)、纖突蛋白(S)、次要嵌膜蛋白E。HE蛋白由兩個(gè)單體經(jīng)二硫鍵連接形成，可發(fā)揮乙酰酯酶的生物學(xué)活性，參與病毒的早期吸附，引起紅細(xì)胞的凝集[5]。HE蛋白可以引發(fā)阻斷病毒附著的中和抗體，又具有感染性，對(duì)免疫及疫苗研究具有重要意義[6]。S蛋白包含S1和S2兩個(gè)亞基，S1負(fù)責(zé)病毒、宿主細(xì)胞的識(shí)別與結(jié)合，而S2與病毒細(xì)胞的融合有關(guān)[7]。S蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生中和抗體，因此在病毒的附著及進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)具有重要作用[8]。牛冠狀病毒病可發(fā)生于各年齡段牛，春冬季發(fā)病率最高，犢牛腹瀉和呼吸道癥狀明顯，呼吸困難，嚴(yán)重者出現(xiàn)血便，直至死亡[9]。成年牛呼吸道癥狀更為突出，或呈隱性感染，持續(xù)帶毒排毒，在牛群內(nèi)迅速傳播[10-11]。近兩年發(fā)病逐漸增多，表現(xiàn)在3～4月齡犢牛死亡率增加，呼吸道癥狀嚴(yán)重，偶有猝死現(xiàn)象，個(gè)別牛場(chǎng)全群發(fā)病，且與呼吸道及腹瀉等病毒病混合感染，病情更加復(fù)雜，給牛場(chǎng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)吉林省東中西地區(qū)的牛場(chǎng)進(jìn)行了BCoV的抗原和抗體的流行病學(xué)調(diào)查，了解掌握BCoV在調(diào)查地區(qū)的流行情況，血清抗體陽(yáng)性率1.08%，抗原陽(yáng)性率21.10%。并對(duì)流行毒株進(jìn)行了測(cè)序分析，調(diào)查地區(qū)主要流行毒株與中國(guó)四川株親緣關(guān)系最近，為吉林省牛冠狀病毒病的發(fā)病、流行情況及疫病防控提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

從吉林省德惠市、延吉市、雙遼市、九臺(tái)區(qū)、柳河縣、伊通縣、東遼縣、農(nóng)安縣、前郭縣、鎮(zhèn)赍縣、吉林市、雙陽(yáng)區(qū)12個(gè)市(縣、區(qū))的規(guī)?；?chǎng)、養(yǎng)殖合作社及家庭養(yǎng)殖戶共計(jì)462頭牛采集了497份臨床樣品，包括糞便、鼻拭子、咽拭子、血液、乳液及肺等組織樣品。組織樣品主要采自發(fā)病牛。

從吉林省東中西部地區(qū)的前郭縣、東豐縣、公主嶺市、長(zhǎng)嶺市、安定鎮(zhèn)、德惠市、蛟河市、柳河縣、扶余市9個(gè)市(縣、區(qū))的規(guī)?；?chǎng)、養(yǎng)殖合作社及家庭養(yǎng)殖戶等45個(gè)場(chǎng)點(diǎn)于春防與秋防期間采集了1 298頭成年牛和犢牛的牛血清樣本。除組織樣品采集自臨床上表現(xiàn)呼吸急促，咳喘，腹瀉，并伴有血痢疾的病死牛外，其余樣品均為隨機(jī)采樣(血清樣本由吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供)。

1.2 主要試劑

BCoV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒、BCoV鑒定引物均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。瓊脂糖購(gòu)自Promega公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；BCoV抗體檢測(cè)試劑盒(MM-154801)購(gòu)自青島凱泰克工貿(mào)有限公司。

1.3 主要儀器

PCR 擴(kuò)增儀：美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀Synergy H1：美國(guó)BioTeke公司。

1.4 樣品處理

將采集的組織樣品進(jìn)行液氮研磨處理，加入PBS中進(jìn)行混勻，糞、鼻、咽喉拭子類棉簽浸入含1%雙抗的DMEM拭子液中，所有樣品充分混勻后離心去沉淀留液體備用。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：KX982264.1)，選擇相對(duì)保守區(qū)域N基因，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)N基因的檢測(cè)引物、1對(duì)HE全基因擴(kuò)增引物、6對(duì)S全基因擴(kuò)增引物(表1)。引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物有限公司合成。

表1 BCoV N、HE和S基因引物信息

1.6 病毒RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將462份樣品(每牛1份)分別提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，反轉(zhuǎn)錄后cDNA均保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 納米PCR的檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的對(duì)BCV特異，與BRV、BVDV、IBRV、BRSV、BPIV3均無(wú)交叉反應(yīng)的BCoV nano-PCR 新型核酸檢測(cè)方法[12]，對(duì)臨床樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及條件如下，總體系：25 μL，12.5 μL的2×HiFi Taq高保真預(yù)混PCR反應(yīng)體系，409 bp大小的N基因檢測(cè)上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，納米粒子1.5 μL，去離子水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃總延伸5 min。PCR之后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，得到的陽(yáng)性產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為409 bp，純化后送庫(kù)美生物公司測(cè)序分析。

1.8 HE、S全基因的擴(kuò)增

以上述提取的病毒核酸反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，通過(guò)上述表1中S基因、HE基因的全基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程中各段引物的退火溫度Tm值，則根據(jù)引物不同進(jìn)行調(diào)整，PCR反應(yīng)體系：總體系為25 μL，12.5 μL的2×HiFi Taq高保真預(yù)混PCR反應(yīng)體系，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55～58 ℃ 30 s,72 ℃ 50～80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并按照瓊脂糖凝膠RNA/DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化,純化后送至庫(kù)美生物公司測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，并使用Megalign軟件進(jìn)行比對(duì)分析建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.9 牛冠狀病毒病的抗體檢測(cè)

對(duì)2020-2021年春防與秋防期間采集的1 298份牛血清樣本，應(yīng)用ELISA 抗體試劑盒進(jìn)行BCoV抗體檢測(cè)，檢測(cè)前將所有的試劑盒組分從冰箱中取出放置室溫下3～4 h后再使用，具體操作詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié) 果

2.1 BCoV病原核酸檢測(cè)結(jié)果

對(duì)462份臨床樣品提取核酸后，使用特異性引物進(jìn)行納米PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出目的片段為409 bp大小的樣品有97份， 部分BCoV陽(yáng)性樣品瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；N.陰性對(duì)照；1～3.肺組織樣品；4～6.鼻拭子；7、8.糞拭子；9、10.腸組織樣品

對(duì)各個(gè)地區(qū)的462份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)后可知，共有97份陽(yáng)性樣品，總體陽(yáng)性率為21.10%，吉林省東、中、西部地區(qū)均有BCoV病原的存在，從平均陽(yáng)性率上來(lái)看，東部地區(qū)陽(yáng)性率最高，其次為西部地區(qū)，最后為中部地區(qū)。東部地區(qū)采集的122份臨床樣品主要包括延吉市81份(陽(yáng)性率11.11%)和柳河縣41份(陽(yáng)性率68.29%)，該地區(qū)平均陽(yáng)性率為30.33%。西部地區(qū)的135份臨床樣品主要來(lái)自于雙遼市、伊通縣、前郭縣、鎮(zhèn)赍縣四個(gè)地方，其中雙遼市31份樣品中有18份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率最高，達(dá)58.06%；伊通縣次之，44份樣品中檢出9份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20.45%；30份前郭縣樣品和30份鎮(zhèn)赍縣樣品均未檢出BCoV；西部地區(qū)的平均陽(yáng)性率為20.00%。最后為中部地區(qū)，平均陽(yáng)性率為16.10%。中部地區(qū)的205份臨床樣品包括50份東遼縣樣品，陽(yáng)性率最高，為30.00%；34份雙陽(yáng)區(qū)樣品陽(yáng)性率次之，為29.41%；23份九臺(tái)區(qū)樣品和23份德惠市樣品，陽(yáng)性率均為17.39%；農(nóng)安縣的51份樣品和吉林市的24份樣品陽(yáng)性率均為0%。吉林省各地區(qū)牛冠狀病毒病原核酸陽(yáng)性率結(jié)果如表2所示。

表2 吉林省各地區(qū)牛冠狀病毒病原核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2 BCoV的HE、S基因序列擴(kuò)增

對(duì)BCoV特異性引物檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)序列一致。以陽(yáng)性樣品的cDNA為模板使用普通PCR方法進(jìn)行HE、S基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增，結(jié)果所擴(kuò)增的HE序列比對(duì)后均一致，由于S基因因變異性高，僅完整擴(kuò)增出一條，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳圖可知(圖2)，獲得了預(yù)期目的片段。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.S1-894 bp；2.S2-887 bp；3.S3-1 108 bp；4.S4-756 bp；5. S5-748 bp；6. S6-813 bp；7. HE-1201 bp

2.3 BCoV的HE、S基因序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，送至測(cè)序公司。測(cè)序成功的序列HE、S1-S6分別應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，HE、S兩條序列均拼接成功。登錄NCBI網(wǎng)站，分別將HE、S序列進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果表明其與BCoV的相似性高達(dá)99%，證實(shí)所擴(kuò)增的序列確實(shí)為BCoV的HE、S序列。

應(yīng)用DNAStar軟件中的Megaline，將HE、S基因序列同GenBank上傳的30條國(guó)內(nèi)外BCoV序列進(jìn)行同源性分析及遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。發(fā)現(xiàn)此研究中的HE基因序列同GenBank中不同毒株序列的核苷酸相似性均較高(96.20%～99.60%)，其中，與中國(guó)四川株(MW711306.1)相似性最高，相似性為99.60%；與美國(guó)經(jīng)典株Mebus株相似性為96.90%。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，此研究中的BCoV-JL的HE基因序列與中國(guó)四川株(MW711306.1)親緣關(guān)系最近，位于同一分支，并與另外3株中國(guó)四川株、1株中國(guó)青海株(MW711309.1、MH475914.1、MN982191.1、MW711319.1)聚為一小分支，親源關(guān)系較近(圖3、4)。S基因同GenBank中不同毒株序列的核苷酸相似性均較高(89.50%～99.10%)，其中，與中國(guó)四川株(MN982198.1、MW711287.1、MN982199.1)相似性均達(dá)99%以上，與美國(guó)經(jīng)典株Mebus株相似性為89.90%。通過(guò)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，此研究中的BCoV-JL株與中國(guó)河北株(MK903506.1)距離最近，并與中國(guó)四川株(MN982198.1、)MN982199.1、MW711287.1)中國(guó)新疆株(KU886219.1)聚為一小分支(圖5、6)。

圖3 HE基因核苷酸同源性

▲.本研究擴(kuò)增的毒株；△.與所擴(kuò)增的毒株親緣關(guān)系相近的毒株

圖5 S基因核苷酸同源性

▲.本研究擴(kuò)增的毒株；△.與所擴(kuò)增的毒株親緣關(guān)系相近的毒株

2.4 牛冠狀病毒病的抗體情況

通過(guò)調(diào)查吉林省各地區(qū)1 298份血清樣品的BCoV的抗體水平發(fā)現(xiàn)：吉林省各地區(qū)BCoV的總體抗體陽(yáng)性率為1.08%，東中西部平均抗體陽(yáng)性率為1.39%,其中東、西、中部地區(qū)的陽(yáng)性率分別為2.50%、1.10%、0.56%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 吉林省各地區(qū)牛冠狀病毒病抗體情況

3 討 論

牛冠狀病毒(BCoV)在全球范圍內(nèi)流行，該病是牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)重要的病毒性病原之一[13-15]，可引起包括嚴(yán)重的呼吸道病和消化道腹瀉癥狀，可導(dǎo)致病牛死亡，目前缺少有效的防制手段。自1990年我國(guó)學(xué)者姚火春等[16]首次發(fā)現(xiàn)牛冠狀病毒病后,牛冠狀病毒在我國(guó)各省份牛臨床樣本中陸續(xù)檢出[17-21]。近兩年在臨床腹瀉和呼吸道疫病的臨床樣本中，牛冠狀病毒的檢測(cè)逐年增加。2020年以前，吉林省中部地區(qū)牛呼吸道及腹瀉樣本核酸檢測(cè)以牛病毒性病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(BHoV-1)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)較為常見(jiàn)，以BVDV最多[22-24]。2020年以后，在吉林省各個(gè)地區(qū)均有大量臨床樣檢測(cè)到BCoV，或者BCoV與其他病毒混合感染的情況，混合感染的牛場(chǎng)犢牛病死率更高，總體來(lái)看，吉林省各地區(qū)均存在牛冠狀病毒的感染情況，BCoV的流行主要集中在吉林省的東部地區(qū)，中部地區(qū)和西部地區(qū)感染率稍低。2020年冬季，吉林雙遼某牛場(chǎng)規(guī)?；癄倥Ｒ駼CoV單純感染，導(dǎo)致3～4月齡犢牛死亡率接近70%。吉林四平某規(guī)?；?chǎng)因BCoV與BVDV混合感染導(dǎo)致新生犢牛死亡率高達(dá)76.8%，吉林豐滿區(qū)某家庭型養(yǎng)牛戶6只牛犢5頭死亡，損失慘重。本研究調(diào)查顯示，急性發(fā)病期牛臨床剖檢肺部、心臟及腸道病變嚴(yán)重，且可形成毒血癥，侵襲動(dòng)物機(jī)體各組織臟器，同時(shí)鼻拭子及糞便中均可檢測(cè)到病毒。BCoV 的HE蛋白的單克隆抗體在體外有效中和了BCoV感染性，并在體內(nèi)保護(hù)牛的腸上皮免受病毒感染[25]，與S蛋白有相似功能，在誘導(dǎo)BCoV感染的保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。另外BCoV 的S蛋白參與受體識(shí)別、宿主特異性、抗原多樣性和免疫原性[26]。其基因序列是可變的，該蛋白的突變與病毒抗原性、病毒致病性、宿主范圍和組織取向的改變有關(guān)[27]，因此對(duì)吉林省內(nèi)BCoV流行毒株的HE、S基因進(jìn)行了分析，其序列同GenBank中29株代表性毒株序列分析結(jié)果顯示，不同毒株序列的核苷酸相似性均較高，相似性均達(dá)90%以上，與中國(guó)四川株、河北株親緣關(guān)系最近，處于同一分支，與美國(guó)經(jīng)典株Mebus株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于國(guó)內(nèi)流行毒株。

該病入秋以后陸續(xù)發(fā)生，冬春兩季高發(fā)，與抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率相比，牛血清樣品中BCoV抗體陽(yáng)性率較低，分析原因可能與采樣時(shí)間有關(guān)，部分血清采集自發(fā)病牛場(chǎng)，處于疫病急性期，血清抗體滴度低，一部分采集自9月份，可能原因?yàn)榇杭疽卟×餍羞^(guò)后抗體持續(xù)期時(shí)間較短導(dǎo)致，但未見(jiàn)有相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道，是否為抗體陽(yáng)性率低的原因尚待進(jìn)一步研究分析。后續(xù)將對(duì)病原學(xué)陽(yáng)性地區(qū)和陽(yáng)性牛群進(jìn)行重點(diǎn)采樣，進(jìn)行血清流行病學(xué)檢測(cè)，以進(jìn)一步評(píng)估BCoV的流行分布情況， 支撐對(duì)BCoV的流行病學(xué)調(diào)查及綜合防控的理論指導(dǎo)。

新冠疫情的突然暴發(fā)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)也產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，非洲豬瘟暴發(fā)之后，畜牧業(yè)動(dòng)蕩，產(chǎn)業(yè)格局正在發(fā)生變化。吉林省是我國(guó)肉牛業(yè)大省，是東北肉牛優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)帶的核心，肉牛業(yè)為吉林省畜牧業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。雖然我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速，牛存欄數(shù)量和牛肉消費(fèi)量位于世界前列水平，但肉牛養(yǎng)殖水平整體落后，科學(xué)研究技術(shù)水平相對(duì)滯后，尤其疫病研究起步晚，可用于支持產(chǎn)業(yè)的發(fā)展的生物制品少，重視度不夠。近年來(lái)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)逐漸增多，但標(biāo)準(zhǔn)化科學(xué)養(yǎng)殖體系尚未形成，疫病防控監(jiān)管力度不夠，防病意識(shí)薄弱，尤其以牛呼吸道疾病問(wèn)題突出，本病秋冬兩季發(fā)病率高，死亡率也呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究對(duì)吉林省中部地區(qū)BCoV流行情況進(jìn)行了全面調(diào)查，豐富了牛冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，為指導(dǎo)牛冠狀病毒的防控工作奠定了基礎(chǔ)，為制定和指導(dǎo)牛冠狀病毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

吉林省地區(qū)牛冠狀病毒已廣泛流行與傳播，2021—2022年間，平均感染率為21.10%，犢牛更易感，多發(fā)病于冬春季節(jié)，東部地區(qū)屬于高發(fā)，屬于國(guó)內(nèi)流行毒株。