高超群，曹然然，杜文蘋，胡曉玉，雷艷茹，李文婷，康相濤

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，鄭州 450046； 2.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室, 鄭州 450046)

家雞是人類馴化較早的家禽，不僅是人類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的主要來源，而且與人類文化生活也有著密切的聯(lián)系，從古至今被用于祭祀、娛樂或觀賞等[1-2]。中國作為可能的家雞起源地之一，地理和文化多樣性豐富且幅員遼闊[3-5]，是世界上雞遺傳資源最豐富的國家之一[6]。2021年公布的《國家畜禽遺傳資源品種名錄》中地方雞品種達到115個。中國地方雞在經(jīng)歷幾千年的自然和人工選擇下已形成了紛繁、各具特色品種眾多的群體，積累了相當豐富的遺傳變異和表型多樣性[7]。清楚地研究和理解種群之間和種群內(nèi)部的多樣性及種群結(jié)構(gòu)對于有效管理遺傳資源至關(guān)重要[8]。

此前，中國地方雞遺傳多樣性與種群結(jié)構(gòu)的研究主要使用微衛(wèi)星標記[9-11]，其在非洲[12]、孟加拉國[13]、印度尼西亞[14]等國的地方雞及商業(yè)品種[15-16]的遺傳多樣性研究中被廣泛使用，研究結(jié)果對地方品種的保護以及揭示品種起源、育種歷史提供了參考。但微衛(wèi)星標記對于新物種開發(fā)微衛(wèi)星位點時隨機性大，利用其檢測多態(tài)性耗時耗力，因此具有一定的局限性[17]。近年來，NGS測序及基因分型芯片的快速發(fā)展極大的推進了更加精細、快速、且低成本的全基因組SNP標記分析。Zhang等[18]利用全基因組SNP標記分析了中國地方雞的種群多樣性及斗雞的選擇特征；Cendron等[19]利用SNP標記對意大利地方雞品種多樣性以及種群結(jié)構(gòu)進行了詳細的分析，在其他物種如羊[20]、牛[21]、豬[22]、馬[23]等的研究中基于全基因SNP標記對其遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)以及育種起源歷史進行了比較系統(tǒng)的研究。因此，本研究使用全基因組SNP標記，分析中國地方雞品種的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系、ROH，為設(shè)計和實施遺傳資源保護策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究選取Synergistic Plant and Animal(SYNBREED, www.synbreed.tum.de)項目部分數(shù)據(jù)。SYNBREED 項目從全球范圍雞群體中廣泛收集了脫氧核糖核酸 (DNA) 樣本，本研究從中選取了18只白耳黃雞(Baier)、19只茶花雞(Chahua)、20只河南斗雞(Fighting)、20只固始雞(Gushi)、20只狼山雞(Langshan)、20只皖南三黃雞(WanTy)、20只泰和烏骨雞(Wugu)以及20只蕭山雞(Xiaoshan)等8個中國地方雞品種，共157只地方雞個體及80只白殼蛋雞系(WL)、73只褐色蛋雞系(BL)和80只肉雞系(BR)共233只商品雞個體構(gòu)建新的數(shù)據(jù)集。

1.2 基因分型

使用 Affymetrix?AxiomTM600 K全基因組雞基因分型芯片對 DNA 樣本進行基因分型，基因分型在慕尼黑工業(yè)大學(xué) (Prof. R. Fries) 進行，Affymetrix?AxiomTM600 K全基因組雞基因分型芯片 包含超過580K個SNPs[24]。使用參考基因組Gallus_gallus-5.0[25]注釋了 579 621 個 SNPs。

1.3 數(shù)據(jù)過濾

首先刪除了重復(fù)、注釋不明確及性染色體的27 427個SNPs，之后使用PLINK 1.9[26]進行過濾：1) ≥95% 的個體檢出率；2) ≥99%的SNP 檢出率，共保留443 352個SNPs的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。最后使用PLINK基于連鎖不平衡進行過濾，窗口大小、步長及r2的參數(shù)分別為“50、5、0.2”，通過過濾的157 968個SNPs用于種群結(jié)構(gòu)的分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 遺傳多樣性指數(shù) 使用PLINK 估計觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(expected heterozygosity,He)、次等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)以及基于觀測和期望純合基因型數(shù)量之間的差異估計的基因組近交系數(shù)(FHOM)。每個品種中個體的He和Ho估計值是所有 SNPs 的平均值。使用VCFtools[27]進行種群核苷酸多樣性計算，以上多種指數(shù)可以反映種群的遺傳多樣性。

1.4.2 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及ROH 使用PLINK基于Bayesian model用于主成分分析(principal component analysis, PCA)、地方雞和商品雞組合數(shù)據(jù)集多維尺度縮放(MDS)分析及構(gòu)建遺傳距離矩陣和全基因組的狀態(tài)同源(identity by State, IBS)距離矩陣，使用MEGAX (https://www.megasoftware.net/) 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetic tree)，參數(shù)設(shè)置為引導(dǎo)復(fù)制1 000次，通過iTol(https://itol.embl.de/)注釋可視化。使用 ADMIXTURE 1.3[28]分析種群的相關(guān)性，設(shè)置了K=2～10的數(shù)據(jù)集。R語言Hierfstat包用于計算所有品種成對群體分化指數(shù)(Fst)，估計種群間遺傳分化，根據(jù)Fst值將遺傳分化分為4個水平：低(<0.05)、中(0.05～0.15)、高(0.15～0.25)和極高(>0.25)[29]。使用PLINK檢測長純合片段(runs of Homogeneity，ROH)，基因組近交系數(shù)(FROH)等于基因組中ROH片段的總長度占?；蚪M總長度(944 270 kb)的比例，每個ROH根據(jù)其物理長度分類如下：1～2、2～4、4～8、8～16和≥16 Mb[30-32]。

2 結(jié) 果

2.1 種群內(nèi)遺傳多樣性

遺傳多樣性指標如表1所示，皖南三黃雞的期望雜合度(He, 0.314)、觀測雜合度(Ho, 0.321)及次等位基因頻率(MAF, 0.236)最高，斗雞的最低(He, 0.239；Ho, 0.260；MAF, 0.175)，所有品種的Ho均高于He，表明各品種遺傳多樣性均較為豐富；斗雞的平均FHOM最高(0.205)，其次是固始雞(0.184)與烏骨雞(0.180)，狼山雞(0.018)與皖南三黃雞(0.017)的FHOM最低。核苷酸多樣性結(jié)果見圖1，其變化趨勢與MAF值基本一致，皖南三黃雞具有最高的核苷酸多樣性，斗雞最低。

表1 家雞品種遺傳多樣性指數(shù)

圖1 不同雞種的核苷酸多樣性

2.2 群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系

2.2.1 群體結(jié)構(gòu) 本研究利用鄰接法構(gòu)建了種群之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對樣本和品種進行注釋(圖2A)，不同品種分布在不同的分支上，充分展示了品種間的集群和關(guān)系。皖南三黃雞的分支最短，而茶花雞的分支最長，其中有一只離群的烏骨雞出現(xiàn)在了蕭山雞的分支旁。

主成分分析(PCA)顯示前兩個主成分的貢獻率： PC1(18.59%)和PC2(15.27%)。來自8個品種的個體清楚地分為5個亞群(圖2B)，其中茶花雞、固始雞、斗雞以及狼山雞為獨立的種群。在PC1上斗雞、固始及狼山雞距離較近，與進化樹分析結(jié)果基本一致。進一步利用組合數(shù)據(jù)集進行MDS分析(圖2C)，雖然地方雞種整體相對與商業(yè)肉雞品種(BR)更加接近，但也呈現(xiàn)出不同的分層，在地方品種中，茶花雞和蕭山雞更接近商業(yè)肉雞品種。

圖2 家雞群體系統(tǒng)發(fā)育樹(A)、PCA(B)及MDS(C)分析圖

通過Admixture分析(圖3)計算了從2到10個潛在集群(K)的范圍，由圖3A可知，總樣本中存在的最佳擬合種群數(shù)量是K=7。K=2(圖3B)時，茶花雞首先分離出來；K=3時，斗雞與固始雞分離出來；K=4時，狼山雞分離，K=5時白耳黃雞與烏骨雞分離出來；K=6時蕭山雞分離出來。有趣的是在最小誤差K=7時皖南三黃雞血統(tǒng)也是其他幾種品種之間的混合，直到K=8時，皖南三黃雞才分離出來。事實上，當K=8時也更符合現(xiàn)實的分群，其誤差也僅次于K=7(圖3A)，表明皖南三黃雞的血統(tǒng)比較雜合，這與其上述遺傳多樣性研究結(jié)果相一致。

圖3 K值最佳路線圖(A) 和群體結(jié)構(gòu)圖(B)

2.2.2 親緣關(guān)系 所有品種對之間的遺傳分化程度見圖4A，這些結(jié)果與 PCA分析結(jié)果一致。Fst值范圍從0.09(皖南三黃雞和狼山雞)到 0.22(茶花雞和狼山雞)，皖南三黃雞與其他品種的Fst值最低在0.09～0.14之間，茶花雞的最高在0.14～0.22之間。

品種之間和品種內(nèi)部個體的IBS遺傳距離見圖4B，群體的IBS遺傳距離在0.092 9～0.319 9之間，平均為0.277 4。品種間的IBS遺傳距離較遠，但也存在一定程度的親緣關(guān)系(圖4B中顏色較淺的方格)；其中茶花雞與其他品種之間遺傳距離較遠，這與PCA結(jié)果一致。部分斗雞個體間的IBS遺傳距離較近(圖4B中顏色較淺的方格)，皖南三黃雞個體之間遺傳距離都較遠。

圖4 所有品種成對基因頻率分化指數(shù)Fst (A)，IBS距離矩陣可視化熱圖(B)

2.3 ROH分析

ROH分析共得到524 2個ROH片段，長度分布在1～41.51 Mb之間。ROH的長度和數(shù)量被認為與物種的近交程度呈正相關(guān)，其中長的ROH片段被認為是近世代近交繁殖的結(jié)果，而較短的ROH可能表明更遠的祖先效應(yīng)[33-34]。如圖5A表示，狼山雞1～2 Mb長度的ROH占比70.95%，未檢測到大于16 Mb長度的ROH；其次在皖南三黃雞1～2 Mb長度的ROH占群體的64.84%，同樣未檢測到大于16 Mb的ROH；茶花雞8～16 Mb與大于16 Mb的ROH分別占比5.14%、0.96%?；诿總€個體內(nèi)ROH總數(shù)量與長度的分布(圖5B)可以清楚地看到，皖南三黃雞和狼山雞中ROH的數(shù)量和長度均低于其他品種。目前，基于ROH 的近交系數(shù)估(FROH) 被認為是檢測近親繁殖的最有效方法之一[35]，茶花雞品種的近交平均值最高(圖5C最上方數(shù)字)，其次是固始雞和斗雞。皖南三黃雞的近交平均值最低，其次為狼山雞，個體中FROH最高極值出現(xiàn)在斗雞群體中(FROH=0.277)。

圖5 各個品種中不同長度ROH統(tǒng)計(A), 各個品種個體ROH數(shù)量與總長度(B)及各個品種FROH (C)

3 討 論

在現(xiàn)代化的動物遺傳育種進程中，優(yōu)良畜禽品種經(jīng)歷了短期高強度的人工選擇，其在改善畜禽生產(chǎn)性能的同時不可避免造成群體的近交[36]。近交會造成近交衰退及群體遺傳多樣性降低等危害，因此評估畜牧群體遺傳多樣性[23]，了解品種間的關(guān)系和種群結(jié)構(gòu)對于保證農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[19]。本研究基于高密度全基因組 SNP 芯片使用多種方法估計了遺傳多樣性指數(shù)和基因組近交系數(shù)，以此評估品種內(nèi)的遺傳多樣性水平。所研究的地方品種群體平均觀測雜合度均高于平均期望雜合度，表明地方雞遺傳多樣性較高，這與先前報道一致[18]。FHOM分析結(jié)果表明，家雞品種中皖南三黃雞和狼山雞近交程度較低，斗雞與茶花雞近交程度較高。同時觀察到皖南三黃雞和狼山雞品種的遺傳多樣性最為豐富，皖南三黃雞目前并未處于國家級保護計劃之中，這應(yīng)與其原產(chǎn)地有關(guān)[37]。處于保護計劃之中的狼山雞遺傳多樣性高于其他3個保護品種，這也與Zhang 等[38]的研究結(jié)果一致。

基于 PCA、進化樹及Admixture對種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，每個品種的個體聚集在一起并表現(xiàn)出一致的遺傳背景，在地方雞與商品雞進行MDS分析的結(jié)果中，商業(yè)品種與中國地方品種明顯區(qū)分開來，但整體上地方雞與商業(yè)肉雞品種相對更加接近，這也符合肉雞系的育種歷史[39]，表明了地方品種的肉用育種潛力。使用群體分化指數(shù)Fst和IBS遺傳距離評估種群間與種群內(nèi)的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，不同方法評估 8個品種之間的相對關(guān)系也相一致，其中斗雞部分個體間的IBS遺傳距離較近，說明其存在較高的親緣關(guān)系以及較大的近交風(fēng)險，可能需要改進選配措施，而皖南三黃雞個體之間遺傳距離都較遠，這與多樣性研究結(jié)果一致。

ROH 分析有利于實施品種保護計劃[23]，全基因組SNP特別適合檢測雜合性降低的基因組區(qū)域[40]，由此計算而來的FROH被認為是檢測近親繁殖的最有效方法之一，其準確性已在牛[41]、豬[42]和山羊[43]中得到證實。ROH的長度和數(shù)量與群體歷史信息的多個方面有關(guān)[18,44-45]。近交水平越高，基因組中ROH的數(shù)量和長度越大，因此根據(jù)結(jié)果，茶花雞、固始雞以及斗雞可能經(jīng)歷過較高強度近交繁殖。

4 結(jié) 論

本研究表明，地方雞遺傳資源多樣性整體較為豐富。斗雞和茶花雞品種的遺傳多樣性低于其他品種，狼山雞與皖南三黃雞的遺傳多樣性更加豐富，基因組近交系數(shù)和ROH分析表明茶花雞、固始雞以及斗雞近交程度相對過高，不同品種間出現(xiàn)了中高等群體分化且整體與商業(yè)肉雞品種更為接近。了解品種間分化程度與親緣關(guān)系是支持保護計劃工作的重要因素，幫助制定有針對性的交配計劃，以保護最瀕危的品種以及支持育種、遺傳資源開發(fā)與利用工作。