張高猛，丁紀(jì)強(qiáng)，劉昱宏，鄭麥青，文 杰，趙桂蘋，李慶賀

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

雞肉是我國第二大肉類生產(chǎn)和消費(fèi)品，以孵化性狀為代表的繁殖性能越來越重要[1]，然而長期以來，在白羽肉雞繁殖性能的選育中，育種工作者更加注重母雞的繁殖效率選擇，導(dǎo)致公雞繁殖能力的選擇較少。而種公雞繁殖力的優(yōu)劣直接影響后代的生產(chǎn)性能和肉雞養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究與公雞繁殖性狀相關(guān)的候選基因?qū)μ岣呷怆u生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義[2]，家禽育種中，傳統(tǒng)方法難以提高個(gè)體繁殖率，而數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)潛在候選基因的研究對(duì)重要經(jīng)濟(jì)性狀影響很大。有研究利用GWAS方法分析了396只京海黃雞核心群母雞11個(gè)繁殖性狀相關(guān)的SNPs[3]，張濤等[4]利用GWAS方法研究了京海黃雞繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記和候選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個(gè)SNPs與繁殖性狀相關(guān)。由此可見，標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)可以對(duì)繁殖性狀進(jìn)行改良，從而提高家禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。盡管動(dòng)物的QTL研究長達(dá)20多年[5]，但對(duì)公雞受精率和受精蛋孵化率的QTL定位研究還比較少。伴隨著基因分型技術(shù)的不斷發(fā)展,可以更好的從基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平解析受精率和受精蛋孵化率的遺傳基礎(chǔ)[6]。本研究基于白羽肉雞A、B兩個(gè)資源群體，使用本團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的“京芯一號(hào)”55K SNP芯片對(duì)A群體(556只)和B群體(398只)共954個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因分型，使用一般線性混合模型(LMM)對(duì)受精率和受精蛋孵化率進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，篩選與孵化性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，繁殖性狀也被證明與基因表達(dá)水平有關(guān)[7]。有研究通過深度測序探究了卵巢、垂體和下丘腦miRNA與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)[8]，發(fā)現(xiàn)前列腺素D2和WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的H-PGDS和WNT2在低精子活力表型公雞睪丸中的表達(dá)水平較低[9]。本研究對(duì)A群體G9世代8只公雞睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定孵化性狀的轉(zhuǎn)錄水平差異，進(jìn)一步解析孵化性狀的遺傳基礎(chǔ)，從而為后期的分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

A、B資源群體采用籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)，常規(guī)免疫，各世代營養(yǎng)水平保持不變，為減少其他因素對(duì)公雞孵化性狀的影響，每只公雞采精后，對(duì)12只母雞進(jìn)行人工授精，收集10 d種蛋后，經(jīng)甲醛+高錳酸鉀3倍量(即每立方米空間使用甲醛42 mL，高錳酸鉀21 g)熏蒸20 min。第18天照蛋時(shí)統(tǒng)計(jì)12只母雞的受精率后取均值，受精率為入孵蛋數(shù)中受精蛋所占的比例。21 d出雛時(shí)統(tǒng)計(jì)12只母雞的孵化率后取均值，孵化率為出雛數(shù)占受精蛋數(shù)的比例。A資源群體5個(gè)世代分別有80、76、120、120、160只公雞統(tǒng)計(jì)受精率和孵化率，B資源群體3個(gè)世代分別有118、120、160只公雞統(tǒng)計(jì)受精率和孵化率。對(duì)每只公雞翅靜脈采血，用肝素鈉抗凝管保存于-20 ℃，用于基因組DNA的提取。A群體G9世代公雞400日齡時(shí)，根據(jù)受精率高低挑選8只公雞，試驗(yàn)組和對(duì)照組各4只，解剖采樣上述睪丸組織，置于液氮凍存，用于RNA的提取。

1.2 遺傳力估計(jì)

使用R語言中的shapiro.test函數(shù)對(duì)受精率和孵化率表型進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布(P>0.05)。分別利用系譜信息和基因組信息構(gòu)建親緣關(guān)系矩陣，使用Asremlv4.1軟件包分別計(jì)算受精率的遺傳力，Wald F法估計(jì)世代和批次的效應(yīng)(P<0.01)，因此計(jì)算時(shí)將世代和批次作為固定效應(yīng)進(jìn)行矯正[10]，BLUP模型如下：

y=Xb+Zα+ε

其中,y是表型值向量，X和Z是固定效應(yīng)和加性遺傳效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣，b是固定效應(yīng)向量，α是隨機(jī)加性遺傳效應(yīng)向量，假設(shè)α～N(0，G/Aσ2α)，ε是隨機(jī)殘差向量，α～N(0，Iσ2e),G是全基因組標(biāo)記構(gòu)建的親緣關(guān)系矩陣(G矩陣)，A是基于系譜的血緣關(guān)系矩陣(A矩陣)。

1.3 SNP分型質(zhì)控

使用常規(guī)的酚-氯仿法提取血液中的基因組DNA，-80 ℃保存，將質(zhì)量合格的樣品送至北京康普森生物技術(shù)有限公司，使用“京芯一號(hào)”雞55K SNP芯片進(jìn)行基因分型，使用plink(V1.9)軟件對(duì)芯片基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控[11],剔除基因型缺失率大于10%的個(gè)體、最小等位基因頻率小于5%、樣本檢出率小于90%和分型錯(cuò)誤的SNP。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用GEMMA(V0.98.1)軟件(https://github.com/genetics-statistics/GEMMA/releases)中的單性狀混合線性模型對(duì)受精率、孵化率性狀進(jìn)行GWAS分析，該模型包括SNP作為固定因子和個(gè)體的親緣關(guān)系作為隨機(jī)效應(yīng)[12]，混合線性模型中加入批次作為固定效應(yīng)，固定效應(yīng)首先采用R(V3.6.0)軟件中model.matrix()函數(shù)轉(zhuǎn)換成0和1的設(shè)計(jì)矩陣，然后以類似于協(xié)變量的形式加入GEMMA軟件中。統(tǒng)計(jì)模型如下：

y=Wα+xβ+u+;u～MVNn(0,λτ-1K),～MVNn(0,τ-1In)

公式中，y代表表型值向量，W代表協(xié)變量(固定效應(yīng))的設(shè)計(jì)矩陣，包括第一列為1，α代表包括截距的相關(guān)系數(shù)向量，x代表標(biāo)記基因型向量，β代表標(biāo)記效應(yīng)，u代表隨機(jī)效應(yīng)向量，代表殘差向量，τ-1代表殘差的方差，λ代表兩個(gè)方差組分的比率，K代表由SNPs估計(jì)的中心親緣關(guān)系矩陣，In代表單位矩陣。MVNn代表n維多元正態(tài)分布。Wald檢驗(yàn)用于篩選與性狀相關(guān)SNP的標(biāo)準(zhǔn)。使用plink(V1.90b)軟件中的參數(shù)-indep-pairwise 25 5 0.2來推斷獨(dú)立檢驗(yàn)的有效SNP數(shù)量，最終推斷出有效獨(dú)立檢驗(yàn)SNP為6 950個(gè)。因此全基因組水平顯著閾值和全基因組水平潛在顯著閾值分別為7.19×10-6(0.05/6 950) 和1.44×10-4(1/6 950)。

1.5 RNA提取、質(zhì)控、文庫構(gòu)建和測序

采用氯仿法提取RNA，使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer，Aglient RNA 6000 Nano Kit檢測RNA的樣品濃度和完整性，提取的RNA樣品濃度≥1 000 ng·μL-1，RIN值≥8且28S∶18S≥1.2?？俁NA樣品檢測合格后，根據(jù)不同來源mRNA的特性進(jìn)行純化。真核生物mRNA 3′末端具有polyA尾結(jié)構(gòu)，選用帶有Oligo(dT)的磁珠進(jìn)行富集純化；原核生物mRNA不具有該特性，選用試劑盒去除rRNA以獲取更多有效信息。向純化得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段。再以片斷化后的RNA為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程，實(shí)現(xiàn)cDNA第一鏈合成，并加入2nd Strand Marking Buffer、2nd Strand/End Repair Enzyme Mix合成cDNA第二鏈。后經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，經(jīng)磁珠篩選回收目的片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成整個(gè)文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit3.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，使用Bio-RAD CFX96熒光定量PCR儀、Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN進(jìn)行q-PCR，對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>10 mol·L-1)，以保證文庫質(zhì)量。質(zhì)量合格的文庫用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測序。為了保證后續(xù)分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，對(duì)原始序列進(jìn)行過濾，去除接頭污染的Reads，低質(zhì)量的Reads(Reads中質(zhì)量值Q≤19的堿基占總堿基的50%以上)，去除含N比例大于5%的Reads后，得到高質(zhì)量的Clean Reads，再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.6 差異基因篩選及表達(dá)量分析

以A群體低受精率公雞為對(duì)照，以Fold change(FC)≥1.5、P-value<0.05且P-adj<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，兩組公雞睪丸組織中基因表達(dá)水平的差異以及差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過火山圖顯示，F(xiàn)PKM[13](Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)是利用RNA-seq技術(shù)定量估計(jì)基因表達(dá)值的一個(gè)非常有效的工具，即每百萬fragments(測序核酸片段，PE中一條fragments對(duì)應(yīng)兩條reads)中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目，其同時(shí)考慮了測序深度和基因長度對(duì)fragments計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。采用FPKM作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)，使用DESeq2軟件分析樣品間的差異表達(dá)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

cDNA反轉(zhuǎn)錄參照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑試劑盒(天根，北京)操作說明，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃凍存?zhèn)溆?，RT-qPCR以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI GenBank中雞THYN1、HMGCLL1、COA6基因和β-actin基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)。擴(kuò)增體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme) 10.0 μL,上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1)，cDNA模板2.0 μL，7.2 μL水補(bǔ)足20 μL體系。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用7500型熒光定量PCR儀(ABI，美國)對(duì)THYN1、HMGCLL1、COA6基因和β-actin進(jìn)行分析，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。采用比較Ct值法，即2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，使用SAS 9.1.3軟件對(duì)每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行雙尾非配對(duì)T檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 RT-qPCR所用基因的引物信息

2 結(jié) 果

2.1 遺傳力估計(jì)

使用ASREML v4.1軟件包構(gòu)建基于系譜信息的傳統(tǒng)動(dòng)物模型(A矩陣)，基于基因型信息構(gòu)建的GBLUP(G矩陣)，分別計(jì)算受精率的遺傳力。Wald F統(tǒng)計(jì)世代和批次的Wald顯著(P<0.01)?；贏群體5～9世代系譜和556個(gè)個(gè)體受精率表型值計(jì)算得遺傳力為0.21，基于G矩陣計(jì)算受精率遺傳力為0.14。

2.2 表型和基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控

A群體556個(gè)個(gè)體受精率表型最大值和最小值分別為0.96和0.28、平均值為0.84、變異系數(shù)為9%；孵化率表型最大值最小值分別為1.00和0.68、平均值為0.88、變異系數(shù)為7.1%；B群體398個(gè)個(gè)體受精率表型最大值和最小值分別為0.95和0.44、平均值為0.79、變異系數(shù)為9.9%；孵化率最大值和最小值分別為0.98和0.60、平均值為0.85、變異系數(shù)為7.9%。質(zhì)控條件：剔除個(gè)體基因型缺失率大于10%的個(gè)體、最小等位基因頻率小于5%、樣本檢出率小于90%的SNP。質(zhì)控后，A群體保留32 459個(gè)SNPs，平均標(biāo)記密度為31.7 kb/SNP(表2)；B群體保留38 150個(gè)SNPs用于后續(xù)分析，平均標(biāo)記密度為27.0 kb/SNP(表3)。

表2 質(zhì)控后SNPs標(biāo)記在A資源群體各染色體上的分布

表3 質(zhì)控后SNPs標(biāo)記在B資源群體各染色體上的分布

2.3 主成分分析

PCA分析中，主成分1為橫坐標(biāo)，主成分2為縱坐標(biāo)，以此做主成分散點(diǎn)圖，由圖1可知，兩資源群公雞各個(gè)世代沒有聚攏在一起，說明群體之間出現(xiàn)分層。在以往的全基因組關(guān)聯(lián)分析當(dāng)中，由于祖代或者父母代的遺傳差異導(dǎo)致的群體分層會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)假陽性[14]。利用全基因組標(biāo)記的遺傳信息對(duì)樣本遺傳相關(guān)進(jìn)行估計(jì)，比系譜信息更能真實(shí)的反映了個(gè)體間的相關(guān)度，可以通過估計(jì)個(gè)體間的遺傳相關(guān)來矯正群體結(jié)構(gòu)分層對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響，因此在關(guān)聯(lián)分析中可以使用主成分1作為協(xié)變量，以校正群體結(jié)構(gòu)對(duì)關(guān)聯(lián)分析的影響[15]。

a.A群體結(jié)構(gòu)主成分分析圖；b.B群體結(jié)構(gòu)主成分分析圖

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

受精率和孵化率的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(圖2)顯示，有9個(gè)位點(diǎn)與受精率顯著相關(guān)(P<1.01×10-4)，其中A群體556只個(gè)體的受精率篩選到4個(gè)顯著位點(diǎn)分別位于12號(hào)染色體的COPG1基因，11號(hào)染色體的ADAMTS18、CDH8基因，4號(hào)染色體的FABP2基因；B群體398只個(gè)體受精率篩選到4個(gè)顯著位點(diǎn)，分別位于20號(hào)染色體的SLCO4A1基因，9號(hào)染色體的ATP13A3基因，1號(hào)染色體的NELL2、VEZT基因；A、B兩群體基因型數(shù)據(jù)合并后，954只個(gè)體受精率篩選到1個(gè)顯著位點(diǎn)，位于5號(hào)染色體的IGHMBP2基因。B群體398只個(gè)體孵化率性狀篩選到3個(gè)顯著位點(diǎn)(P<4.57×10-8)，位于18號(hào)染色體的TMEM、SCO1、MYH1A基因。顯著SNPs信息見表4。

表4 受精率和孵化率達(dá)到5%基因組水平顯著的SNPs位點(diǎn)信息

a.A群體受精率GWAS分析QQ圖與曼哈頓圖；b.B群體受精率GWAS分析QQ圖與曼哈頓圖；c.B群體孵化率GWAS分析QQ圖與曼哈頓圖；d.A、B群體芯片數(shù)據(jù)合并后受精率GWAS分析QQ圖與曼哈頓圖

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序樣本表型和測序分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

受精率高組4個(gè)個(gè)體受精率表型最大值和最小值分別為0.97和0.93、平均值為0.95；睪丸重最大值為47.34 g、最小值為24.08 g、平均值為36.3 g；受精率低組4個(gè)個(gè)體受精率表型最大值和最小值分別為0.85和0.79、平均值為0.83；睪丸重最大值為35.9 g、最小值為16.13 g、平均值為26.4 g。轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果見表5。

表5 8個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.6 差異表達(dá)基因篩選和差異表達(dá)分析

以白羽肉雞受精率低組為對(duì)照組，以Fold change≥1.5、P-value<0.05且P-adj<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出差異表達(dá)基因17個(gè)，其中上調(diào)基因13個(gè)，下調(diào)基因4個(gè)。受精率高、低公雞睪丸組織中基因表達(dá)水平的差異通過FPKM來定量估計(jì)，對(duì)受精率高、低組的白羽肉雞差異基因進(jìn)行表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)低受精率組THYN1、TARBP1、ENSGALG00000036249、ENSGALG00000039805基因表達(dá)量較高，高受精率組HMGCLL1、COA6、ENSGALG00000033622基因表達(dá)量較高(圖3)。

a.差異表達(dá)基因火山圖；b.差異表達(dá)基因估計(jì)表達(dá)值圖。L.受精率低組；H.受精率高組，下同

2.7 高、低受精率公雞睪丸中HMGCLL1、COA6 mRNA的表達(dá)

從篩選出的差異表達(dá)基因中挑選HMGCLL1、COA6基因進(jìn)行熒光定量驗(yàn)證，結(jié)果顯示400日齡高受精率公雞睪丸中HMGCLL1 mRNA的表達(dá)是低受精率公雞的2.86倍，且差異顯著(P<0.05);并且高受精率公雞睪丸中COA6 mRNA的表達(dá)量是低受精率公雞的3倍，且差異顯著(P<0.05)(圖4)。

圖4 HMGCLL1和COA6 mRNA在高、低受精率公雞睪丸中表達(dá)

3 討 論

過去十年里，GWAS使用高通量的基因分型技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找SNPs，探討其與疾病以及復(fù)雜性狀的關(guān)系[16]。在人類GWAS的研究中，已經(jīng)鑒定出影響糖尿病、肥胖癥、乳腺癌在內(nèi)的幾十種疾病的基因位點(diǎn)[17]。畜禽GWAS的研究中，研究人員也將GWAS應(yīng)用在雞[18-20]、豬[21-22]、牛[23-24]等重要經(jīng)濟(jì)性狀上，與生長性能[25]、免疫[26]、產(chǎn)蛋[27]性能顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)和QTLs區(qū)域相繼被挖掘，而對(duì)肉雞孵化性狀的GWAS分析研究較少。

白羽肉雞在我國養(yǎng)禽業(yè)中占比高，其飼料轉(zhuǎn)化率高、蛋白質(zhì)含量高，是一種廣受市場歡迎的禽肉類。生長、繁殖性狀是肉雞養(yǎng)殖業(yè)兩大重要的經(jīng)濟(jì)性狀，由于生長性能和繁殖性能選育方向不同，導(dǎo)致肉雞在繁殖性狀中的選育還有很大空間。本研究采用系譜和基因組信息估計(jì)了白羽肉雞品系受精率性狀遺傳參數(shù)，受精率遺傳力為0.14～0.21，屬于低遺傳力性狀。本研究的ABLUP和GBLUP估計(jì)遺傳力的結(jié)果與純系蛋雞報(bào)道的結(jié)果(受精率遺傳力為0.16～0.33)基本一致。此外，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選與白羽肉雞受精率、孵化率相關(guān)的顯著SNPs位點(diǎn)，利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選白羽肉雞受精率高、低組睪丸組織中的差異表達(dá)基因，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程，挖掘白羽肉雞孵化性狀相關(guān)基因，揭示孵化性狀的遺傳基礎(chǔ)。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，A群體556只個(gè)體的受精率篩選到4個(gè)顯著基因，分別是位于12號(hào)染色體的COPG1基因、11號(hào)染色體的ADAMTS18、CDH8基因、4號(hào)染色體的FABP2基因；B群體398只個(gè)體受精率篩選到4個(gè)顯著基因，分別是位于20號(hào)染色體的SLCO4A1基因、9號(hào)染色體的ATP13A3基因、1號(hào)染色體的NELL2、VEZT基因；B群體398只個(gè)體孵化率篩選到3個(gè)顯著位點(diǎn)(P<4.57×10-8)，分別位于18號(hào)染色體的TMEM、SCO1、MYH1A基因； A、B兩群體芯片數(shù)據(jù)經(jīng)plink軟件合并后，954只個(gè)體受精率篩選到1個(gè)顯著位點(diǎn)，位于5號(hào)染色體的IGHMBP2基因。轉(zhuǎn)錄組測序篩選到HMGCLL1、COA6等差異基因。4號(hào)染色體上的FABP2基因與受精率顯著關(guān)聯(lián)，有研究發(fā)現(xiàn)血漿中FABP2水平與血清膽固醇、尿酸、肌酐水平成正相關(guān)、并與白蛋白、紅細(xì)胞和血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，這表明FABP2水平隨著糖尿病、腎病的嚴(yán)重程度而增加[28]，該基因可能是影響肉雞公雞孵化性狀的候選基因，同時(shí)鑒定出ADAMTS18、NELL2兩個(gè)基因與受精率存在顯著關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS18參與小鼠生殖道的發(fā)育，2周齡小鼠敲除ADAMTS18后，雄性ADAMTS18/-小鼠的表皮腺整個(gè)腺體顯著萎縮，7個(gè)月及以上的ADAMTS18/-小鼠的表皮腺體表面出現(xiàn)巨集觀腫脹，最后得出結(jié)論ADAMTS18缺乏導(dǎo)致雄性小鼠的預(yù)發(fā)性腺發(fā)育不良和纖維化[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，睪丸分泌蛋白(NELL2)通過ROS1途徑發(fā)出信號(hào)，以調(diào)節(jié)附睪蛋白酶成熟和隨后的附睪蛋白酶(OVCH2)分泌，該蛋白酶處理ADAM3以獲得精子受精能力，最終得出結(jié)論，睪丸-附睪精子(NELL2-ROS1-OVCH2-ADAM3)信號(hào)傳導(dǎo)是雄性生育力所必需的[30]。很多研究都證明以上基因和雄性生殖有關(guān)，但本研究篩選出的NELL2基因與受精率的關(guān)系鮮見報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究。轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的差異基因中，HMGCLL1、COA6調(diào)控雄性受精率的機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。THYN1基因?qū)儆诰€粒體黃體酶家族，催化α氧化過程和β氧化過程的脫氫步驟，這些步驟與脂肪酸β氧化有關(guān)。其可緩解脂肪沉積和脂質(zhì)代謝紊亂，從而顯著改善家禽的產(chǎn)卵率，證明THYN1與家禽的繁殖性能有關(guān)[31]。COL6A3基因會(huì)影響蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶7(Prmt7)在雄性生殖細(xì)胞中的表達(dá)，從而通過miRNA和目標(biāo)基因調(diào)節(jié)精子增殖[32]。PARD3B基因與肥胖相關(guān)疾病有關(guān)[33]，肥胖和糖尿病對(duì)雄性的精液品質(zhì)有負(fù)面影響，并與睪丸激素水平低有關(guān)[34]。精液品質(zhì)會(huì)影響到孵化性狀[9]，因此這些基因可能是影響孵化性狀的候選基因。

4 結(jié) 論

本研究以白羽肉雞為試驗(yàn)群體，基于系譜和基因型信息估計(jì)的受精率遺傳力分別為0.21和0.14。使用GWAS和RNA-seq技術(shù)分析了與白羽肉雞公雞孵化性狀相關(guān)的候選基因，GWAS篩選到12個(gè)SNPs位點(diǎn)與孵化性狀顯著相關(guān)，這些位點(diǎn)位于ADAMTS18、FABP2、NELL2等基因。RNA-seq技術(shù)鑒定到HMGCLL1、COA6、THYN1、COL6A3等差異表達(dá)基因，這些基因可能是影響白羽肉雞孵化性狀的候選基因。本試驗(yàn)結(jié)果為白羽肉雞后續(xù)基因功能、品種改良等研究奠定了基礎(chǔ)。