胡 俊，丁帥帥，魏述永

(西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

隨著動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性不斷加劇，一度因腎毒性及神經(jīng)毒性而使用受限的黏菌素重新引起重視，并被認(rèn)為是獸醫(yī)臨床控制多藥耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”。然而，近年來，可轉(zhuǎn)移黏菌素耐藥基因mcr的快速擴(kuò)散，使得黏菌素的防線意義面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。mcr是磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族編碼基因的成員，可在不同細(xì)菌和宿主物種間水平傳播并導(dǎo)致受體細(xì)菌低水平黏菌素耐藥，給公共衛(wèi)生安全帶來了潛在威脅[1-4]。

黏菌素是一種陽離子多肽類抗生素，具有親脂性脂肪酰側(cè)鏈，作用于許多革蘭陰性菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)中的脂質(zhì)A，其帶正電荷的α、γ-二氨基丁酸可與脂質(zhì)A的負(fù)電荷磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電作用，引起Ca2+、Mg2+等二價(jià)陽離子取代，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞質(zhì)滲漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。MCR蛋白與各種細(xì)菌中的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶有約60%的相似性，可由5個(gè)跨膜螺旋將自身錨定在細(xì)胞膜的周質(zhì)中，然后通過磷酸乙醇胺共價(jià)修飾脂多糖的脂質(zhì)A，導(dǎo)致脂質(zhì)A和黏菌素之間的親和力降低并耐藥[1,6]。

自2016年首次報(bào)道以來，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了mcr-1～mcr-10共10類43個(gè)mcr的突變體[7-9]，本文對其發(fā)現(xiàn)、流行規(guī)律、同源性、進(jìn)化分析、分子特征、陽性質(zhì)粒類型等研究進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 mcrs的發(fā)現(xiàn)及流行情況

1.1 mcrs的發(fā)現(xiàn)及宿主細(xì)菌

mcr-1[1]、mcr-1.3[10]、mcr-1.4[11]、mcr-1.5[12]、mcr-1.7[11]、mcr-1.8(直接提交到NCBI)，mcr-1.9[13]、mcr-1.11～mcr-1.13[14]首檢于大腸桿菌，其余突變體mcr-1.2[15]、mcr-1.6[16]和mcr-1.10[17]分別在肺炎克雷伯菌、沙門菌和莫拉菌中首次檢出。在已發(fā)現(xiàn)的mcr-3的11個(gè)突變體中，mcr-3[18]、mcr-3.2[19]、mcr-3.5[20]、mcr-3.11[21]和mcr-3.12[22]分別在大腸桿菌中首次檢出，mcr-3.3[23]、mcr-3.6～mcr-3.9[24]和mcr-3.10[25]分別在維氏氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌中首次檢出。其他mcrs的發(fā)現(xiàn)信息[26-43]如表1所示。

表1 mcrs的首檢信息

(續(xù)表1 Continued)

現(xiàn)已報(bào)道的mcrs的宿主細(xì)菌有20多種，多數(shù)屬于腸桿菌科(大腸桿菌、沙門菌、肺炎克雷伯菌等)、氣單胞菌科(維氏氣單胞菌、異常嗜糖氣單胞菌、中間氣單胞菌等)及莫拉菌科(莫拉菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等)。從檢出率、分布范圍及陽性mcr類型分析，腸桿菌科細(xì)菌是其最重要的宿主細(xì)菌。另外，多數(shù)宿主細(xì)菌在自然界中廣泛分布，且可達(dá)成mcr種間水平轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致該耐藥基因全球流行。需要注意的是，mcr宿主細(xì)菌包括一些臨床重要的人畜共患病原菌，這可能會(huì)給公共衛(wèi)生安全帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)。例如，莫拉菌已被證實(shí)為mcr基因的宿主細(xì)菌，其主要感染動(dòng)物，但也可以感染人類[28-29]。其他人畜共患的mcrs宿主細(xì)菌還包括大腸桿菌[28-29]、沙門菌[28-29]、嗜水氣單胞菌[29]、豚鼠氣單胞菌[24-25]等。mcr的宿主細(xì)菌[44-83]見表2。

表2 mcr基因的宿主細(xì)菌

1.2 mcrs流行規(guī)律及影響因素

mcrs已在全世界50多個(gè)國家廣泛傳播，并覆蓋除南極洲以外的所有大陸。根據(jù)PubMed、Google scholar以mcr作為關(guān)鍵詞的檢索結(jié)果，篩選出相關(guān)研究論文發(fā)表數(shù)量最高的10個(gè)國家及其主要流行的mcrs突變體類型，如表3所示。

表3 mcr檢出率最高的國家及其流行的突變體種類

在mcrs中，mcr-1的檢出率最高、突變體最多，mcr-9也在六大洲廣泛分布，并與mcr-1共同成為全球傳播的黏菌素耐藥決定因素[96]。mcr-3和mcr-5也是廣泛傳播的mcr基因，而其他mcr家族基因分布在較小的區(qū)域(mcr-4、mcr-2、mcr-8)或分散分布(mcr-7)。到目前為止，只在英國發(fā)現(xiàn)過一例關(guān)于mcr-6基因的報(bào)道。就區(qū)域來看，亞洲是報(bào)道m(xù)cr最多的大洲。同樣，歐洲和美洲——如西班牙、意大利、德國、美國、巴西和阿根廷等相關(guān)報(bào)道也在增加[97]。

mcr的快速傳播歸因于其通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子水平轉(zhuǎn)移的能力，低濃度黏菌素的持續(xù)壓力加速了這種傳播[97]，而這種壓力來源于獸醫(yī)治療或預(yù)防感染中使用的以及飼料中添加的黏菌素[98]。此外，mcr的廣泛傳播也與跨國旅行、世界貿(mào)易、食物鏈控制或預(yù)防不足等相關(guān)，并可能增加mcr的人畜共患傳播風(fēng)險(xiǎn)[99-100]。

2 mcrs同源性及進(jìn)化關(guān)系

2.1 相似性

同類mcr突變體間的相似性十分相近。以mcr-1為例，除了mcr-1.10之外，mcr-1及其大多數(shù)突變體間只有1～2個(gè)核苷酸突變。然而，mcr-1.10與mcr-1之間存在較大的差異，包括36個(gè)核苷酸突變引起的7個(gè)氨基酸替換，其中，3個(gè)氨基酸變化發(fā)生在N端蛋白區(qū)域，mcr-1與mcr-1.10之間的蛋白相似性為98.7%[17](表4)。但MCR間相似度差異較大，除MCR-2與MCR-1 (80%)、MCR-7與MCR-3(70%)、MCR-9與MCR-8(65%)、MCR-10和MCR-9(82.93%)相似性較高外，其余MCR間的相似性僅為40%左右，甚至更低?？梢婋m然具有相近的催化活性并導(dǎo)致黏菌素耐藥，但MCR間相似性差異較大，這可能與其不同的菌種起源有關(guān)。

表4 mcr基因的序列差異

2.2 進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，MCR-1和MCR-2可能起源于莫拉菌，其序列與卡他莫拉菌染色體基因編碼的mcr樣蛋白的氨基酸相似性分別為59%和60%[29]。通過僅在殺鮭氣單胞菌中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子TnAs2的分析，腸桿菌科細(xì)菌的mcr-3基因可能起源于氣單胞菌[18]。mcr-4家族可能起源于冷海希瓦菌，由質(zhì)粒攜帶的mcr-4.3與冷海希瓦菌NCIMB 400的染色體DNA片段(約1.7 kb)100%匹配(登錄號: CP000447)[101]。MCR-5.1及其變異體MCR-5.2與MCR-3和MCR-4家族有共同的祖先[79]。MCR-6可能起源于莫拉菌。MCR-7.1與MCR-3和MCR-3樣序列具有相近的遺傳距離，同樣來源于氣單胞菌。MCR-8的起源仍不清楚[83]。MCR-9和MCR-10蛋白共同起源于一個(gè)尚未確定的物種，與已知的布丘菌密切相關(guān)[43]。

(續(xù)表4 Continued)

3 MCR的分子特征

3.1 MCR蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)

所有預(yù)測的MCR-1～MCR-10的結(jié)構(gòu)均具有兩個(gè)高度保守的EptA結(jié)構(gòu)域：一個(gè)N端含有5個(gè)跨膜α-螺旋的膜錨定結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)C端可溶性催化結(jié)構(gòu)域[42-43]。三維模型顯示，MCR-1～MCR-10膜錨定結(jié)構(gòu)域和可溶性催化域具有高度的保守性[43]。MCR的關(guān)鍵殘基可能對LptA和EptC的催化活性很重要[1]，這些結(jié)構(gòu)域可以錨定MCR并完成細(xì)胞膜質(zhì)周表面脂質(zhì)A的共價(jià)修飾[6]。此外，MCR-1和MCR-2的跨膜和催化結(jié)構(gòu)域是可互換的，但MCR-1和MCR-4的跨膜和催化結(jié)構(gòu)域在功能上是不可互換的。交換MCR-4和MCR-1或MCR-3的跨膜結(jié)構(gòu)域可使酶失活，并且不能賦予敏感大腸桿菌黏菌素耐藥性[101]。

3.2 MCRs的催化活性

底物和金屬原子是MCR維持其催化活性所必需的，半胱氨酸形成的二硫鍵對催化結(jié)構(gòu)域起到了穩(wěn)定作用[102]。MCR-1活性維持的必需殘基(Glu246、His395和磷酸化位點(diǎn)Thr285)及重要?dú)埢?Lys333、Glu468和His478)在MCR-2中是嚴(yán)格保守的[103]。MCR-1的催化結(jié)構(gòu)域Thr285和MCR-3的催化結(jié)構(gòu)域Thr277在介導(dǎo)黏菌素抗性中發(fā)揮了重要作用。在MCR-1將PEA轉(zhuǎn)移到脂類A的過程中，催化結(jié)構(gòu)域的保守殘基Thr285被認(rèn)為是PEA基團(tuán)的受體，而在MCR-3中，Thr277起到親核基團(tuán)的作用，是負(fù)責(zé)催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸[102]。

在許多MCR中，類似鋅結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域具有明顯的進(jìn)化保守性且對酶的功能非常重要[68,104-106]。Zn2+在MCR-1和MCR-2中均與Glu246、Thr285和Asp465進(jìn)行四面體幾何配位[107]，并與MCR-3中的Glu238、Thr277、Asp450和His451結(jié)合形成四面體配位結(jié)構(gòu)[105]。而在MCR-4中，單個(gè)鋅原子與E240、T278、H377、D452和H453結(jié)合，五個(gè)鋅結(jié)合殘基中的任何一個(gè)突變都完全使MCR-4失去功能[101]。與MCR-1相比，MCR-5.3的鋅離子和殘基更加保守且親和性更高[37]。

4 mcrs遺傳背景

4.1 可移動(dòng)元件

插入序列、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements，MGEs)在mcrs傳播中起著至關(guān)重要的作用[13]。例如：ISApl1(IS30家族的一個(gè)插入序列(insertion sequence，IS)對于mcr-1水平轉(zhuǎn)移具有重要意義[108]。然而，mcr-1的傳播并非必定與ISApl1有關(guān)，mcr-1.9基因可以在mcr-pap2元件中的上游IS26元件缺失的情況下轉(zhuǎn)移，以及沒有ISApl1或只有一個(gè)拷貝的情況水平轉(zhuǎn)移，且ISApl1對于mcr-1在質(zhì)粒上的穩(wěn)定性是非必須的[109-110]。此外，在mcr-3陽性質(zhì)粒上游發(fā)現(xiàn)了缺失的ISKpn40，mcr-3與ISKpn40的結(jié)合可能促進(jìn)了它的易位[21]。mcr-8的傳播與IS元件IS903B和ISEcl1相關(guān)，IS903B的2個(gè)完整的ISs位于pkp91中mcr-8的上游或下游，而在WCHKP1845中，起源于陰溝腸桿菌的ISEcl1存在于mcr-8的下游[39]。

Tn3家族參與了mcr-3和mcr-5的水平轉(zhuǎn)移。在mcr-3陽性大腸桿菌質(zhì)粒pWJ1中， Tn3家族轉(zhuǎn)座子TnAs2位于mcr-3的上游[18]。在銅綠假單胞菌MRSN 12280的染色體中，mcr-5基因嵌入在一個(gè)具有38 bp反向重復(fù)序列的Tn3家族轉(zhuǎn)座子中，插入后產(chǎn)生一個(gè)5 bp的靶位點(diǎn)重復(fù)(TCCAT)[78]。同樣，mcr-5.2插入到一個(gè)ColE質(zhì)粒的Tn3家族轉(zhuǎn)座子中而水平轉(zhuǎn)移[36]。

4.2 陽性質(zhì)粒

14種質(zhì)粒與mcr-1的傳播有關(guān)，包括IncI2[27,111-112]、IncX4[93,113-114]、IncHI2[44, 52, 88]、IncHI1[115]、IncP[11]、IncF[116]、IncFI[55]、IncFⅡ[94]、IncY[117]、IncK2[118]、IncN[119]和IncFIB[120]等，見圖1。驅(qū)動(dòng)mcr-1傳播的三種主要質(zhì)粒是IncI2、IncX4和IncHI2[1,121-123]，它們是mcr-1陽性質(zhì)粒的主要類別[123]。mcr-1陽性IncX4質(zhì)粒比IncI2和IncHI2質(zhì)粒具有更廣泛的傳播能力。mcr-1陽性的IncI2和IncHI2質(zhì)粒的傳播是區(qū)域性的。對來自7個(gè)不同物種腸桿菌科的219個(gè)攜帶mcr-1的質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示75%的IncHI2質(zhì)粒來自歐洲，65.8%的IncI2質(zhì)粒來自亞洲[123]。IncI2質(zhì)粒攜帶的mcrs有mcr-1[116]、mcr-1.3[10]、mcr-1.5[12]、mcr-1.7[11]、mcr-1.11[60]、mcr-3.10[25]、mcr-7.1[38]，IncX4質(zhì)粒攜帶的有mcr-1[93]、mcr-1.2[89]、mcr-1.4[11]、mcr-1.9[13]、mcr-1.14和mcr-2[11]。而mcr-4、mcr-5及其突變體主要在較寬的寄主范圍內(nèi)檢測到，多拷貝的ColE小型質(zhì)粒。不同于大多數(shù)mcr-1陽性的窄宿主范圍質(zhì)粒，如IncI2和IncX4，mcr-3陽性質(zhì)粒IncP-1是在各種環(huán)境中被鑒定的寬宿主范圍質(zhì)粒，這可能是導(dǎo)致mcr-3比mcr-1傳播更廣泛的原因[124]。

IncI2：mcr-1[27, 111]，mcr-1.3[10]， mcr-1.5[12, 61]，mcr-1.7[11]，mcr-1.9[85]，mcr-1.11[60]，mcr-3.10[25]，mcr-7.1[38]；IncX4：mcr-1[93]，mcr-1.2[89]，mcr-1.4[11]，mcr-2[11]，mcr-1.9[13]；IncHI2：mcr-3[18]，mcr-3.2[19]，mcr-1[107]，mcr-9[42]；IncHI1：mcr-1[107]，mcr-1.5[128]；IncP：mcr-1.6[16]，mcr-3.5[20]，mcr-1[107]，mcr-3.11[21]，mcr-3[68]；IncF：mcr-1[107]，mcr-3[129]；IncFI：mcr-1[107]，mcr-8.2[40]；IncFⅡ：mcr-1[107]，mcr-8[39]，mcr-8.4[41]，mcr-3[130]；ColE：mcr-5[35]，mcr-5.2[36]，mcr-4.3[33]，mcr-4[31]，mcr-4.2[74]，mcr-4.4[131]；IncR：mcr-8.2[40]；IncA/C2：mcr-3.12[22]，mcr-3[76]；IncY：mcr-1[118]；IncK2：mcr-1[119]；IncFIB：mcr-1[121]；IncN：mcr-1[132]，mcr-3.19[132]；IncFIA：mcr-10[43]

就流行性而言，除流行區(qū)域與宿主范圍外，mcr陽性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率和穩(wěn)定性也是需要考慮的因素。例如，IncX4質(zhì)粒較IncI2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率更快，IncX4質(zhì)粒中還具有保守的TA樣穩(wěn)定位點(diǎn)TsxAB，該位點(diǎn)在轉(zhuǎn)移抗生素耐藥基因和質(zhì)粒穩(wěn)定性中起重要作用，而IncHI2質(zhì)粒是遺傳上最易變的，它擁有一個(gè)由抗性相關(guān)基因組成的多藥耐藥區(qū)域。另外需要指出的是，一些mcr基因(mcr-1.10、mcr-2.2、mcr-3.3等)是染色體編碼的，較質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，但不能水平傳播。

5 展 望

mcrs的全球傳播已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，并采取了眾多措施防止因其擴(kuò)散而引起的黏菌素耐藥性的傳播。例如，在中國，從2017年4月1日起，禁止使用黏菌素作為動(dòng)物促生長劑，致使硫酸黏菌素預(yù)混料的產(chǎn)量從2015年的27 170 t下降到2018年的2 497 t，硫酸黏菌素預(yù)混料的銷售額也從7 150萬美元下降到800萬美元[125]。此外，美國的食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)、加拿大的公共衛(wèi)生局(Public Health Agency，PHA)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)、英國相關(guān)部門也采取了相應(yīng)的措施限制黏菌素的濫用。在歐盟，2011—2018年，多黏菌素銷售額下降了54%[126]。

mcrs的研究方興未艾，然而，在這些研究中仍然存在一些問題。黏菌素敏感性的體外試驗(yàn)結(jié)果可能受到細(xì)菌種群中的低敏感亞群(異抗性)[127]和LPS結(jié)構(gòu)(O抗原)的差異[128]的影響。此外，黏菌素是一種較大的陽離子，在瓊脂上的擴(kuò)散受限，且其可以黏附在普通的塑料實(shí)驗(yàn)室器皿上[129]，因此常規(guī)的藥物敏感性測試方法，如瓊脂擴(kuò)散法和Etest試紙條，現(xiàn)在被認(rèn)為是不可靠的，導(dǎo)致數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性較低[130]，一些以前報(bào)道的數(shù)據(jù)可能需要重新評估。因此，臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)建議在陽離子調(diào)整的MH肉湯中進(jìn)行肉湯微量稀釋用于黏菌素敏感性試驗(yàn)[131]。另一方面，mcr抗性基因的命名存在一定混亂。保存在國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫合作組織(International Nucleotide Sequence Database Collaboration，INSDC)數(shù)據(jù)庫中的一些新的突變體序列可能會(huì)被給予“保留至發(fā)表”(hold-until publication，HUP)的狀態(tài)，直到相關(guān)手稿被接受。這意味著，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)潛在的新突變體的研究人員可能不知道所有其他已被識別但尚未公開可用的突變體。為了避免混淆，在提交序列和/或新mcr突變體手稿之前，鼓勵(lì)該領(lǐng)域的作者將新序列提交給INSDC，并通過NCBI(pd-help@ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行mcr突變體編號的分配和注冊。如果收到描述可能歸屬于新亞群的相關(guān)基因的手稿，期刊也應(yīng)該推薦并發(fā)起討論[130]。