馮肖藝，徐 茜，張 航，楊柏高，張培培，郝海生，杜衛(wèi)華，朱化彬，崔 凱，趙學(xué)明*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266000)

牛體外胚胎冷凍保存技術(shù)是體外胚胎生產(chǎn)體系的重要組成部分，是提高牛的繁殖能力[1]和保護瀕危牛品種的重要手段[2-4]，并且該技術(shù)已成為牛繁殖管理的必要條件[5-6]。目前，每年移植的凍融牛胚胎約占胚胎移植總數(shù)的60%，這表明胚胎冷凍技術(shù)已占據(jù)牛胚胎移植生產(chǎn)的重要地位[5]。此外，體外胚胎冷凍保存技術(shù)打破了時間和空間的限制，為國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)種源交流提供了條件，使其在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[7]。如今，體外胚胎生產(chǎn)(invitroproduction，IVP)、冷凍保存和移植已成為家畜生產(chǎn)繁育的常規(guī)程序[8]。由此可見，體外胚胎冷凍保存技術(shù)在牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有重要的應(yīng)用價值。

雖然體外胚胎冷凍技術(shù)已成功應(yīng)用于家畜生產(chǎn)和種質(zhì)資源保護，但體外胚胎在冷凍后的存活率和移植妊娠率始終低于體內(nèi)胚胎[1,5,9-10]。2017年，牛體外胚胎移植的數(shù)量首次超過了體內(nèi)胚胎移植數(shù)量[5,11]，但在過去的五年中約80%是新鮮體外胚胎，體外凍融胚胎比例較低[4]。2018年，體外凍融胚胎移植比例進一步下降(33.9%vs.26.8%)[12]。研究表明，體外胚胎對低溫冷凍保存敏感，這不僅與其電子密度高、能量基質(zhì)代謝過度和熱敏感性高有關(guān)[10]，還與其微絨毛稀疏、脂質(zhì)代謝異常[11]以及液泡多導(dǎo)致細胞間緊密程度較低、通訊減少[11-13]等特征有關(guān)[11]。此外，與體內(nèi)胚胎相比，體外胚胎改變了與代謝和生長相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本表達[14]。因此，本文簡要闡述了體外胚胎冷凍保存方法的研究進展，分析了目前體外胚胎冷凍保存過程中存在的問題，總結(jié)了有效提高體外胚胎冷凍效率的一些方法措施，以期為提高牛體外胚胎冷凍保存效率提供參考。

1 體外胚胎冷凍保存方法的研究進展

牛體外胚胎冷凍保存有兩種常用方法：常規(guī)冷凍和玻璃化冷凍。這兩種方法在胚胎移植后妊娠率相似[15]，二者各有利弊[4]。目前，玻璃化冷凍比常規(guī)冷凍的應(yīng)用更為廣泛[4]。

1.1 常規(guī)冷凍

常規(guī)冷凍使用可編程的冷凍設(shè)備控制溫度，使溫度以可控的速度逐漸降低，進行胚胎冷凍保存[15-16]，同時使用甘油、乙二醇等低毒性的冷凍保護劑[6]降低冷凍損傷。此外，常規(guī)冷凍保存的胚胎在解凍后可以直接移植，降低生產(chǎn)條件需求，大大節(jié)省胚胎移植時間成本[6,17-18]。許多企業(yè)在冷凍牛胚胎時，仍然傾向于常規(guī)冷凍而不是玻璃化冷凍，一方面是該方法對操作人員的技術(shù)要求不高，另一方面是有研究報道常規(guī)冷凍具有更高的胚胎存活率[16]。

然而，常規(guī)冷凍需要使用昂貴的設(shè)備且過程耗時[6]，常規(guī)冷凍過程中還會產(chǎn)生冰晶[4]，導(dǎo)致細胞受到機械損傷[15]，以及引起其他損傷，包括脂質(zhì)過氧化[15]、線粒體變性增加、核膜質(zhì)膜完整性被破壞、透明帶厚度變薄并斷裂、細胞器解體和細胞骨架損傷等[17]，從而導(dǎo)致胚胎各項指標降低[6,15]，誘導(dǎo)胚胎發(fā)生凋亡[15-16]。此外，與未冷凍的胚胎相比，常規(guī)冷凍胚胎的孵化率、存活率顯著降低，如表1所示，這表明常規(guī)冷凍不利于牛體外胚胎的保存，導(dǎo)致體外胚胎常規(guī)冷凍技術(shù)的應(yīng)用受限[19]。

1.2 玻璃化冷凍

玻璃化冷凍是一種經(jīng)濟、快速、能夠替代常規(guī)冷凍的保存方法[4,19-22]。與常規(guī)冷凍相比，玻璃化冷凍不需要昂貴的儀器設(shè)備，冷凍所需時間大大縮短[4,16-17,19,23]。此外，玻璃化冷凍使用的冷凍液和冷凍保護劑適用于低溫耐受性極低的胚胎[24]，其冷卻速率高，能夠?qū)⑴咛タ焖俨ＡЩ粫纬杀?，降低胚胎機械冷凍損傷[6,15-16,18,25]，增強體外胚胎的存活能力[15]。大量研究證實，牛體外胚胎玻璃化冷凍比常規(guī)冷凍具有更高的囊胚率、孵化率和存活率等[6,9,15-16,19,22]，如表1所示。研究表明，玻璃化冷凍激活胚胎自身短期保護機制[15]，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠上調(diào)HSPA5和TBA8基因，下調(diào)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)基因和上調(diào)細胞存活相關(guān)基因，這是胚胎抵抗低溫損傷和促進胚胎存活的潛在機制，因此，玻璃化冷凍胚胎凍后存活率更高[15]。

表1 牛體外胚胎玻璃化冷凍和常規(guī)冷凍的發(fā)育能力

然而，玻璃化冷凍時往往使用高濃度的低溫冷凍保護劑，其具有高滲透性和毒性作用，使得胚胎遭受毒性損傷[6,9,18,26]，導(dǎo)致胚胎滲透性休克[15-16,26]，胚胎存活率降低[6,16]。此外，玻璃化冷凍胚胎在移植前要在加熱溶液中重新膨脹，這導(dǎo)致移植過程非常耗時[16]。盡管玻璃化冷凍胚胎具有較高的存活率，但這并不能提高解凍后胚胎在移植到受體牛體內(nèi)后的存活率[15]。目前，玻璃化冷凍過程需改善的主要是在解凍過程中防止結(jié)晶、減少升溫時對胚胎的不良影響[21]和減少高濃度的低溫冷凍保護劑對胚胎造成的損傷[26]，以提高解凍速率、胚胎的質(zhì)量和胚胎的耐低溫性，增加可移植胚胎的數(shù)量[4]。

2 體外胚胎冷凍存在的問題

2.1 脂質(zhì)含量高

在細胞中，脂質(zhì)起著構(gòu)成結(jié)構(gòu)膜成分的關(guān)鍵作用，其充當信號分子，并促進能量儲存，是影響細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細胞之間相互作用的關(guān)鍵因素[27]。與體內(nèi)胚胎相比，體外胚胎脂質(zhì)含量較高[13,28-34]，體外胚胎脂質(zhì)含量高使其對低溫保存更加敏感，這降低了體外胚胎的冷凍效率[35-36]。研究顯示，至少有4類脂質(zhì)影響冷凍保存后胚胎的存活率，包括甘油三酯、游離脂肪酸、膽固醇和磷脂等[28]。

研究表明，導(dǎo)致牛體外胚胎脂質(zhì)含量增加的原因主要是血清和氧化應(yīng)激。在血清存在的情況下，卵母細胞體外成熟過程中脂質(zhì)含量會增加，但線粒體數(shù)量沒有相應(yīng)的增加，這表明低效率的脂質(zhì)代謝引起卵母細胞中的脂質(zhì)積累[7]。同時，血清濃度影響著牛體外胚胎細胞質(zhì)中脂滴的數(shù)量和形狀[10,13]。此外，在體外培養(yǎng)條件下，線粒體功能出現(xiàn)障礙，其通過β-氧化和電子傳遞鏈影響脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致體外胚胎脂質(zhì)含量升高[10,15]。

2.2 活性氧水平高

線粒體在β-氧化合成三磷酸腺苷時涉及電子傳遞鏈，電子會丟失與O2結(jié)合，導(dǎo)致產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[37-38]。同時，細胞體外成熟(invitromaturation，IVM)時的氧張力也會導(dǎo)致ROS水平升高[37]。影響線粒體中ROS產(chǎn)生的因素還包括組織和細胞類型、代謝中間體和底物的存在、高比例NADH電子供體的存在、細胞外環(huán)境的氧張力、線粒體膜電位以及pH梯度[39]。正常情況下，細胞中的ROS有利于組織再生、細胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)和胚胎發(fā)生[37]，并且能夠在低濃度下調(diào)節(jié)細胞存活，在超生理水平下調(diào)節(jié)細胞死亡[39]。

然而，活性氧水平過高會降低體外胚胎的發(fā)育能力和耐低溫性，從而降低體外胚胎冷凍效率[4]。ROS濃度的增加會從穩(wěn)定的分子(例如DNA)中隔離電子[40]，過量的ROS會氧化細胞分子，改變其功能，并通過脂質(zhì)過氧化和DNA、蛋白質(zhì)、線粒體損傷以及細胞凋亡來損害細胞功能和活力[37,39-44]，導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[38]。此外，ROS以時間依賴性的方式在卵母細胞和胚胎中積累[8,38]，當ROS產(chǎn)生和積累與細胞的抗氧化機制之間失去平衡時會發(fā)生氧化應(yīng)激[15,40]。氧化應(yīng)激由抗氧化系統(tǒng)失控引起[43]，對卵母細胞、胚胎發(fā)育等生殖過程不利[39-41,45-46]，會引起細胞內(nèi)氧化還原電位失衡[41]、細胞信號傳導(dǎo)改變[39]、細胞衰老[38]和凋亡[39]。

2.3 細胞骨架損傷

微管和微絲是哺乳動物細胞骨架的主要成分，為染色體運動和細胞分裂提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[47]。卵母細胞中微管系統(tǒng)的缺陷可導(dǎo)致染色體的丟失，增加成非整倍體以及受精后胚胎發(fā)育異常[47]。細胞骨架具有協(xié)調(diào)細胞器重排、為受精做準備的功能，其中，微管和微絲不僅可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布，還參與調(diào)節(jié)卵母細胞Ca2+振蕩[48]。然而，細胞骨架常常在冷凍保存過程中受損，冷凍保存過程中細胞形狀和收縮變化會導(dǎo)致細胞骨架破裂，并且會導(dǎo)致細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化[49]。此外，冷凍保存還會導(dǎo)致GV期卵母細胞紡錘體缺陷，影響細胞解凍后體外成熟期間減數(shù)分裂時染色體的分離[49]。

牛體外胚胎膜的穩(wěn)定性也是影響其冷凍敏感性的一個因素[50]。磷脂是細胞膜中最豐富的脂質(zhì)，決定了細胞膜大部分的理化性質(zhì)，如流動性、滲透性和熱相行為[30]。體外胚胎產(chǎn)生的乳酸是體內(nèi)的兩倍，大量的乳酸引起細胞內(nèi)pH和胚胎膜的變化，導(dǎo)致胚胎變得更加脆弱，易受低溫損傷[31]。體外胚胎冷凍后磷脂含量降低，導(dǎo)致體外胚胎低溫敏感性較高和質(zhì)量較差[30]。此外，冷凍過程中內(nèi)部冰晶的形成和滲透壓沖擊也是冷凍時破壞細胞質(zhì)膜和胞內(nèi)膜的主要原因[17,21,26]。

2.4 線粒體損傷

線粒體的數(shù)量和質(zhì)量是體外胚胎成功發(fā)育的決定性因素[51]。細胞中的線粒體參與維持多個生物化學(xué)過程，涉及降解、生物合成、融合和分裂[46]，其重要功能是通過β-氧化途徑合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)[37-38]。在細胞周期的關(guān)鍵時期，線粒體向高能量消耗區(qū)域的運動對于胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此，線粒體在細胞質(zhì)的分布模式與胚胎的質(zhì)量和發(fā)育能力有關(guān)，是卵母細胞胞質(zhì)成熟的必要特征[37]。

然而，體外胚胎冷凍后會破壞質(zhì)膜完整性、導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張[16]、滋養(yǎng)層細胞微絨毛數(shù)量減少和線粒體發(fā)生改變等[10,25-26]。冷凍保存對線粒體造成的損傷包括線粒體腫脹[46]、線粒體質(zhì)膜功能受損、基質(zhì)電子密度低[16]和線粒體嵴改變[16]，并且還損害了線粒體的功能[51]和DNA完整性，導(dǎo)致解凍后線粒體數(shù)量減少[46]，ATP含量顯著降低[46]，最終導(dǎo)致體外胚胎解凍后存活率降低[16,46]。此外，胚胎冷凍后，其營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用普遍減少，與應(yīng)對氧化應(yīng)激的線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白活性降低相一致[26]。同時，玻璃化冷凍還改變了胚胎的糖酵解過程，且無法進行補償[26]。

2.5 透明帶損傷

體外胚胎透明帶(zonal pellucida，ZP)對酶的敏感性較高也是影響其低溫敏感性的一個因素[31,52]。受精后透明帶孔的功能是運輸、擴散營養(yǎng)物質(zhì)和病理控制，因此，透明帶可以增強或限制胚胎的生長和發(fā)育[53]。體外胚胎透明帶的特性與其解凍后的生存能力直接相關(guān)[53]。ZP起到屏障的作用，在處理病原體時是積極的，但是當營養(yǎng)供應(yīng)來自外部時，ZP對于胚胎是有害的，特別是對冷凍胚胎[53]。冷凍保存過程中會對體外胚胎透明帶造成損傷，從而對牛胚胎進一步的發(fā)育能力造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[53]。

3 改善體外胚胎冷凍效率的研究

如今，體外胚胎冷凍保存技術(shù)仍存在著諸多問題，因此需要開發(fā)高效的冷凍方法[5]，以最大限度地提高解凍后胚胎的存活率[7]、周轉(zhuǎn)率和利用率[4]，增加國內(nèi)外商業(yè)貿(mào)易機會[4]。牛體外胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)不僅是大規(guī)模生產(chǎn)胚胎[3]和進行基因改良的必要條件，還是影響體外胚胎低溫存活的重要因素[4,31]。因此，優(yōu)化培養(yǎng)條件可以顯著提高體外卵母細胞質(zhì)量和體外胚胎質(zhì)量[10]、增加胚胎產(chǎn)量、增強胚胎對低溫的抵抗力[10]，并且不會影響冷凍后胚胎的生存能力[4]。目前，通過不斷完善，培養(yǎng)系統(tǒng)得到了改進[10]，添加各物質(zhì)對牛體外胚胎冷凍后發(fā)育能力的影響見表2。

表2 不同物質(zhì)對牛體外胚胎發(fā)育能力的影響

3.1 去 脂

去脂能夠降低胚胎內(nèi)脂質(zhì)含量，促進胚胎正常發(fā)育[32]，可以提高體外胚胎低溫耐受性[32,53]和胚胎冷凍保存后的發(fā)育速度，增加胚胎細胞總數(shù)[27]。目前，已成功應(yīng)用顯微操作去脂[8]和化學(xué)去脂[27]等技術(shù)取得了良好效果。

3.1.1 顯微操作去脂 從牛體外胚胎中顯微操作去除胞質(zhì)內(nèi)部分脂質(zhì)，結(jié)果表明去脂組存活率(56.2%vs. 39.8%)、囊胚率(42.1%vs. 39.9%)、孵化率(45.2%vs. 22.4%)和妊娠率(22.2%vs. 10.5%)都顯著高于對照組[32]。由此可見，胚胎去脂后有利于其發(fā)育[32]。研究表明，去脂還能夠提高囊胚階段的低溫耐受性[32]。然而，顯微操作后透明帶會受到損害，這大大增加了病原體傳播的風(fēng)險[8]。

激光微束穿透胚胎透明帶的激光輔助孵化(laser-assisted hatching，LAH)技術(shù)也可去脂，桑椹胚期LAH和離心后LAH的總細胞數(shù)和活細胞數(shù)均高于對照組(總細胞數(shù)分別為69.4、69.3、53.0；活細胞數(shù)分別為56.4、54.7、39.3)[29]。研究表明，通過離心結(jié)合LAH使脂質(zhì)極化明顯有利于卵裂球存活和胚胎發(fā)育，有效提高冷凍保存胚胎的存活率[29]。

3.1.2 化學(xué)去脂 大量研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加左旋肉堿、吩嗪乙基硫酸鹽、亞油酸、共軛亞油酸等化學(xué)物質(zhì)可以有效降低細胞脂質(zhì)含量[55]，增強脂質(zhì)代謝，提高體外胚胎的耐低溫性[28]和冷凍后存活率[36,56-60]。

左旋肉堿是一種脂質(zhì)代謝增強劑[21]，在脂質(zhì)代謝中作為β-氧化輔助因子負責將脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)運輸?shù)骄€粒體生成三磷酸腺苷(ATP)，促進脂質(zhì)代謝過程[28,42]。左旋肉堿在不影響胚胎發(fā)育的情況下，顯示了脂質(zhì)調(diào)節(jié)活性[28]，促進脂質(zhì)代謝[8]，降低胚胎內(nèi)脂質(zhì)含量[8,21,28,54-55]，從而提高體外胚胎的耐低溫性[4,28,55]。研究表明，添加左旋肉堿培養(yǎng)的胚胎脂質(zhì)含量降低(214.78 AFUvs. 266.43 AFU)，冷凍后存活率提高(72.32%vs. 42.02%)[54]。同時，添加代謝調(diào)節(jié)劑組合左旋肉堿、輔酶Q和毛喉素也減少了胚胎中脂質(zhì)的積累(23.79 AFUvs. 33.41 AFU)[54]。此外，吩嗪乙基硫酸鹽(phenazine ethosulfate，PES)具有的代謝調(diào)節(jié)作用，可以氧化還原型輔酶Ⅱ(NADPH)為NADP+，抑制了脂肪酸合成，有利于磷酸戊糖途徑[10]。培養(yǎng)基中添加PES有效降低了胚胎脂質(zhì)含量[10,20]，提高了冷凍胚胎的存活率(91.9%vs. 84.9%)[20]。

Accorsi等[36]在培養(yǎng)基中添加亞油酸，結(jié)果有效降低了胚胎脂質(zhì)含量，提高了胚胎存活率(71.7%vs. 50.0%)[36]。此外，共軛亞油酸在不影響胚胎發(fā)育的情況下，顯示出了脂質(zhì)調(diào)節(jié)活性，降低了編碼蛋白脂肪酶基因的表達和脂質(zhì)含量[28]。Stoecklein等[56]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)期間添加成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF2)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)和胰島素樣生長因子1 (insulin like growth factor 1，IGF1)，合稱為 FLI，降低了胚胎的脂質(zhì)含量，改善了牛體外胚胎植入前的發(fā)育[56]。Valente等[60]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉和表皮生長因子，顯著降低了細胞內(nèi)脂質(zhì)含量，顯著提高了卵裂率、囊胚率和孵化率，從而提高了胚胎的低溫耐受性[57,60]。

3.2 抗氧化劑

體外培養(yǎng)系統(tǒng)會影響卵母細胞和胚胎的形態(tài)及生理[4,31]。因此，對體外培養(yǎng)基進行優(yōu)化，可以提高胚胎質(zhì)量及其抗低溫的能力[18-19,31,58-59]。大量研究表明，添加抗氧化劑可以有效提高體外胚胎冷凍效率[60]。

抗氧化劑半胱胺對谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成有促進作用，IVM期間GSH水平的升高增強了胚胎的發(fā)育能力[61-62]。De Matos等[62]在培養(yǎng)基中添加半胱胺冷凍后囊胚腔再擴張率為95%，而對照組僅為76%[62]。因此，半胱胺的存在為胚胎短期儲存及運輸提供了希望[61]，有利于提高選擇強度和縮短世代間隔[41]。Merton等[41]通過活體采卵(ovum pick-up，OPU)技術(shù)將卵丘-卵母細胞復(fù)合體體外培養(yǎng)，結(jié)果表明半胱胺的存在顯著提高了囊胚率(34.4%vs. 23.4%)[41]。Balasubramanian和Rho[61]研究也表明,在IVM培養(yǎng)基中添加半胱胺提高了囊胚率(13.7%vs. 7.2%)和囊胚孵化率(16.8%vs. 12.0%)[61]。此外，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)為GSH的前體，具有強烈的自由基清除作用，改善了線粒體功能和細胞活力，優(yōu)化了體外成熟和冷凍保存期間的體外條件，減少了細胞凋亡的發(fā)生[40]。

抗氧化劑褪黑素、透明質(zhì)酸和川陳皮素能夠抑制促凋亡基因(CASP3[45]、BAX[45])和氧化應(yīng)激基因(SOX[63]、SOD2[37]、CYP51A1[37])的表達，并且增強抗凋亡基因(CAT[45]、BCL2[37,45])的表達。Su等[45]研究表明，褪黑素在IVM期間降低了卵母細胞和胚胎中ROS的水平(降低了58.8%)，顯著提高了囊胚率和體外受精(invitrofertilization，IVF)囊胚的總細胞數(shù)[45]。含有透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)的培養(yǎng)基具有增加囊胚平均細胞數(shù)(129.0vs. 101.0)[63]、提高胚胎孵化率(12.7%vs. 4.5%)[1]和解凍后存活率、孵化率[63]的效果。Cajas等[37]研究發(fā)現(xiàn)，添加川陳皮素的培養(yǎng)基提高了卵裂率(35.3%vs. 25.7%)，增加了卵母細胞發(fā)育成熟的百分比(89.3%vs. 87.0%)，增強了胚胎發(fā)育能力，并且川陳皮素是降低牛體外胚胎ROS水平和改善哺乳動物輔助生殖技術(shù)的重要物質(zhì)[37]。

Picco等[64]在IVM培養(yǎng)基中加入不同濃度的鋅，結(jié)果表明卵母細胞的發(fā)育能力隨鋅濃度增加而提高，卵裂率最高為74.05%，囊胚率最高為30.33%[64]。鋅的抗氧化作用可顯著減少DNA損傷、維持DNA完整性以促進胚胎著床前的發(fā)育[64]，并且補充鋅提高了內(nèi)細胞團的細胞數(shù)量，從而提高了妊娠率[65]。Guyader-Joly等[35]研究發(fā)現(xiàn)，卵磷脂的抗氧化作用使胚胎解凍后孵化率顯著高于未添加組(52.0%vs. 31.8%)，并且解凍后的體外胚胎存活率顯著提高[35]。此外，在含氨基酸的SOF培養(yǎng)基(SOFaa)中添加抗氧化劑檸檬酸鈉(SOFaaci)改善了培養(yǎng)環(huán)境，這是一種適合于牛胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以提高卵裂率和囊胚率[61]。

3.3 保護細胞骨架

研究表明，通過保護細胞骨架能夠提高牛體外卵母細胞[49]和體外胚胎[1]的耐低溫性。細胞松弛素B(cytochalasin B，CB)可以減少因微管和微絲破裂而引起的細胞損傷并增加質(zhì)膜的柔韌性，增強細胞抵御冷凍損傷的能力[1]。對于牛體外GV期的卵母細胞，CB的松弛作用保留了卵母細胞和顆粒細胞之間的間隙連接功能，從而使冷凍保護液更快、更均勻地滲透；對于牛體外MII期卵母細胞，CB減少了對微管的損傷，在玻璃化冷凍中增強了紡錘體微管的穩(wěn)定性[49]。培養(yǎng)基中添加CB提高了胚胎再擴張率、解凍后孵化率(29.6%vs. 9.1%)和存活率[1]。此外，研究表明添加3種細胞因子FGF2、LIF和IGF1[56]以及添加細胞松弛素D、秋水仙堿，可以改善牛體外胚胎的植入前發(fā)育，提高細胞骨架的完整性和冷凍后的存活率[56]。微管穩(wěn)定劑紫杉醇的使用也可改善牛體外胚胎解凍后紡錘體的形態(tài)[49]。

有證據(jù)表明，培養(yǎng)基的成分會影響牛胚胎膜的成分和胚胎的冷凍敏感性[5]。亞油酸白蛋白(linoleic acid albumin，LAA)是改善膜脂雙層流動性和提高體外胚胎凍融后生存能力的物質(zhì)之一[5]。添加LAA培養(yǎng)的胚胎解凍后孵化率[5](72.0%vs. 44.0%)和存活率[50](60.0%vs. 32.0%)都顯著高于未添加LAA培養(yǎng)的胚胎，這表明在體外胚胎培養(yǎng)基中添加LAA提高了胚胎的耐冷凍性[5]。此外，膜脂肪酸會影響膜脂雙層的流動性，從而影響牛體外胚胎的冷凍敏感性[5]。血清作為培養(yǎng)液的補充，不僅可以增加可用脂肪酸的總量，還可以改變膽固醇和磷脂的摩爾比，從而影響雙層膜的低溫生物物理特性[35]，提供能量底物、氨基酸、維生素、生長因子和重金屬螯合劑[58]。研究發(fā)現(xiàn)，添加胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)提高了囊胚率(25.3%vs. 19.7%)[5,55]，F(xiàn)BS濃度直接影響胞質(zhì)中的脂質(zhì)含量[10]，其有益作用表現(xiàn)在抑制早期卵裂并加速桑椹胚發(fā)育到囊胚階段[13]。Dochi[5]在培養(yǎng)基中添加小牛血清(calf serum，CS)，提高了胚胎解凍后的孵化率和囊胚率(29.6%vs. 11.2%)，并且在含有CS的培養(yǎng)基中加入LAA，結(jié)果顯著提高了解凍后胚胎的存活率和耐低溫性[5]。

3.4 增強線粒體功能

體外胚胎玻璃化冷凍后，恢復(fù)其受損的線粒體功能是實現(xiàn)高妊娠率和產(chǎn)生健康后代的對策之一[51,66]。白藜蘆醇是一種多酚類抗氧化劑，具有多種靶蛋白，Sirtuin蛋白是其中之一，它包含一組高度保守的組蛋白脫乙酰酶。組蛋白脫乙酰酶由SIRT1～7等7個成員組成，其中SIRT1是線粒體生物發(fā)生和降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[46,51]。因此，白藜蘆醇可以直接激活SIRT1來增強線粒體功能和生物合成，是線粒體生物發(fā)生的化學(xué)激活劑[51]。

研究表明，白藜蘆醇激活線粒體的生物發(fā)生和降解對玻璃化冷凍的卵母細胞和胚胎有益[51]，其通過去除受損的線粒體，使線粒體從頭合成以恢復(fù)功能[51]，提高了解凍后胚胎的發(fā)育能力[67]。白藜蘆醇處理增加了解凍后胚胎中線粒體數(shù)量[67]，提高了解凍后胚胎的質(zhì)量[67]、存活率(68.2%vs.52.3%)[46,51]和孵化率(69.6%vs.51.9%)，并且顯著提高了移植后的妊娠率(55.9%vs.41.8%)[67]。此外，1 μmol·L-1白藜蘆醇使胚胎發(fā)育至囊胚期的速率最高，而10 μmol·L-1白藜蘆醇對胚胎發(fā)育有害(未處理組、1 μmol·L-1和10 μmol·L-1白藜蘆醇處理的囊胚率分別為 47.0%、57.0%和22.0%)[67]。

3.5 人工強制塌陷囊胚腔

膨脹的囊胚有一個充滿液體的囊胚腔，其會延緩冷凍保護劑的滲透[68-69]，并且在冷凍過程中形成冰晶，導(dǎo)致囊胚質(zhì)量受損[69]。研究表明，通過在冷凍保存前進行人工穿透透明帶使囊胚腔塌陷，減少囊胚腔內(nèi)液體，可以減少冷凍保存期間滲透損傷的發(fā)生和冰晶的產(chǎn)生[69]。此外，囊胚腔塌陷后形成的小體積卵裂球可以在玻璃化冷凍過程中更快地平衡[68]，并且可以降低平衡過程中冷凍保護劑替換細胞內(nèi)的液體而引起的細胞毒性[69]，從而提高存活率[70]。

減少囊胚腔液體有許多不同方法，例如微量移液[70]、微針穿刺[71]和激光脈沖[71]等。通過使用移液管微量移液收縮囊胚腔，對處于擴張階段的胚胎進行玻璃化冷凍是一種有用且簡單的冷凍保存方法[70]。同時，用微針穿刺囊胚腔和激光脈沖瞄準滋養(yǎng)外胚層的細胞連接處以誘導(dǎo)囊胚腔塌陷，使擴張囊胚的囊胚腔立即縮小[71]，都提高了玻璃化冷凍囊胚的存活率和妊娠率[71-72]。在玻璃化冷凍前使用激光脈沖法減少囊胚腔液體，解凍后胚胎的植入率和牛的妊娠率都高于使用微針穿刺法[73]，因為與激光脈沖形成的小孔相比，針尖會對滋養(yǎng)外胚層細胞造成更多損傷，對后期發(fā)育和功能產(chǎn)生不利影響[74]。

Min等[6]研究證實，通過在玻璃化冷凍前人工強制塌陷牛囊胚腔(forced blastocoele collapse，F(xiàn)BC)不僅能夠提高牛體外胚胎存活率(81.9%vs.69.8%)和胚胎質(zhì)量[6]，還提高了冷凍后胚胎的存活率(90.5%vs.71.2%)、孵化率(42.3%vs.26.4%)和后代比例(35.6%vs.22.2%)，以及增加了胚胎細胞總數(shù)(127.4vs.117.3)。此外，F(xiàn)BC顯著增強了抗凋亡基因BCL-XL的表達，顯著降低了促凋亡基因BAX的表達[6]。總之，人工強制塌陷囊胚腔能夠減少冷凍保存對體外胚胎的損害，顯著提高冷凍后胚胎的質(zhì)量，使體外胚胎移植后的牛獲得更高的妊娠率[6]。

3.6 冷凍程序的優(yōu)化

胚胎玻璃化冷凍方法包括：開放式吸管(open pulled straw，OPS)、Cryoloop、Cryotop和固體表面玻璃化(solid surface vitrification)等，均具有高效性[75]。這些高效的冷凍方法都是基于最小體積冷卻的概念[75-76]，即通過最小化溶液體積來穩(wěn)定玻璃化狀態(tài)并抑制冷卻和解凍過程中冰晶的形成，以確保胚胎的高存活率[75-76]。一種新的中空纖維玻璃化(hollow fiber vitrification，HFV)冷凍方法被提出[75-76]，該方法是將胚胎保存在一小塊中空纖維(三乙酸纖維素)中，并帶有少量含有冷凍保護劑的玻璃化溶液[76]。中空纖維可以同時玻璃化冷凍30個以上胚胎[76]。此外，中空纖維也可以應(yīng)用最小體積冷卻原則，這大大提高了冷凍解凍的速率[76-77]。

研究表明，采用HFV方法將2～4細胞階段、8～16細胞階段和桑椹胚階段的牛體外胚胎玻璃化冷凍后，體外胚胎存活率都與非玻璃化對照組(82.5%vs.94.6%)相似，玻璃化冷凍后胚胎發(fā)育成囊胚的比率(2～4細胞階段為66.1%；8～16細胞階段為66.7%；桑椹胚階段為82.5 %)也與非玻璃化對照組(分別為74.5%、79.7%和82.5%)相似[75]。牛體外胚胎冷凍保存后的存活率在桑椹胚階段前通常低于桑椹胚階段及之后，然而應(yīng)用HFV方法，2～4細胞階段和8～16細胞階段胚胎的玻璃化后存活率并不明顯低于桑椹胚期，這表明了HFV方法對冷凍敏感胚胎的有效性[75]。

HFV方法的有效性受到所用冷凍保護劑(cryoprotectants，CPAs)的類型、濃度和處理時間的影響[77]，因此通過改善玻璃化溶液中CPAs濃度可以達到提高冷凍效率的效果。Kornienko等[77]研究表明，通過提高HFV方法玻璃化溶液中非滲透CPAs蔗糖的濃度，將玻璃化溶液中的蔗糖濃度從0.5 mol·L-1提高到1.0 mol·L-1，結(jié)果顯著提高了牛體外冷凍卵母細胞的囊胚率(21.1%～23.4%vs.3.1%～3.5%)[77]。這表明在浸入液氮之前，卵母細胞和其周圍的溶液在中空纖維中充分脫水是成功玻璃化的一個重要因素[77]?？傊?，HFV方法可成功用于牛體外胚胎的冷凍保存[75-77]，是一種高效的胚胎冷凍保存方法[75]，其簡化了冷凍及解凍程序[77]。HFV方法不僅會作為生殖生物學(xué)的研究工具，還會作為一種實用技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物繁殖和育種等多個領(lǐng)域[76]。

4 小 結(jié)

近年來，體外胚胎冷凍保存技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，提高體外胚胎冷凍效率也成為研究熱點。通過去脂、優(yōu)化培養(yǎng)液、優(yōu)化冷凍程序和人工干預(yù)等措施，已成功提高了體外胚胎囊胚率和存活率，從而提高了體外胚胎冷凍效率，這促進了體外胚胎冷凍保存技術(shù)的廣泛發(fā)展。體外胚胎冷凍保存技術(shù)已成為保護瀕危、優(yōu)良品種資源的重要手段。在未來的研究中可以通過已知機制，繼續(xù)優(yōu)化常規(guī)冷凍、玻璃化冷凍及解凍程序，以及優(yōu)化冷凍液、解凍液，以提高體外胚胎冷凍效率。

目前，體外胚胎凍融后移植的妊娠率還未達到理想效果，未來還需廣泛探究影響冷凍保存效率的機制，進而全方面改善體外胚胎冷凍保存過程，提高冷凍效率，以期推進牛產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，最終為優(yōu)良品種高效擴繁和新品種創(chuàng)制等提供堅實的技術(shù)保障。