楊小耿，張慧珠，李 鍵1,2,，向 華，何翃閎1,2,*

(1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

同一生物體內(nèi)的所有細(xì)胞都具有相同的基因組，但其外觀和功能均不相同。在細(xì)胞分裂過程中，轉(zhuǎn)錄程序的選擇性激活和隨后的維持決定了細(xì)胞的特性。表觀遺傳修飾主要通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)功能，在細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞分裂過程的維持中起著至關(guān)重要的作用[1]，其主要包括3種調(diào)節(jié)機(jī)制：DNA甲基化、microRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和組蛋白翻譯后修飾[2]。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制控制著配子發(fā)生早期的基因組重編程和胚胎的發(fā)育，在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

DNA甲基化是指以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化，在CpG二核苷酸胞嘧啶的5’端碳原子上結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過程[3]。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸的胞嘧啶上，即CpG位點(diǎn)(CpGs)，且在基因組中呈不均勻分布[4-5]。作為基因表達(dá)的中介機(jī)制，DNA甲基化被廣泛認(rèn)為是一種表觀遺傳抑制標(biāo)志，主要涉及基因組印跡、X染色體失活、轉(zhuǎn)座元件沉默等多種生理過程[6]。此外，DNA甲基化可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與其他染色質(zhì)互作蛋白的結(jié)合并改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因表達(dá)[7]。

DNA甲基化在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。DNA甲基化不僅調(diào)控基因的表達(dá)，還經(jīng)歷了廣泛的從頭甲基化和去甲基化的動(dòng)態(tài)變化，這對(duì)哺乳動(dòng)物受精、早期胚胎發(fā)育及組織特異性分化至關(guān)重要[8-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化可抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因啟動(dòng)子，介導(dǎo)RSPO2促進(jìn)哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育[13-14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞DNA甲基化對(duì)基因組印跡至關(guān)重要，而無法建立印跡會(huì)導(dǎo)致小鼠和人類發(fā)生先天性疾病或致命。卵母細(xì)胞甲基化的部分或完全缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，異常的DNA甲基化會(huì)阻礙胚胎發(fā)育[15-16]。因此，研究DNA甲基化在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制對(duì)提高卵母細(xì)胞成熟率、胚胎發(fā)育能力以及哺乳動(dòng)物繁殖率具有重要意義。本文主要介紹了DNA甲基化的建立與去除機(jī)制及其生物學(xué)功能，重點(diǎn)闡述了DNA甲基化在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中精準(zhǔn)生成、維持、讀取和刪除的動(dòng)態(tài)變化過程，為進(jìn)一步研究哺乳動(dòng)物表觀遺傳調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 哺乳動(dòng)物DNA甲基化與去甲基化

1.1 DNA甲基化途徑

DNA甲基化是哺乳動(dòng)物中一種重要的表觀遺傳修飾，主要由從頭甲基化和維持甲基化組成，并通過特定的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)介導(dǎo)和維持。目前,在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的DNMTs主要有6種，分別是維持型DNMT1，新生型DNMT3A、DNMT3B和DNMT3C，輔助因子DNMT3L以及介導(dǎo)tRNAs甲基化的DNMT2。維持型DNMT1是最早發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，主要存在于哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞和早期胚胎的細(xì)胞質(zhì)中，負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂過程中DNA甲基化的維持，其維持機(jī)制主要是通過在復(fù)制過程中將舊DNA鏈的DNA甲基化復(fù)制到新合成的DNA鏈上從而維持DNA甲基化，且其依賴于UHRF1 將DNMT1招募到半甲基化的CG位點(diǎn)[17-19]。DNMT1的敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎死亡以及全基因組的廣泛性去甲基化[20]。DNMT2具有完整的催化結(jié)構(gòu)域且高度保守，能夠使位于天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA反密碼子環(huán)的胞嘧啶38甲基化，但不參與基因組DNA甲基化[21-22]。而DNMT3A和DNMT3B則主要負(fù)責(zé)生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中的從頭甲基化，但二者又有不同，DNMT3A偏向于未甲基化的DNA，在卵母細(xì)胞和附植前胚胎中發(fā)揮重要作用；而DNMT3B偏向于半甲基化和未甲基化的DNA，在胚胎發(fā)育外胚層轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要作用[23-25]。DNMT3A和DNMT3B的敲除會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞中印記丟失，造成DNA甲基化異常，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷甚至死亡[26]。在DNMT3L的輔助作用下，DNMT3A和DNMT3B可靶向定位CpG位點(diǎn)，并與DNMT1合作傳播甲基化模式[27]。DNMT3C也是一種從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的啟動(dòng)子進(jìn)行甲基化，且該酶的特殊活性是小鼠生育能力所必需的[28]，這不僅揭示了哺乳動(dòng)物DNA甲基化系統(tǒng)的可塑性，同時(shí)還擴(kuò)大了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的范圍。DNMT3L是一種核蛋白，不含酶的活性位點(diǎn)，但能夠識(shí)別攜帶未甲基化組蛋白H3賴氨酸4(H3K4)的核小體，將DNMT3A和DNMT3B招募到特定位點(diǎn)，間接參與從頭甲基化[29-30]。

1.2 DNA去甲基化途徑

DNA去甲基化(DNA demethylation)在原始生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，可分為被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化。被動(dòng)去甲基化主要發(fā)生在母體基因中，是指復(fù)制后未使新的DNA鏈甲基化，而保持半甲基化狀態(tài)，隨著DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂，甲基化被不斷稀釋的過程[31]。DNMT1對(duì)半甲基化的DNA具有高度親和力且呈周期依賴性，在母體和合子中DNMT1能夠靶向去甲基化。因此，可通過破壞維持DNA甲基化機(jī)制，致使CpG在DNA復(fù)制過程中被不斷稀釋來完成被動(dòng)去甲基化過程[32]。主動(dòng)去甲基化發(fā)生在DNA復(fù)制之外，由DNA去甲基化酶(ten-eleven-translocation, TET)家族將5-甲基胞嘧啶(5 mC)催化氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5 hmC)，然后復(fù)制依賴性稀釋氧化的5 mC或胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)介導(dǎo)的5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxyl cytosine，5caC)的切除并結(jié)合堿基切除修復(fù)來完成整個(gè)去甲基化過程[33-34]。

TET蛋白酶家族參與DNA去甲基化反應(yīng)需要α-酮戊二酸、鐵和氧，并由抗壞血酸作為輔助因子促進(jìn)[35]，在哺乳動(dòng)物原始生殖細(xì)胞及胚胎發(fā)育等方面具有重要作用[36]，其表達(dá)水平與DNA甲基化密切相關(guān)。高表達(dá)的TETs可顯著降低基因組的DNA甲基化水平，而缺少TETs則會(huì)誘導(dǎo)基因組DNA高甲基化。TET家族由TET1、TET2和TET3三個(gè)成員組成，均具有羥基化酶活性，且在小鼠不同組織中呈差異性表達(dá)。有研究表明，TET3在卵母細(xì)胞和受精卵中高度表達(dá)，雌性小鼠敲除TET3可導(dǎo)致生育能力下降甚至致死[37]。隨著早期胚胎的發(fā)育，TET3在2細(xì)胞期迅速減少，直到囊胚期開始出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，而TET1和TET2的表達(dá)量增加，由此表明TET3主要在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和受精卵發(fā)育中發(fā)揮了主動(dòng)去甲基化功能，而TET1和TET2則在原始生殖細(xì)胞中發(fā)揮去甲基化作用[38]。

2 DNA甲基化在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育中的動(dòng)態(tài)變化

盡管DNA甲基化模式具有可遺傳性，但在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化[39]。哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中主要發(fā)生兩種表觀遺傳的重編程過程，一種發(fā)生在原始生殖細(xì)胞形成階段，另一種發(fā)生在附植前胚胎發(fā)育階段[40]。在這兩個(gè)階段中，基因組首先進(jìn)行全局去甲基化，然后發(fā)生從頭甲基化，從而建立新的甲基化模式[41]，這在哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞遺傳記憶的重新建立及發(fā)育潛能的開發(fā)方面具有重要作用[42-43]。

2.1 卵母細(xì)胞DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化

原始生殖細(xì)胞(PGC)是精子和卵子的前體，哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞來源于附植后早期胚胎的體細(xì)胞。原始生殖細(xì)胞形成后，基因組發(fā)生去甲基化，這標(biāo)志著第二次重編程的開始。在配子發(fā)生期間，不同性別的基因組在不同時(shí)間和程度上被重新甲基化[44]，有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠早期原始生殖細(xì)胞攜帶著與體細(xì)胞類似的DNA甲基化模式，當(dāng)遷移至生殖嵴時(shí)(E7.5-E13.5)被全部消除；雄性小鼠出生后不久即可重新建立配子特異性表觀基因組，而雌性小鼠卵母細(xì)胞會(huì)一直保持低甲基化狀態(tài)，直到原始卵泡被激活進(jìn)入生長狀態(tài)，卵母細(xì)胞才會(huì)在發(fā)育過程中經(jīng)歷性別特異性的從頭甲基化并重新建立遺傳印跡[45-48]。

卵母細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，具有不同于體細(xì)胞的獨(dú)特DNA甲基化模式。在卵母細(xì)胞生長發(fā)育過程中，DNA甲基化的獲得呈漸進(jìn)性。原始生殖細(xì)胞進(jìn)入并在第一次減數(shù)分裂前期停止，在減數(shù)分裂前期到排卵期間卵母細(xì)胞幾乎不存在甲基化[49-50]，在卵泡發(fā)育后期，隨著卵母細(xì)胞的增大而重新獲得甲基化[15]，并于青春期到達(dá)MⅡ卵母細(xì)胞的峰值[51]。此外，卵母細(xì)胞甲基化主要局限于活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)，使得卵母細(xì)胞基因組呈現(xiàn)出一種由低水平甲基化的基因間區(qū)或轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū)域?qū)⒏叨燃谆幕蝮w分隔開的雙峰模式[52-54]。多項(xiàng)研究表明，取消單個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄會(huì)導(dǎo)致該位點(diǎn)無法建立甲基化[54-55]。印跡是親本等位基因特異性DNA甲基化導(dǎo)致后代組織中印跡基因表達(dá)的過程[52, 56]。在人類和小鼠中，卵母細(xì)胞具有多數(shù)印跡基因控制區(qū)(ICRs)，其作為卵母細(xì)胞的CpG島在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中建立甲基化[54]。然而，卵母細(xì)胞甲基化動(dòng)態(tài)變化也與其他細(xì)胞生理活動(dòng)一樣，會(huì)因外界條件的影響而產(chǎn)生差異，在牛卵母細(xì)胞從生發(fā)泡(GV)期到中期Ⅱ(MⅡ)階段的整個(gè)體外成熟過程中，全基因組DNA甲基化顯示出穩(wěn)定的信號(hào)，并且在大小不同卵泡產(chǎn)生的卵母細(xì)胞間并未觀察到顯著差異[57]。此外，小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞玻璃化可降低全組甲基化水平[58]。

2.2 早期胚胎DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化

哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育從受精卵開始，其胚胎發(fā)育早期是最動(dòng)態(tài)的生物學(xué)過程之一，有大量的DNA甲基化重編程在此過程中發(fā)生[59]。胚胎附植前的第一次DNA甲基化重編程擦除了配子發(fā)生過程中積累的相關(guān)遺傳信息，并恢復(fù)了胚胎細(xì)胞的全能性[60]。受精后，父系和母系DNA甲基化發(fā)生第一次重編程，父系DNA主要通過TET3與TDG介導(dǎo)的主動(dòng)去甲基化，在第一個(gè)細(xì)胞周期中快速去甲基化，同時(shí)在卵裂過程繼續(xù)去甲基化[61-62]，而母系DNA由于DNMT1被排除在細(xì)胞核之外而缺乏維持性能[56]，因而在細(xì)胞分裂過程中發(fā)生被動(dòng)去甲基化，使胚胎的DNA甲基化水平呈下降趨勢(shì)，囊胚期達(dá)到最低[11, 41]。此時(shí)，整個(gè)基因組DNA甲基化幾乎被完全擦除，僅保留了小部分特異性甲基化區(qū)域，此后，隨著胚胎植入子宮，從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B迅速恢復(fù)基因組甲基化[15]。然而，有研究表明，在小鼠、豬、牛和人類早期胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化的建立與去除時(shí)間因物種而異，小鼠和人類DNA甲基化的建立主要發(fā)生在囊胚期，而豬主要發(fā)生在8～16細(xì)胞期，牛則主要發(fā)生在16細(xì)胞期；此外，小鼠DNA去甲基化發(fā)生在E7.5～E13.5期間，而豬、牛和人類則均從受精后開始分別至囊胚期、16細(xì)胞期及桑葚胚期完成DNA去甲基化(表1)。

表1 不同哺乳動(dòng)物早期胚胎DNA甲基化與去甲基化的時(shí)期

3 DNA甲基化的影響因子

哺乳動(dòng)物DNA甲基化水平主要受DNMTs和TETs的調(diào)控， DNMTs家族主要介導(dǎo)DNA甲基化的建立與維持，而TET家族則主要介導(dǎo)DNA去甲基化。然而，酶的作用又受多種因素的影響，例如，參與TET介導(dǎo)去甲基化作用的氧氣、鐵和α-酮戊二酸以及抗壞血酸等[35]。此外，還有能夠靶向定位DNA甲基化位點(diǎn)的UHRF1以及能夠通過與UHRF1結(jié)合來抑制DNA甲基化的Stella等影響因子。

缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是一種由氧穩(wěn)定型β亞基和不穩(wěn)定型α亞基(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)組成的氧依賴的轉(zhuǎn)錄激活因子。研究表明，HIF可在缺氧條件下調(diào)節(jié)多種細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用[69]。HIF-1α和HIF-2α是缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵，能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活多種基因。在缺氧條件下，HIF-2α可促進(jìn)紅細(xì)胞生成素編碼基因的轉(zhuǎn)錄[70]，而HIF-1α則直接誘導(dǎo)TET3表達(dá)促進(jìn)DNA去甲基化[35]。HIF-1α和HIF-2α的靶向失活將導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育缺陷，同時(shí)低氧也可降低體外成熟產(chǎn)生的牛受精卵中母體基因的整體甲基化水平[71]。

泛素樣蛋白1(the ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains protein 1, UHRF1)能夠識(shí)別DNA甲基化和組蛋白修飾，對(duì)維持DNA甲基化在胚胎附植前發(fā)育的第一次重編程中起著至關(guān)重要的作用，其最基本的機(jī)制是：輔助因子UHRF1在DNA復(fù)制后識(shí)別半甲基化的CpG位點(diǎn)，并招募DNMT1來甲基化新的DNA子鏈。研究表明，在卵母細(xì)胞和著床前胚胎的整體表觀遺傳重編程過程中，UHRF1可通過調(diào)控DNA甲基化及H3K9甲基化抑制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄，敲除雄性小鼠生殖細(xì)胞UHRF1基因可導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯，雄性小鼠不育；母體UHRF1基因可通過調(diào)控DNA甲基化和組蛋白修飾來參與卵母細(xì)胞及早期胚胎的發(fā)育，缺失會(huì)嚴(yán)重降低小鼠卵母細(xì)胞的質(zhì)量并導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯和雌性小鼠不育；敲除母體UHRF1基因可導(dǎo)致胚胎致死表型且伴隨全基因組低甲基化[19, 72]。

Stella(也稱PGC7或Dppa3)是一種在原始生殖細(xì)胞中高度表達(dá)的蛋白，可保護(hù)母體基因組和印跡基因免受主動(dòng)去甲基化的影響。研究表明，在小鼠和牛胚胎中，Stella可保護(hù)母體基因組免受TET3介導(dǎo)的5 mC向5 hmC的氧化轉(zhuǎn)化，敲除Stella基因可導(dǎo)致雌性生育能力強(qiáng)烈下降以及早期胚胎無法主動(dòng)進(jìn)入囊胚期，證明Stella是正確表觀遺傳重編程和胚胎發(fā)育的重要因素[73-74]。此外，Stella也可防止卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中DNA過度甲基化并通過與UHRF1結(jié)合來抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的招募作用[75]。

4 展 望

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要調(diào)控機(jī)制之一，在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，卵母細(xì)胞DNA甲基化異常會(huì)阻礙早期胚胎發(fā)育，部分或完全缺失則可導(dǎo)致早期胚胎致死和先天性疾病。因此，深入探究DNA甲基化在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化模式，為研究哺乳動(dòng)物表觀遺傳調(diào)控等提供參考依據(jù)，為進(jìn)一步探討哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟環(huán)境及建立體外胚胎生產(chǎn)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。此外，DNA甲基化水平也受到各類因素的影響，關(guān)于HIF、UHRF1及Dppa3等影響因子對(duì)DNA甲基化的建立與維持以及相關(guān)機(jī)制的調(diào)控尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。在未來，深入研究DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制對(duì)于提高哺乳動(dòng)物繁殖率以及加強(qiáng)動(dòng)物疾病防控仍具有重大應(yīng)用價(jià)值。