劉源壹，李昕俞，巴音那木拉，翠 芳，芒 來，杜 明*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖學(xué)重點實驗室，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗動物疫病預(yù)防控制中心，赤峰 025550)

繁殖是所有生命都具備的生理現(xiàn)象[1-3]，指動物通過生殖活動產(chǎn)生后代[4]。動物繁殖能力是衡量動物生產(chǎn)性能的重要指標之一，在動物生產(chǎn)的經(jīng)濟效益中起主導(dǎo)地位[5]。在動物繁殖過程中，生殖細胞的動態(tài)變化和相關(guān)基因的表達對其起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指由細胞在某一特定的階段轉(zhuǎn)錄出來的全部產(chǎn)物，包括編碼RNA和非編碼RNA[6-8]。當(dāng)同一細胞位于不同的生命進程及生長環(huán)境時，其基因的表達狀態(tài)也有所不同。這就導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄組研究的特殊之處，即存在時間和空間上的多維度差異，進而促使基因間構(gòu)成龐大且復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。轉(zhuǎn)錄組信息的深入發(fā)掘?qū)蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系的解讀至關(guān)重要。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)是指在單個細胞水平對mRNA進行高通量測序，其基于單細胞、高通量的特點，解決了對于細胞分子機制研究中常見的細胞異質(zhì)性、細胞量少而無法進行常規(guī)高通量測序等問題[9-11]。隨著單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者開始將這一技術(shù)引入到動物繁殖的研究中，使得對生殖細胞的研究也逐漸深入。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以對不同生殖細胞進行類型鑒定、群體分類以及各種關(guān)鍵基因及通路的篩選等，上述方法對深入研究動物繁殖機制，提高動物繁殖能力，增加動物生產(chǎn)的經(jīng)濟效益起到了重要作用。

1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展

1.1 發(fā)展歷史

在單細胞中對mRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行基于高通量測序且完全無偏倚的研究方法于2009年被Tang等[12]首次發(fā)表，這也是單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的關(guān)鍵性開端。然而該技術(shù)存在只能對單個細胞進行轉(zhuǎn)錄組描繪的不足。為了進一步提高測序方法的應(yīng)用范圍，Islam等[13]于2011年研發(fā)了單細胞標記的反轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)STRT-seq (single-cell tagged reverse transcription sequencing)。這是一種通量更高的方法，先將細胞分離到96孔板中，再利用鏈轉(zhuǎn)化原理給每個細胞加入具有特異性的條形碼，從而能夠大規(guī)模檢測各種混合細胞樣本。

2012年出現(xiàn)了一項具有里程碑意義的技術(shù)，由美國和瑞典的科學(xué)家共同開發(fā)的能夠從單細胞生成全長cDNA的測序方法Smart-seq(switching mechanism at 5′end of the RNA transcript)[14]，進一步增加了轉(zhuǎn)錄本序列的覆蓋度。但這種方法的缺點是不能高效轉(zhuǎn)錄超過4 kb的序列，且具有轉(zhuǎn)錄本長度偏向性[15-16]。同一年，Hashimshony等[17]開發(fā)出了一種采用體外轉(zhuǎn)錄代替 PCR 達到擴增目的的測序方法，即CEL-seq (cell expression by linear amplification and sequencing)。該方法采用線性擴增構(gòu)建cDNA文庫雖然具有擴增偏好的缺點，但是其測序結(jié)果更加準確[18]。為了達到對許多不同單細胞進行研究和多重分析的目的，此方法也添加了相應(yīng)的特異性標簽。2013年，Picelli等[19]對Smart-seq技術(shù)進行了進一步的改進，開發(fā)出Smart-seq2并逐漸成為研究者們常用的測序方法之一。正是有了上述幾種標志性測序方法的出現(xiàn)，又隨著無數(shù)研究者對方法進行不斷的完善、發(fā)展和改進，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序逐漸實現(xiàn)了更高的通量，更廣泛的應(yīng)用，更自動化的操作以及更高的效率，逐漸成為當(dāng)下解決諸多生物學(xué)問題的有效方法之一。

1.2 發(fā)展趨勢

隨著第二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)和第三代測序技術(shù)(third generation sequencing，TGS)的飛速發(fā)展，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究中不可或缺的有力工具[20-23]。測序數(shù)據(jù)能夠揭露出細胞群體的內(nèi)在異質(zhì)性，并隨著其在分離、標記、通量和深度等方法上的進步，以及人們對單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的研究越來越系統(tǒng)，生物制藥和生物技術(shù)公司開發(fā)市場產(chǎn)品的規(guī)模將會持續(xù)增長。根據(jù)中研普華產(chǎn)業(yè)研究院的《2021—2026年全球及中國單細胞測序行業(yè)發(fā)展調(diào)研及投資前景分析報告》統(tǒng)計分析顯示(圖1)，全球市場應(yīng)用單細胞測序規(guī)模自2015年起呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，預(yù)計在2026年可以達到77.62億美元的應(yīng)用規(guī)模。

圖1 2015—2026年全球市場不同應(yīng)用單細胞測序規(guī)模對比

近年來，單細胞測序相關(guān)研究的文獻數(shù)量也呈指數(shù)式增長的趨勢，截止到2022年4月，在Pubmed中以“scRNA-seq”為檢索詞進行文獻檢索發(fā)現(xiàn)已發(fā)表超過2 500篇以上與單細胞測序相關(guān)的文獻(圖2)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于如免疫系統(tǒng)，大腦、神經(jīng)系統(tǒng)，上皮組織，生殖發(fā)育，癌癥等相關(guān)的科研工作當(dāng)中。

圖2 2016—2022年單細胞轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)文獻發(fā)表情況

2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)技術(shù)的比較

2.1 單細胞分離方法的比較

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序過程中首要的步驟即單細胞分離(表1)，其質(zhì)量的高低無疑關(guān)乎到后續(xù)的測序是否成功。常用方法包括：1)口吸管技術(shù)[24]：通過人工方法利用安裝有顯微針的口吸管對單個細胞進行分離。2)激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)[25]：利用計算機輔助的激光系統(tǒng)將單個細胞從固體組織中分離出來。3)流式細胞儀技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)[26]：通過計算機系統(tǒng)和熒光染色技術(shù)達到對細胞進行分選的目的。4)微滴(microdroplets)[27]：用含有特定條碼(barcode)的微升級別的液滴將單個細胞進行包裹。5)微流控(microfluidics)[28]：是一種使用微通道處理或操控微小流體的技術(shù)。以上幾種方法各有利弊，在實際應(yīng)用的選擇當(dāng)中，研究人員應(yīng)當(dāng)基于樣品的差別對不同的單細胞分離方法進行相適應(yīng)的合理選擇，這樣才能更好的完成更進一步的測序工作。

表1 不同單細胞分離方法的比較(修改來自文獻[29])

2.2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方法的比較

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展至今雖然有著諸多不同的方法，但其測序流程都基本相似(圖3)。不同的測序方法存在的差異性往往可以從以下幾方面來分析(表2)：單細胞的分離方法，反轉(zhuǎn)錄后的擴增方法，轉(zhuǎn)錄組覆蓋度，鏈是否具有特異性，是否被獨特的分子標識符(UMI)識別等。Ziegenhain等[30]通過從583只小鼠胚胎干細胞中提取的數(shù)據(jù)，詳細比較了CEL-seq2、Drop-seq、MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq和Smart-seq2這6種scRNA-seq經(jīng)典方法的優(yōu)、缺點，結(jié)果表明雖然Smart-seq2檢測到每個細胞和跨細胞的基因最多，但CEL-seq2、Drop-seq、MARS-seq和SCRB-seq由于使用獨特的分子標識符UMI而量化了mRNA水平，擴增噪聲較小。不同測序深度的功率模擬試驗表明，Drop-seq在分析大量細胞的轉(zhuǎn)錄組時更有效，而MARS-seq、SCRB-seq 和Smart-seq2在分析較少的細胞時更有效。研究為不同方法之間的選擇提供了基礎(chǔ)，為進一步改進不同方案提供了一個基準框架。西班牙國家基因組分析中心對13種單細胞RNA測序方法開展了性能評估[31]。該研究團隊采用了人外周血、小鼠結(jié)腸和少量其他細胞系的細胞混合物，在世界上不同的實驗室對13種技術(shù)開展了基因檢測靈敏度、分群、比對率等各方面的比較。最終結(jié)果表明，低通量技術(shù)中Quartz-seq2、Smart-seq2和CEL-seq2表現(xiàn)出色，而高通量技術(shù)中10× Chromium的表現(xiàn)最好。Chen等[32]詳細介紹了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的一些經(jīng)典方案以及scRNA-seq單細胞分離技術(shù)，并討論不同單細胞轉(zhuǎn)錄組測序方案的數(shù)據(jù)分析，包括質(zhì)量控制、基因表達量化、批次效應(yīng)校正、規(guī)范化、降維、特征選擇、細胞聚類、軌跡推理基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)等。Townes等[33]將單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與一般的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(bulkRNA-seq)進行了比較，明確了兩者的差異即分析的數(shù)據(jù)精度不同，前者在單個細胞水平上構(gòu)建每個細胞的表達譜，而后者獲得的是一個大的細胞群體中單個基因的平均表達水平。這對相應(yīng)方案的選擇起到了指導(dǎo)性的作用。

圖3 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序基本流程[34-36]

表2 不同單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)方法的差異[37-40]

對于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序研究中需要選擇的不同方法，應(yīng)該主要考慮的是實際研究的具體情況，包括選擇全長還是基于UMI的方法；細胞數(shù)量；測序的讀取片段(reads)等[41-45]。目前，細胞圖譜類的研究由于要測大量的細胞(>10 000)，因此常采用UMI方法，測序深度約為100萬的reads。該類研究主要是細胞分類和標記基因的鑒定，因此UMI信息是足夠的[46]。而對于其他的研究，如果想獲得更多的信息，則采用Smart-seq2全長模式比較合適，可以加深測序深度以便得到如非編碼RNA和可變剪接(alternative Splice，AS)等更多的生物信息。

2.3 Smart-seq2與10×Genomics的比較

在眾多方法中10×Genomics推出的ChromiumTM—Single Cell 3’ Solution和Smart-seq2這兩種方法常常較多應(yīng)用于實際研究中。Smart-seq2是經(jīng)Smart-seq改良的一種測序方案，與Smart-seq相比使用了鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)、更高濃度的MgCl2以及甜菜堿[47-48]。而10×Genomics商業(yè)測序平臺的測序流程主要基于微流控液滴技術(shù)(microfluidic droplet)[49-52]，與Smart-seq有相似的分子生物學(xué)原理，運用了模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，但與Smart-seq的細胞捕獲和通量不同。對于這兩種方法的差異，Wang等[53]對兩者的優(yōu)缺點進行了詳細的比較，他認為Smart-seq2由于成本更低，可以檢測的樣本范圍更廣，所以更適合于分析大量細胞；同時，由于其原理的組分更為公開，可以讓研究人員對其進一步進行改良；且由于單細胞檢測到的轉(zhuǎn)錄本更多，能挖掘出轉(zhuǎn)錄本更深的信息。但其不能分析非poly(A)的RNA且測序reads不帶有mRNA鏈特異性。10×Genomics則具有操作簡單便捷、細胞通量高、建庫周期短、捕獲效率高等優(yōu)點，但是該技術(shù)只能獲得3′端轉(zhuǎn)錄本信息且對樣本要求高[54-58]。Kashima等[59]的研究也做出了詳細比較(表3)。這些研究成果為今后研究者進行合適方法的選擇提供了明確且詳細的參考依據(jù)。

表3 Smart-seq2與10×Genomics的差異比較(修改來自文獻[59])

3 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在動物繁殖中的應(yīng)用

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)如今廣泛應(yīng)用于動物繁殖領(lǐng)域的相關(guān)研究中。該技術(shù)以不同種類的單個細胞為單位，達到了高分辨率的生物分子觀測水平，直觀反映出所要解答的相關(guān)科學(xué)問題，例如：通過主成分分析和細胞聚類技術(shù)對不同器官的單細胞圖譜進行繪制，進而達到對不同細胞類型的鑒定以及未知細胞發(fā)掘的目的；通過單細胞與多組學(xué)的聯(lián)合使用以期達到對某些關(guān)鍵基因篩選、差異基因比較的目的。最后通過驗證技術(shù)(bulkRNA-seq、qPCR、FISH、免疫熒光等)的結(jié)合驗證，解析不同動物繁殖的相關(guān)科學(xué)問題(表4)。

表4 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在不同動物的應(yīng)用

3.1 非模式動物細胞類型的鑒定

3.1.1 細胞類型的鑒定方法 通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對非模式動物在不同繁殖階段的生殖細胞進行鑒定是動物繁殖領(lǐng)域中最常見且重要的一種應(yīng)用。一種鑒定方法是基于標記基因的比對，即通過觀察某個細胞類群的差異基因與數(shù)據(jù)庫(CellMarker、Mouse Cell Atlas、PanglaoDB等)[60]中哪種細胞類型的差異基因相一致程度更高，結(jié)合其定量表達以完成對細胞類型的鑒別判定。另外一種鑒定方法是基于表達譜的比對，即比較未知類型細胞與已知類型細胞的表達譜相關(guān)性，通過比較相關(guān)性程度來達到鑒定的目的[61]。與之前僅僅通過細胞形態(tài)、位置及有特定蛋白的基因表達模式進行鑒定的方法相比，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的方法具有更為系統(tǒng)且準確的數(shù)據(jù)指標，可以更為全面、精確的區(qū)分不同種類的細胞[62]。同時也進一步提高了鑒定的靈敏度，這使得一些相似的細胞類型也可以通過有效的方法進行區(qū)分和鑒定。

3.1.2 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在精子和卵子發(fā)生中的應(yīng)用 雄性動物的精子發(fā)生是動物繁殖的關(guān)鍵過程之一，包括曲精細管上皮的精原細胞經(jīng)過精母細胞到精子細胞的增殖發(fā)育過程和精子形成過程[63]。這一過程基于生殖細胞和體細胞之間復(fù)雜的互作效應(yīng)，因此往往會同時出現(xiàn)多種生殖細胞和體細胞類型，即出現(xiàn)較為復(fù)雜的細胞異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得在不同發(fā)育階段很難精準剖析辨別不同類型細胞,而通過單細胞測序技術(shù)卻可以清晰、準確的鑒定出睪丸中不同細胞的不同類型，同時也可以根據(jù)具體的研究目的，更進一步對不同細胞類型進行更詳細的聚類分析。Green等[64]從成年小鼠睪丸中收集了3.5萬個細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了所有已知的生殖細胞和體細胞以及兩個未確定過的體細胞類型。重點分析劃定了精原細胞的4個類群和支持細胞的9個類群，后者與組織學(xué)上確定的生精上皮周期的發(fā)育階段有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為研究生殖細胞發(fā)育和體內(nèi)配子發(fā)生提供了全面的知識基礎(chǔ)。高源[65]通過采集性成熟前后兩個階段安格斯公牛睪丸的細胞，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了12 個細胞類群(9種體細胞和3種生殖細胞)。又通過聚類分析重點將睪丸生殖細胞劃定為13個類群，與后續(xù)特異基因的表達研究相結(jié)合，詳細解析了牛睪丸發(fā)育、精子生成等進程的相關(guān)機制。雷佩佩[66]通過采集杜洛克公豬睪丸中的細胞，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了 20 個細胞類群，并通過特定基因?qū)⑵浞譃?6 個大的細胞類群和一個未確定過的細胞類群，這一發(fā)現(xiàn)詳細剖析了細胞類型與豬睪丸發(fā)育間的相關(guān)性。

卵細胞的形成也是動物繁殖的關(guān)鍵過程之一。對于雌性動物而言，卵細胞的生成依賴于卵母細胞減數(shù)分裂的相關(guān)過程。He等[67]對小鼠新生卵巢單個生殖細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，對3種細胞狀態(tài)(生殖細胞囊腫、囊腫破裂、卵泡)的3個細胞類群進行了分類，為后續(xù)鑒定一系列卵泡形成和發(fā)育相關(guān)基因和分子通路起到了關(guān)鍵作用。綜上所述，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以對精子發(fā)生和卵細胞形成等過程中各類細胞的異質(zhì)性進行更為靈敏的捕獲，進而精準鑒定出細胞類型，從而使得研究者可以更為精確的解讀動物不同生殖階段與各類細胞間的關(guān)系。另外，從細胞角度入手，可以對動物繁殖機制進行更多元化的研究。

3.2 關(guān)鍵基因的研究

在動物繁殖動態(tài)進程中，不同類型細胞進行動態(tài)發(fā)育與分化。當(dāng)其從當(dāng)前狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N狀態(tài)時，相應(yīng)基因的表達也隨之改變，轉(zhuǎn)錄組進行重組進而出現(xiàn)基因激活或沉默。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的擬時序分析(pseudotime)，可以對單細胞進行排序，利用可視化程序和注釋工具構(gòu)建細胞軌跡，進而將細胞的動態(tài)變化過程進行清晰的展現(xiàn)。在這樣的結(jié)果中一般出現(xiàn)數(shù)個分支點，這些分支節(jié)點的發(fā)生代表著細胞產(chǎn)生了程序性變化，如細胞命運分化。因此，可以對分支事件進行分析，對關(guān)鍵基因?qū)崿F(xiàn)篩選的目的。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序也提供了不同細胞類型之間基因的差異表達數(shù)據(jù)[68]。因此，針對不同細胞類型的差異基因進行富集分析(GO、KEGG、Reactome、GSEA、GSVA等[69-74])，可以更好的了解每種細胞類型參與的生物學(xué)功能，比較不同細胞類型的信號通路差異，揭示生物學(xué)過程中的關(guān)鍵分子機制。

對于雄性動物睪丸中的細胞而言，通過對其特異性基因進行篩選，可以更加準確的對細胞參與的相關(guān)進程機制進行解讀，同時也可以更好的把握細胞發(fā)育的階段和其動態(tài)性變化。Yang等[75]分析鑒定了綿羊生殖細胞的幾個階段特異性標記基因，如EZH2、SOX18、SCP2、PCNA和PRKCD等。這一發(fā)現(xiàn)對綿羊精子發(fā)生和生精細胞發(fā)育提供了新的見解。Sun等[76]篩選出胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、性腺原始生殖細胞(gonad primordial germ cells，gPGCs)和精原干細胞可變剪切中的階段特異性基因NANOG、POU5F3、LIN28B、BMP4、STRA8和LHX9等，這一發(fā)現(xiàn)全面深入的解讀了雞生殖細胞可變剪切事件的機制。Yu等[77]的研究篩選出精原細胞在精子發(fā)生過程中的特異性候選標記基因為TKTL1和AES。同樣Zhang等[78]的研究也在4個不同的精原細胞亞群中鑒定了CD99和PODXL2分別作為未分化和分化精原細胞新的細胞表面標記物。這一發(fā)現(xiàn)為豬的精子發(fā)生提供了有價值的信息，同時也為鑒定參與雄性生殖細胞發(fā)育的關(guān)鍵分子標記奠定了基礎(chǔ)。

對于雌性動物的卵母細胞而言，處于不同發(fā)育階段或不同環(huán)境條件下，其相關(guān)基因會出現(xiàn)差異性表達，對此進行分析可以從根本上探究卵母細胞出現(xiàn)變化的相關(guān)機制和具體原因。Li等[79]的研究中對驢卵母細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了24 164個卵母細胞基因，其中9 073個在GV期和MII期卵母細胞中顯著差異表達；進一步的GO 和 KEGG富集分析表明，這些基因與減數(shù)分裂細胞周期、線粒體活性和N-聚糖生物合成相關(guān)，可能是影響驢卵母細胞成熟的關(guān)鍵基因和調(diào)控機制。這一發(fā)現(xiàn)解釋了驢GV期和 MII期卵母細胞的基因表達模式以及影響驢卵母細胞成熟的調(diào)節(jié)機制。Ruihuan等[80]通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠卵母細胞經(jīng)過玻璃化冷凍、解凍后，經(jīng)過體外受精形成的MII期胚胎中有1 575個基因發(fā)生了顯著的變化。最顯著改變的生物學(xué)途徑是氧化還原這一過程，這種轉(zhuǎn)錄組學(xué)的改變與MII期卵母細胞特異性組蛋白H1FOO基因的水平下降有關(guān)，該研究從分子水平對卵母細胞玻璃化冷凍如何影響后續(xù)小鼠植入前胚胎發(fā)育進行了探究。

當(dāng)卵母細胞、精原細胞通過減數(shù)分裂、有絲分裂等過程發(fā)育成卵細胞和精子并結(jié)合為受精卵后，對受精卵發(fā)育至胚胎過程中相關(guān)基因表達差異性的研究也能讓研究者更為深入的探究和解讀動物繁殖進程的機制。李田田等[81]的研究利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對處于早期(16～22 h)和晚期(26～32 h)的豬卵裂胚胎進行測序，富集分析篩選出了有關(guān)胚胎發(fā)育能力的相關(guān)基因，這一發(fā)現(xiàn)深入挖掘了卵裂時期與胚胎發(fā)育的關(guān)聯(lián)性關(guān)鍵信息。

4 總結(jié)和展望

動物繁殖過程包括多種錯綜復(fù)雜且動態(tài)變化的機制，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)僅僅從基因和表型層面對其進行分析，不能進行動態(tài)分析。但是單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以聚焦于單個細胞，更加直觀的將細胞與相關(guān)基因進行聯(lián)系，捕獲之前研究缺失的細胞時序性動態(tài)變化過程以及細胞間的互作效應(yīng)[82-83]。研究人員將這一技術(shù)應(yīng)用到動物繁殖過程的研究中，可以從轉(zhuǎn)錄組角度直接對生殖細胞進行聚類，并且對相同作用的細胞進行分群得到不同的細胞簇。同時也可以獲取在繁殖機制中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因以及相關(guān)通路。但是目前，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也面臨著一些挑戰(zhàn)，如測序費用昂貴，擴增的過程存在偏好，容易出現(xiàn)假陽性等問題[84-85]。在后續(xù)的發(fā)展中研究人員可以針對相關(guān)問題進行改進，進一步提高測序效率，增加測序準確性，降低測序費用?？梢灶A(yù)見的是，隨著單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展和完善，其對于理解動物繁殖機制，提高動物繁殖力將會提供更大的幫助，發(fā)揮更重要的實質(zhì)性作用。同樣，在今后的研究中也可以將動物的繁殖過程作為相關(guān)模型，為人類生殖相關(guān)疾病的治療提供參考[86-87]。也可以將單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與其他組學(xué)分析相結(jié)合以便更全面的對生命機制進行分析解讀[88-89]。