王 斌，靳夢(mèng)月，胡雨虹，譚忠陽(yáng)，常軍

（沈陽(yáng)理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110159）

目前，細(xì)菌感染和疾病很常見(jiàn)，通常用抗生素治療，但病原菌多耐藥性的出現(xiàn)降低了抗生素的有效性[1]。常規(guī)抗生素的頻繁和不適當(dāng)使用導(dǎo)致臨床治療效果降低[2]，而無(wú)機(jī)抗菌劑不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此，備受人們青睞。納米銀顆粒（AgNPs）作為抗菌試劑具有良好的耐熱性[3]，滅菌持久性和廣譜抗菌性[4,5]，并且作用模式是與細(xì)胞壁直接接觸，不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，提高了抗菌效果[6]。但納米銀容易在溶液中聚集，會(huì)降低納米銀的抗菌性能[7]，且納米銀粒子很難從溶液中分離，這很大程度上限制了納米銀粒子的應(yīng)用，而通過(guò)載體負(fù)載納米銀是一種很好的解決方法。

硅藻土（DE）主要由古代硅藻的遺骸組成，其規(guī)則而獨(dú)特的三維孔道使其具備一些特殊的物理化學(xué)性質(zhì)[8]，包括高孔隙率、親水性、高比表面積和高吸附特性，并且價(jià)格低廉[9,10]，具備很好的生物相容性，適合作為載體材料。Hanh[11]等人提出通過(guò)電子束輻照AgNO3溶液和硅藻土的混合液將Ag+還原為AgNPs 沉積到DE 上，但這種方法效率較低，制備的產(chǎn)物載銀量也比較低。為了提高產(chǎn)物載銀量，本研究采用二步法制備載銀硅藻土，考察了紫外輻照時(shí)間，銀氨溶液濃度，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)產(chǎn)物載銀量的影響，探索出最佳載銀工藝條件，采用XRD、SEM 及能譜對(duì)載銀硅藻土進(jìn)行表征，并對(duì)產(chǎn)物通過(guò)抑菌圈試驗(yàn)和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)進(jìn)行抗菌效果測(cè)試。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

硅藻土（CP 吉林省嘉鵬硅藻土研發(fā)有限責(zé)任公司）；葡萄糖（沈陽(yáng)市新興試劑廠）、AgNO3（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、HCl、NH3·H2O（天津大茂化學(xué)試劑廠）、HNO3（沈陽(yáng)市新華試劑廠）、NH4Fe（SO4）2（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）、NH4SCN（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），以上均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

6511 型電動(dòng)調(diào)速攪拌器（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；101-1ES 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；WFH-203 型三用紫外分析儀（上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司）；KQ-50B 型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；303-00A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市天泰儀器有限公司）；JSM280G 型蒸汽滅菌鍋（寧波久興醫(yī)療器械有限公司）；XMT 型水浴鍋（余姚市雅興儀器儀表有限公司）；KSW-6-12 型馬弗爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；XRD-6100 型X-射線衍射儀（日本島津公司）；S-3400N 型掃描電子顯微鏡（荷蘭Philips 公司）；Evolution201 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.3 硅藻土的活化

將10g 硅藻土浸入50mL 3mol·L-1的HCl 溶液中，在60℃水浴鍋中浸泡2h，將硅藻土過(guò)濾取出，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，然后用超聲波振蕩5min，最后將硅藻土盛放于坩堝中，置于450℃馬弗爐中焙燒2h，即得到充分活化的硅藻土。

1.4 載銀硅藻土的制備

取0.5g 活化后的硅藻土浸入10mL 0.05mol·L-1的AgNO3溶液中，同時(shí)用254nm 和365nm 紫外燈照射一定時(shí)間，使硅藻土上生長(zhǎng)銀種子。利用10mL不同濃度AgNO3溶液和2%NH3·H2O 制備銀氨溶液，將制備好的銀氨溶液加入5mL 0.2mol·L-1葡萄糖溶液中，將帶有銀種子的硅藻土浸漬于該溶液中，水浴條件下一定時(shí)間使銀種子生長(zhǎng)為納米銀后取出，即為載銀硅藻土。

1.5 載銀硅藻土載銀量測(cè)試

使用佛爾哈德法[12]進(jìn)行載銀量測(cè)試，取0.2g 載銀硅藻土于250mL 錐形瓶中，加入20mL 50% HNO3后充分振蕩分散，將錐形瓶放入75℃水浴鍋中不斷搖動(dòng)加熱30min，取出并加入80mL 水，冷卻至室溫，加入1mL NH4Fe（SO4）2飽和溶液作為指示劑，使用0.04878mol·L-1的NH4SCN 作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行滴定，直到溶液呈粉紅色，搖動(dòng)振蕩30s，溶液沒(méi)有發(fā)生褪色即到達(dá)滴定終點(diǎn)，最終的載銀量按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中 C：NH4SCN 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；V：消耗NH4SCN 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積mL；m：載銀硅藻土的質(zhì)量g；107.87：銀的摩爾質(zhì)量g·mol-1。

1.6 抑菌圈測(cè)試

采用抑菌圈實(shí)驗(yàn)對(duì)載銀硅藻土進(jìn)行抑菌性能的測(cè)試，選用大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（S.aureus）作為測(cè)試菌種。首先將固體培養(yǎng)基加熱融化后倒入培養(yǎng)皿中，等待融化后的培養(yǎng)基重新冷卻凝固后分別加入1D E.coli 和S.aureus，用玻璃棒將菌懸液涂抹均勻，然后取少量載銀硅藻土置于培養(yǎng)基表面，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，測(cè)量抑菌圈寬度。

1.7 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線及最小抑菌濃度（MIC）測(cè)試

通過(guò)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線考察細(xì)菌在40h 內(nèi)的生長(zhǎng)情況，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線就是選取不同的時(shí)間，利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其透光率T。并通過(guò)公式OD600=-lgT 計(jì)算出相應(yīng)的光密度（OD 值）。

首先，將測(cè)試樣品分為空白組，實(shí)驗(yàn)組。在空白組中，在4mL 的液體培養(yǎng)基中加入40μL 菌懸液，37℃培養(yǎng)40h；在實(shí)驗(yàn)組中，分別配制2mL 濃度為15.62，31.25，62.5，125，250μg·mL-1的樣品溶液，將不同濃度的樣品溶液加入到2mL 液體培養(yǎng)基中，然后加入40μL 菌懸液，震蕩均勻，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h。用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)試600nm 處各試管的溶液透光率T。利用公式OD600=-lgT 計(jì)算OD值，然后繪制出OD 值隨時(shí)間的曲線圖。通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線判斷最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 載銀硅藻土最優(yōu)工藝條件確定

以銀含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察紫外輻照時(shí)間，銀氨溶液濃度，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)載銀含量的影響，按L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行。正交試驗(yàn)的因素-水平表見(jiàn)表1，結(jié)果及分析見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表Tab.1 Factors of orthogonal test -horizontal table

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal tests

由表2 可見(jiàn)，對(duì)銀含量影響較大的因素次序是B＞C＞A＞D，最佳條件為A2B3C2D2，即最優(yōu)工藝條件：紫外輻照時(shí)間20min，銀氨溶液濃度0.3mol·L-1，反應(yīng)溫度45℃，反應(yīng)時(shí)間60min。此方案與表中的9 號(hào)最佳條件有兩個(gè)條件不同，但影響其載銀量較為重要的兩個(gè)條件相同，為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，再按照最優(yōu)方案做一組實(shí)驗(yàn)，按照佛爾哈德法測(cè)試載銀量為12.0%，大于11.5%，證明最優(yōu)方案為A2B3C2D2。

2.1.1 輻照時(shí)間的影響 通過(guò)紫外光照射，會(huì)讓AgNO3溶液中產(chǎn)生具有還原能力的水化電子和自由基團(tuán)，它們可以將溶液中的Ag+還原為納米銀。具體過(guò)程為：首先在硅藻土上產(chǎn)生銀種子，隨著紫外輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，銀種子變多，有利于接下來(lái)在葡萄糖溶液中銀種子生長(zhǎng)為納米銀粒子，而照射時(shí)間過(guò)久，會(huì)將一部分銀種子還原成納米銀，但對(duì)于最終產(chǎn)物的載銀量影響不大。

2.1.2 銀氨溶液濃度的影響 通過(guò)正交試驗(yàn)極差分析可以看出，銀氨溶液的濃度對(duì)產(chǎn)物的載銀量有著重要影響，當(dāng)銀氨溶液濃度為0.05mol·L-1時(shí)，由于銀氨溶液的濃度較低，Ag+較少，使得還原的銀單質(zhì)有限，增加銀氨溶液的濃度時(shí)，可以看出，產(chǎn)物載銀量明顯提高。

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響 反應(yīng)溫度較低時(shí)，葡萄糖對(duì)于Ag+的還原速率較低，只有少量的銀種子生長(zhǎng)為納米銀，隨著溫度的升高，一方面，加快了硅藻土上的銀種子生長(zhǎng)為納米銀的速率，另一方面，使混合溶液體系中大量Ag+形成晶核，進(jìn)一步生成納米銀粒子，使產(chǎn)物載銀量升高。反應(yīng)溫度過(guò)高，溶液中生成的納米銀粒子會(huì)因布朗運(yùn)動(dòng)的加劇導(dǎo)致不斷地發(fā)生碰撞，納米銀粒子會(huì)發(fā)生團(tuán)簇，生成粒徑較大的銀單質(zhì)于溶液中，不能很好的負(fù)載于硅藻土微孔中，導(dǎo)致產(chǎn)物載銀量降低。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間的影響 通過(guò)正交試驗(yàn)可以看出，反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物載銀量的影響不大。反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，銀種子不能很好的生長(zhǎng)為納米銀粒子，從而導(dǎo)致產(chǎn)物載銀量較低，而延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間有利于提高產(chǎn)物的載銀量。

2.2 XRD 分析

載銀硅藻土和硅藻土的XRD 圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 載銀硅藻土和硅藻土XRD 圖譜Fig.1 XRD patterns of silver bearing diatomite and diatomite

由圖1 可見(jiàn)，載銀硅藻土在38.1°，44.22°，64.4°，77.42°處出現(xiàn)的4 個(gè)峰為銀的特征峰，分別對(duì)應(yīng)納米銀粒子的（111）、（200）、（220）、（311）晶面，而硅藻土并沒(méi)有這幾個(gè)特征峰，證明納米銀單質(zhì)已經(jīng)很好的負(fù)載于硅藻土的表面及孔道中，為面心立方結(jié)構(gòu)。

2.3 掃描電鏡及能譜分析

硅藻土和載銀硅藻土的掃描電鏡見(jiàn)圖2。

圖2 硅藻土和載銀硅藻土掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of diatomite and silver bearing diatomite

由圖2 可見(jiàn)，此種活化后的硅藻土為中空管狀多孔結(jié)構(gòu)且表面光滑沒(méi)有雜質(zhì)，而載銀硅藻土表面附著明顯的小顆粒，這些小顆粒極大可能為銀單質(zhì)，為了進(jìn)一步確定這一判斷，進(jìn)行能譜分析。

圖3 為載銀硅藻土的電子圖像和EDS 分層圖像。

圖3 載銀硅藻土的電子圖像和EDS 分層圖像Fig.3 Electronic image and EDS layered image of silver bearing diatomite

由圖3 可見(jiàn)，納米銀均勻的分散在硅藻土中且載銀量為12.39%，與佛爾哈德法測(cè)試的含銀量相似，載銀量較高。

2.4 載銀硅藻土的抑菌性測(cè)試

圖4 為硅藻土對(duì)不同菌種的抑菌圖。

圖4 硅藻土對(duì)不同菌種的抑菌圖Fig.4 Bacteriostatic diagram of diatomite on different strains

由圖4 可見(jiàn)，未負(fù)載納米銀的硅藻土對(duì)兩個(gè)菌種均無(wú)抑菌效果，細(xì)菌能夠在培養(yǎng)基上很好的生長(zhǎng)繁殖。

圖5 為載銀硅藻土對(duì)不同菌種的抑菌圖。

圖5 載銀硅藻土對(duì)不同菌種的抑菌圖Fig.5 Bacteriostatic diagram of silver bearing diatomite on different strains

由圖5 可見(jiàn)，制備的載銀硅藻土均為黑色粉末，粉末周圍有明顯的抑菌圈，測(cè)量?jī)蓚€(gè)抑菌圈的直徑分別為16mm 和11mm，說(shuō)明載銀硅藻土對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)都具有明顯的抑制作用。這是因?yàn)檩d銀硅藻土持續(xù)地釋放銀離子與細(xì)菌接觸，能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的成分。Ag+還能通過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部，使細(xì)菌合成酶的活性受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生功能障礙而死亡。

2.5 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線及最小抑菌濃度測(cè)試

為了更好地研究載銀硅藻土的抑菌性能，進(jìn)行了細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)試，并通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線判斷出產(chǎn)品的最小抑菌濃度。

圖6 為含有不同濃度載銀硅藻土的大腸桿菌液體培養(yǎng)基OD600值曲線。

圖6 不同濃度載銀硅藻土的大腸桿菌的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線Fig.6 Bacterial growth curve of E.coli containing different concentrations of silver bearing diatomite

圖7 為含有不同濃度載銀硅藻土的金黃色葡萄球菌液體培養(yǎng)基OD600值曲線。

圖7 不同濃度載銀硅藻土的金黃色葡萄球菌的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線Fig.7 Bacterial growth curve of Staphylococcus aureus containing different concentrations of silver bearing diatomite

由圖6、7 可知，在16h 以內(nèi)時(shí)，15.62g·mL-1的載銀硅藻土便能對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)起到一定抑制作用，通過(guò)觀察24h 大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線，最小抑菌濃度穩(wěn)定在250μg·mL-1，能夠完全抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，說(shuō)明通過(guò)不斷的釋放Ag+，可以發(fā)揮持久的抑菌效果，且對(duì)大腸桿菌的抑菌性略優(yōu)于金黃色葡萄球菌。這可能是因?yàn)榇竽c桿菌屬于革蘭氏陰性菌，而金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁比大腸桿菌的厚，Ag+穿透到金黃色葡萄球菌內(nèi)比較困難，導(dǎo)致對(duì)大腸桿菌的抑菌性優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過(guò)活化的硅藻土表面暴露出微孔，為中空管狀多孔結(jié)構(gòu)且表面光滑沒(méi)有雜質(zhì)，能夠作為良好的載體使納米銀負(fù)載于硅藻土表面和微孔中，從而達(dá)到抑菌效果。

（2）采用二步法負(fù)載納米銀提高了硅藻土的載銀量，通過(guò)正交試驗(yàn)確定了最佳工藝條件：紫外輻照20min，AgNO3溶液濃度為0.3mol·L-1，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時(shí)間為60min。能譜測(cè)得此工藝條件下硅藻土載銀量高達(dá)12.39%，通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線判斷產(chǎn)物最小抑菌濃度為250μg·mL-1。