張曉君 奇國棟 楊淼森 翁婷 梁麗媛 王德強(qiáng)

1（東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林132012）

2（中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714）

3（中國科學(xué)院大學(xué)重慶學(xué)院，重慶 400714）

納米通道電學(xué)檢測技術(shù)是一類利用孔道直徑在納米尺度的材料進(jìn)行電化學(xué)檢測的單分子傳感技術(shù)。自從第一個生物納米孔傳感器α-溶血素問世以來，在過去的幾十年內(nèi)，納米孔傳感器引起了越來越多的關(guān)注，不論是制備納米孔的載體材料還是器件的傳感原理都有了很多突破?；诩{米通道的單分子分析平臺因具有獨(dú)特的納米結(jié)構(gòu)和靈敏的電學(xué)響應(yīng)性而被廣泛應(yīng)用于材料、能源、生物醫(yī)學(xué)、生態(tài)和安防等領(lǐng)域[1-4]。

目前，隨著對納米孔傳感器檢測原理探究的深入以及新型薄膜材料的拓展，納米孔道傳感器除了傳統(tǒng)的生物納米孔與固態(tài)納米孔器件，還衍生出了結(jié)合多種材料體系優(yōu)勢的雜化納米孔體系，已有相關(guān)文獻(xiàn)分別對這幾類納米孔傳感器及應(yīng)用進(jìn)行了綜述介紹[5-8]。本文基于不同的納米孔制備材料體系，分別對這三類納米孔的最新研究進(jìn)展及應(yīng)用進(jìn)行介紹，并對其未來的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 生物納米孔

生物納米孔是由天然蛋白質(zhì)單體自組裝形成的寡聚體通道，是最早用于生物分子選擇性易位的納米孔，具有高度可重現(xiàn)的孔結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的孔內(nèi)環(huán)境等顯著優(yōu)勢[9-10]。目前應(yīng)用較多的生物跨膜通道蛋白有金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-HL）、恥垢分枝桿菌毒素蛋白A（MspA）、氣單胞菌溶素（Ael）、細(xì)胞溶血素A（ClyA）和噬菌體Phi29（Phi29）等[11]。

1.1 α-HL

α-HL 是由金黃色葡萄球菌分泌的一種多肽毒素[12]，可組裝成蘑菇狀七聚體插入到磷脂雙分子層中形成跨膜通道（圖1A）。α-HL 納米孔由帽狀結(jié)構(gòu)域和β-桶狀結(jié)構(gòu)域（5 nm）兩部分組成，由直徑為1.4 nm的內(nèi)縮頸分開，是第一個被用于生物單分子檢測的納米孔[13]。最近，Liu 等[14]將α-HL 納米孔與質(zhì)譜（MS）和分子動力學(xué)（MD）模擬等技術(shù)結(jié)合，研究了陽離子肽LL-37 的兩個片段（D180 與G550）的寡聚狀態(tài)。根據(jù)D180 與G550 在α-HL 納米孔中的孔堵塞頻率，作者發(fā)現(xiàn)D180 表現(xiàn)出形成二聚體的趨勢，而G550 表現(xiàn)出形成高階低聚物的趨勢，并結(jié)合MS 和MD 兩項(xiàng)技術(shù)對該現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究將多種技術(shù)相結(jié)合，有望在單分子水平上揭示寡聚體動力學(xué)和其它肽的微弱分子間相互作用。

圖1 生物納米孔結(jié)構(gòu)示意圖[12]：（A）α-溶血素（α-HL）；（B）恥垢分枝桿菌毒素蛋白A（MspA）；（C）氣單胞菌溶素（Ael）；（D）細(xì)胞溶血素A（ClyA）；（E）噬菌體Phi29（Phi 29）Fig.1 Schematic diagram of biological nanopore structure[12]: (A) α-Hemolysin(α-HL);(B) Mycobacterium smegmatisporin A (MspA);(C) Aerolysin (Ael);(D) Cytolysin A (ClyA);(E) Bacteriophage Phi29 (Phi29)

1.2 MspA

MspA 是來源于恥垢分枝桿菌的毒素蛋白[15]，具有短而窄（～1.2 nm 寬、～0.6 nm 長）的納米通道，形狀像煙囪（圖1B）。MspA 納米孔具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，與α-HL 納米孔相比，MspA 納米孔可對具有一定離子電流阻滯信號差異的4 個單堿基的均聚物進(jìn)行分辨[16]，也易于對多位點(diǎn)進(jìn)行突變修飾，是一種具有良好發(fā)展前景的生物納米孔材料。南京大學(xué)Huang 研究組[17]通過MspA 納米孔區(qū)分了鈣調(diào)素蛋白的3 種構(gòu)象（有無鈣離子和與目標(biāo)肽結(jié)合）變化，這是首次利用MspA 納米孔對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化進(jìn)行無標(biāo)記檢測。最近，該研究組采用機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的MspA 電滲透勢阱實(shí)現(xiàn)了對不同電荷蛋白質(zhì)的高分辨識別[18]。

1.3 Ael

Ael 是從嗜水氣單胞菌中提取的β成孔蛋白，具有直徑1.0～1.7 nm 的納米通道，形狀類似α-HL，但在cis 端沒有前庭結(jié)構(gòu)（圖1C）。Long 研究組[19-23]通過突變Ael 納米孔內(nèi)特定的氨基酸成功實(shí)現(xiàn)了對不同長度的寡核苷酸（2～20 堿基長）的檢測。Li 等[24]通過化學(xué)衍生化反應(yīng)將芳香族標(biāo)簽引入聚糖中，在Ael納米孔中首次實(shí)現(xiàn)了對不同的聚糖異構(gòu)體、不同長度（單糖基數(shù)量為2～5）的聚糖以及支鏈聚糖的鑒定，促進(jìn)了納米孔聚糖分析技術(shù)的發(fā)展。

1.4 ClyA

ClyA 是一種由多種細(xì)菌合成的毒素[25]，通過自發(fā)組裝形成長度為13 nm 的圓柱形ClyA 納米孔（圖1D）。ClyA 納米孔是一種新型生物納米孔，相對于其它生物納米孔，具有較高的信噪比（SNR），可用于檢測中小分子量蛋白質(zhì)[26]。Zhang 等[27]設(shè)計(jì)了一種模塊化納米孔傳感器，將4 種納米抗體（Ty1、2Rs15d、2Rb17c 和nb22）設(shè)計(jì)成可替換模塊，通過5～6 nm 的DNA 雙鏈固定在ClyA 上，分別特異性識別高分子量蛋白SARS-CoV-2 刺突蛋白、中等分子量蛋白HER2 受體和低分子量蛋白鼠尿激酶型纖溶酶原激活酶（muPA）。

1.5 Phi29

Phi29 連接器是一種連接病毒頭部和尾部的蛋白質(zhì)，主要由12 個亞基組成[28]。這些亞基組裝形成具有錐形結(jié)構(gòu)（最窄的收縮孔直徑為3.6 nm，寬端直徑為6.0 nm）的納米孔（圖1E），適用于檢測分析物[29]。最近，Zhang 等[30]利用Phi29 納米孔在臨床抽取液的樣本中成功檢測出乳腺癌生物標(biāo)志物（GAL3 結(jié)合蛋白）（p＜0.05）。

2 固態(tài)納米孔

與蛋白或多肽自組裝跨膜離子通道相比，固態(tài)納米通道是通過電子束、離子束、激光輔助、電介質(zhì)擊穿或化學(xué)刻蝕等[1,31]方法在無機(jī)/有機(jī)薄膜上加工而成。固態(tài)納米孔因具有尺寸可調(diào)性、物化及機(jī)械穩(wěn)定性、易修飾及易與其它技術(shù)集成等特點(diǎn)而受到研究者的關(guān)注，尤其是在生物單分子檢測領(lǐng)域[32-34]。研究不同載體材料的固態(tài)納米孔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與檢測原理具有重要意義。固態(tài)納米孔按載體材料的不同可分為硅基納米孔、碳材料納米孔、聚合物孔、單原子層二維材料孔、金屬-有機(jī)框架（MOFs）和共價有機(jī)框架（COFs）納米孔以及等離基元納米孔等。

2.1 硅基納米孔

硅基納米孔中最常見的載體材料是氮化硅（SiNx）和石英玻璃。2003 年，研究者首次使用電子束和離子束在SiNx薄膜上制備了SiNx納米孔[35-36]。SiNx納米孔具有熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高和孔徑可控等特點(diǎn)，但孔的加工過程重現(xiàn)性低，材料內(nèi)源性噪聲及與生物分子的非特異性吸附等問題也是其實(shí)現(xiàn)測序應(yīng)用的重要限制因素。因此，如何降低材料及檢測體系的噪聲，并開發(fā)新的加工策略以制備穩(wěn)定且堅(jiān)固的SiNx納米孔仍是一個挑戰(zhàn)?；诙趸璧牟ＡЪ{米孔也是目前常見的硅基納米孔。Tang 等[37]設(shè)計(jì)了一種環(huán)介導(dǎo)等溫放大（LAMP）耦合玻璃納米孔計(jì)數(shù)策略，特異性檢測了惡性瘧原蟲（Pf）與間日瘧原蟲（Pv），實(shí)現(xiàn)了定性分析以及Pf 基因組DNA 的定量分析。這種高靈敏度高特異性的傳感策略為實(shí)現(xiàn)簡單、快速和低成本的固態(tài)納米孔單分子檢測的固態(tài)納米孔傳感器的開發(fā)提供了一條新的途徑。

2.2 單原子層二維材料

單原子層二維材料顯著提高了納米孔的空間分辨率，目前報道的制備固態(tài)納米孔的二維材料包括石墨烯、氮化硼（BN）、二硫化鉬（MoS2）、二硫化鎢（WS2）和黑磷等。石墨烯具有超薄的結(jié)構(gòu)與較好的機(jī)械穩(wěn)定性，基于石墨烯的納米孔在單分子測序領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用潛力。但是，石墨烯納米孔的1/f 噪聲非常高，檢測DNA 分子易位的信噪比較低，雖然與堿基間距相當(dāng)?shù)膯螌邮┰诶碚撋嫌型麑?shí)現(xiàn)核酸測序，但實(shí)際應(yīng)用中的材料內(nèi)源噪聲及亞納米孔加工的精度及重現(xiàn)性仍然是石墨烯納米孔測序應(yīng)用的瓶頸問題[38]。將氮化硼（BN）作為納米通道材料的研究較少，主要因?yàn)榈鸺{米結(jié)構(gòu)生長條件非常苛刻，所得材料厚度低于20 nm，對生物單分子的鑒別及選擇性較差。但是，與單元素石墨烯相比，雙元素氮化硼作為微納結(jié)構(gòu)載體材料時具有更豐富的物化性質(zhì)[39]，有望在下一代生物傳感器中得到應(yīng)用。目前，二硫化鉬（MoS2）是一種研究較多的半導(dǎo)體過渡金屬二鹵化物（TMD），單原子層MoS2的厚度約為0.7 nm，具有優(yōu)異的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性[40]。Wang 等[41]利用MoS2納米孔成功地對16 種天然氨基酸進(jìn)行直接識別，分辨率低至1 Da，同時該納米孔也適用于單個氨基酸的磷酸化修飾鑒別，為未來利用納米孔傳感器對單個蛋白質(zhì)分子進(jìn)行直接測序提供了可能（圖2A）。二硫化鎢（WS2）屬于TMD 的一類，也具備優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性與機(jī)械加工強(qiáng)度。Danda 等[42]在懸空硅基芯片上的單層WS2膜上制備了納米孔，探究了WS2納米孔的離子傳導(dǎo)特性和15 kbp 雙鏈DNA 的易位情況，開發(fā)了一種用于生物分子分析的光學(xué)響應(yīng)WS2納米孔傳感器（圖2B），為利用其它TMD 材料制造納米孔并進(jìn)行單分子分析提供了參考。

圖2 （A）二硫化鉬（MoS2）納米孔檢測氨基酸裝置示意圖[41]；（B）用于DNA 分析的光學(xué)響應(yīng)二硫化鎢（WS2）納米孔[42]Fig.2 (A)Schematic diagram of the molybdenum disulfide(MoS2)nanopore detection device for amino acids[41];(B) Optically responsive tungsten disulfide (WS2) nanopores for DNA analysis[42]

2.3 聚合物納米孔

聚合物納米通道具有良好的生物兼容性，并且聚合物納米通道內(nèi)分布的多官能團(tuán)是潛在的修飾位點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)孔內(nèi)特異性功能化。比較有代表性的聚合物納米孔材料包括聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯（PC）和聚酰亞胺（PI）等。聚合物納米孔的制備及修飾步驟主要包括徑跡刻蝕、化學(xué)刻蝕和功能化修飾。首先，徑跡刻蝕通過高能重離子輻照穿透聚合物膜產(chǎn)生潛在徑跡；然后，利用化學(xué)刻蝕該區(qū)域從而得到不同形狀、不同孔徑大小的納米孔，目前制備的聚合物納米孔最小可達(dá)2.4～9.7 ?[43]；最后，通過共價修飾在納米孔內(nèi)引入特異性功能基團(tuán)或小分子。Peinetti 等[44]將DNA 適配體修飾到PET膜上，利用該傳感器對腺病毒和新冠病毒進(jìn)行了選擇性檢測和傳染性區(qū)分，使得這類傳感器可以快速、直接和選擇性地對當(dāng)前或新出現(xiàn)的病毒進(jìn)行檢測和區(qū)分（圖3）。

圖3 形成適配體功能化的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）納米孔和對腺病毒選擇性測定方案[44]Fig.3 Schematic diagram for formation of aptamer-functionalized polyethylene terephthalate (PET) nanopores and selective determination of adenovirus[44]

2.4 碳材料納米孔

碳材料類別十分豐富，主要分為零維（富勒烯）、一維（碳納米管）、二維（石墨烯、碳膜、金剛石）以及三維（石墨烯泡沫）碳材料等[45]。近二十年來，有關(guān)碳材料的研究發(fā)展迅速，利用碳基薄膜材料制備納米通道進(jìn)行單分子傳感分析也是研究熱點(diǎn)之一。

在各種碳材料中，碳納米管（CNTs）的發(fā)展和應(yīng)用比較成熟。按照生長的管壁數(shù)量，CNTs 可分為單壁（SWCNTs）、雙壁和多壁（MWCNTs）碳納米管；按導(dǎo)電性，CNTs 可分為金屬型和半導(dǎo)體型管碳納米管[46]。每根碳管都有獨(dú)立的手性，如將碳管作為離子通道，內(nèi)徑約1 nm 的單壁半導(dǎo)體單手性管是首選。Liu 等[47]通過將超短SWCNTs 插入脂質(zhì)雙層構(gòu)建納米通道，并將其用于研究離子傳輸和DNA 易位（圖4A），實(shí)現(xiàn)了選擇性檢測單鏈DNA 中修飾的5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。碳納米管具有超長時間分辨率，有利于區(qū)分不同堿基序列。相比SWCNTs，MWCNTs 性質(zhì)更復(fù)雜，到目前為止尚未用于DNA 分析。Henriquez 等[48]開發(fā)了一種在MWCNTs 上制備直徑范圍為50～160 nm 單通道的方法，為MWCNTs 用于單分子檢測提供了新策略。

圖4 （A）顯微注射探針裝置示意圖（上）和單鏈DNA 通過單壁碳納米管（SWCNTs）納米孔時的典型電流信號圖（下）[47]；（B）掃描透射電子顯微鏡電子束（STEM EB）和介質(zhì)擊穿（DB）兩種方法在商用的碳薄膜上制備納米孔示意圖[50]Fig.4 (A) Schematic diagram of the microinjection probe device (top) and typical current signals of singlestranded DNA as it passes through the single walled carbon nanotubes (SWCNTs) nanopore (bottom)[47];(B) Preparation of nanopores on commercially available carbon films by two methods,scanning transmission electron microscope electron beam (STEM EB) and dielectric breakdown (DB)[50]

碳膜納米孔是在碳材料所成的膜上制備具有納米尺寸的孔道結(jié)構(gòu)，其制備過程主要分為碳膜生長、膜轉(zhuǎn)移及膜上納米結(jié)構(gòu)制備等。本研究組與北京大學(xué)合作，在納米晶石墨膜上制備小尺寸納米通道，成功用于λ-DNA 的穿孔行為研究[49]。Takai 等[50]采用掃描透射電子顯微鏡電子束（STEM EB）和介質(zhì)擊穿（DB）兩種方法在6 nm 或10 nm 厚的非晶碳薄膜涂層組成的微網(wǎng)格上制備納米孔（圖4B）。在STEM EB方法中，孔徑可以被精確控制，每個孔的制備時間在90 min 內(nèi)。但是，在DB 方法中，由于碳膜具有導(dǎo)電性，雖然制備納米孔的程序和設(shè)備更簡單，但制備時間比STEM EB 方法長，并且成孔時電流迅速增加，導(dǎo)致無法對孔徑精確控制。

2.5 MOFs和COFs納米孔

MOFs 由金屬團(tuán)簇和有機(jī)配體構(gòu)成，具有幾乎等同于沸石的晶體結(jié)構(gòu)，并且其結(jié)構(gòu)多樣，具有優(yōu)越的可設(shè)計(jì)性以及物理和化學(xué)性質(zhì)。因此，基于多孔MOFs 材料的傳感檢測研究不斷增加，基于多孔MOFs和COFs 材料的傳感檢測都是基于分子骨架設(shè)計(jì)和共價鏈接分子的長度調(diào)節(jié)MOFs 和COFs 材料孔道尺寸。Yamamoto 等[51]研究了MOFs 納米孔中的主客體電荷轉(zhuǎn)移事件。通過將合成后的供體分子插入帶有電子接受基團(tuán)的柔性MOFs 中，成功獲得了兩個MOFs 客體電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。雖然供體物種和受體物種之間的氧化還原電位差很大，但在該MOFs 納米孔中可以協(xié)同實(shí)現(xiàn)均勻分布和限制，這種協(xié)同效應(yīng)稱為“MOFs 誘導(dǎo)的電荷轉(zhuǎn)移”。Zhang 等[52]利用電泳方法成功制備了由SiNx襯底支撐的MOFs 納米孔。MOFs 納米孔的直徑范圍在0.88～1.24 nm 之間，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。該研究探究了不同表面電荷、疏水性和孔徑的MOFs 納米孔的離子傳輸特性，進(jìn)一步證實(shí)了協(xié)同機(jī)制。MOFs 納米孔為發(fā)現(xiàn)新的離子傳輸機(jī)制提供了一個新的平臺，也拓展了新型固態(tài)納米孔的應(yīng)用范圍。

COFs 是一種由有機(jī)建筑單元構(gòu)成的新型多孔晶體材料，其顯著特點(diǎn)是具有可調(diào)、可設(shè)計(jì)和可功能化的納米空間。因此，利用COFs 內(nèi)的納米空間為制備納米孔傳感器提供了可能性。Yuan 等[53]首次報道了COFs 納米孔用于氨基酸選擇性識別的研究（圖5A）。首先通過C3對稱三乙醛和含有或不含有二乙烯基的二胺混合物的亞胺縮合，得到兩種乙烯基官能化COFs。這兩種多變量COFs 都提供了由層狀六角形網(wǎng)絡(luò)的AA 或AB 堆疊形成的一維直納米孔。將COFs 進(jìn)行β-環(huán)糊精（β-CD）修飾，制備成能夠選擇性運(yùn)輸氨基酸的獨(dú)立混合基質(zhì)膜（MMM）。作者通過監(jiān)測跨膜離子電流的特征和滲透基質(zhì)的濃度變化，揭示了不同COFs 結(jié)構(gòu)的手性識別能力。COFs 的有機(jī)骨架與生物分子之間具有很高的親和力，大大減緩了DNA 通過COFs 納米孔的速度。Xing 等[54]將2 個孔徑分別為1.1 nm（COFs-1.1）和1.3 nm（COFs-1.3）的超薄COFs 納米片剝離，利用電泳使其緊密覆蓋在孔徑為（20±5）nm 的石英納米移液管上，形成COFs納米孔（圖5B）。在此納米孔中發(fā)現(xiàn)了與二維材料相比最慢的DNA 傳輸速度（270 μs/base）。在此納米孔基礎(chǔ)上進(jìn)行短至6 個堿基的DNA 均聚物的易位檢測，通過易位時間對不同長度的DNA 均聚物進(jìn)行了識別[55]。該研究為基于COFs 納米孔的DNA 測序提供了新的方向。

圖5 （A）共價有機(jī)框架（COFs）納米孔用于氨基酸對映選擇性運(yùn)輸示意圖[53]；（B）基于COFs 的原子可控納米孔的DNA 分析示意圖[54]Fig.5 (A) Diagram of covalent organic frameworks (COFs) nanopore for enantioselective transport of amino acids[53];(B) Schematic diagram of COFs-based atomically controllable nanopore analysis of DNA[54]

2.6 等離基元納米孔

等離基元納米孔是一種在固態(tài)納米通道中引入能產(chǎn)生等離子體共振效應(yīng)的金屬結(jié)構(gòu)而獲得的功能性納米通道。通常，等離基元納米孔的制備主要分為納米孔通道的制備、金屬結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與蒸鍍或沉積等步驟。目前的等離基元納米結(jié)構(gòu)主要包括蝴蝶結(jié)天線、等離子體靶心納米結(jié)構(gòu)、等離子體納米阱和等離子體納米腔。

Jonsson 等[56]將金蝴蝶結(jié)納米天線與固態(tài)納米孔相結(jié)合，在等離子體系統(tǒng)內(nèi)制造了納米孔（圖6A）。該研究組還將等離子體系統(tǒng)與表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）測量相結(jié)合，對DNA 測序的可行性進(jìn)行了理論研究[57]。最近，該研究組將等離子納米天線與固態(tài)納米孔相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對10 kbp 雙鏈DNA 分子的無標(biāo)記光學(xué)傳感[58]。此外，該研究組還制造了倒蝴蝶結(jié)等離子體納米孔，在透射光強(qiáng)度下利用此結(jié)構(gòu)對λ-DNA 的易位進(jìn)行了光學(xué)檢測[59]。所制造的等離子體納米孔傳感器與傳統(tǒng)的單分子傳感器相比，在時間分辨率、易位時間、靈敏度和檢測帶寬等方面均顯著改進(jìn)，并且可在并行陣列中進(jìn)行大規(guī)模制造，為高通量光學(xué)單分子傳感提供了方向和策略。

圖6 （A）金蝴蝶結(jié)納米天線等離子體納米孔制造示意圖[56]；（B）在Au 涂層的SiNx 膜上制備等離子體靶心結(jié)構(gòu)裝置圖[60]；（C）等離子體納米阱納米孔（PNW-NP）器件裝置圖[62]；（D）等離子體納米腔集成的SiNx 納米孔裝置及測試圖[63]Fig.6 (A) Schematic diagram of the fabrication of a plasma nanopore for a gold bowtie nanoantenna[56];(B) Diagram of a plasma bullseye structure prepared on an Au-coated SiNx film[60];(C) Plasmaonic nanowellnanopore (PNW-NP) device diagram[62];(D) Plasma nano-cavity integrated SiNx nanopore device and test diagram[63]

納米孔中的溫度控制對于進(jìn)一步了解生物分子非常重要，可以擴(kuò)大其檢測范圍。Crick 等[60]開發(fā)了一種具有等離子體靶心結(jié)構(gòu)的固態(tài)納米孔器件。該器件是采用FIB 將等離子體靶心結(jié)構(gòu)研磨在Au 涂層的SiNx膜上制得（圖6B），使用632.8 nm 單色光源對納米孔進(jìn)行精確加熱，并考察了納米孔加熱的效率、準(zhǔn)確性和實(shí)用性。該研究組[61]使用新的制造步驟在基于耐熱玻璃襯底的氮化硅（Py-SiNx）納米孔上形成等離子體靶心結(jié)構(gòu)。該平臺能夠以非常低的電噪聲提供精確加熱，可作為檢測和研究單個DNA 分子易位的傳感器。

Assad 等[62]將納米孔嵌入采用金制成的等離子體納米阱中，構(gòu)建了用于熒光增強(qiáng)單分子檢測的等離子體納米阱納米孔（PNW-NP）器件（圖6C），這是電學(xué)與光學(xué)組合測量結(jié)合的首個研究報道。該研究將等離子體結(jié)構(gòu)與單分子納米孔傳感器耦合，探究了PNW-NP 器件的抑制熒光背景、增強(qiáng)熒光信號以及同步光信號和電信號的能力，為基于納米孔的傳感開辟了新的領(lǐng)域。

通過納米孔徑操縱流體傳輸對于許多納流體應(yīng)用如傳感和分離系統(tǒng)非常重要。Li 等[63]將等離子體納米腔與SiNx集成，制造了一種通過調(diào)整整體照明功率來調(diào)節(jié)電阻的等離子體納米孔器件（圖6D）。在激光照明下，該器件可以可逆地導(dǎo)致孔電阻大幅增加（≥500%），同時產(chǎn)生整流離子電流-電壓特性。此外，該器件在高電阻狀態(tài)下可作為可逆離子整流器運(yùn)行，無需對納米孔表面進(jìn)行化學(xué)修飾或改變緩沖液特性。該研究組還考察了激光激發(fā)和改變偏壓對等離子體納米空腔孔的非對稱噪聲的影響[64]。

3 雜化納米孔

與傳統(tǒng)的單一材料所制備的納米孔不同，雜化納米孔是由兩種或多種不同材料組合構(gòu)建的納米通道。通過使用不同材料的組合，雜化納米孔可以融合每種材料的優(yōu)勢，并擴(kuò)展其應(yīng)用領(lǐng)域。

在結(jié)構(gòu)固定的固態(tài)納米孔中嵌入內(nèi)表環(huán)境均一的生物納米孔進(jìn)而形成雜化納米通道，可以提高納米孔的生物相容性、選擇性和信噪比，實(shí)現(xiàn)更精確的單分子結(jié)構(gòu)分析。Hall 等[65]通過電泳易位將α-HL 蛋白插入到SiNx納米孔中，成功形成了第一個功能性雜化納米孔，并利用此納米孔進(jìn)行了單鏈DNA 檢測。Cressiot 等[66]通過電泳易位將耐熱病毒G20c 的親水性門戶蛋白插入到SiNx納米孔中，構(gòu)建了一種新型無脂雜化納米孔（圖7A），并通過此雜化納米孔成功地對雙鏈DNA、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA、TPX3 肽和折疊球狀胰島素蛋白進(jìn)行了檢測。Senl 等[67]將工程外膜蛋白G（eOmpG）插入雙層二硫化鉬（BL-MoS2）中形成雜化納米孔（圖7B），并對dA30 進(jìn)行了檢測，與BL-MoS2固態(tài)納米孔相比，該納米孔噪聲降低了31.7%，電流偏差降低了8%，SNR 提高了1.9 倍。這種新型雜化納米孔為實(shí)現(xiàn)低噪聲和高靈敏的單分子檢測提供了新策略。最近，Wang 等[68]利用細(xì)菌視紫紅質(zhì)（bR）蛋白與SiNx納米孔構(gòu)建了一種生物納米流體裝置，通過生物自供電穩(wěn)態(tài)離子電流納米孔傳感策略（在0 V 外加電壓下），實(shí)現(xiàn)了bR 質(zhì)子泵送活性及其光響應(yīng)的納米流體單分子探測（圖7C），促進(jìn)了生物傳感和能量轉(zhuǎn)換應(yīng)用中雜化納米孔流體裝置的發(fā)展。

圖7 （A）G20c 蛋白插入SiNx 納米孔形成雜化納米孔示意圖[66]；（B）工程外膜蛋白G（eOmpG）插入BL-MoS2 中形成雜化納米孔示意圖[67]；（C）細(xì)菌視紫紅質(zhì)（bR）蛋白插入SiNx 納米孔形成雜化納米孔示意圖[68]Fig.7 (A) Schematic representation of G20c protein inserted into SiNx nanopore to form hybrid nanopore[66];(B) Schematic representation of engineered outer membrane protein G (eOmpG) inserted into BL-MoS2 to form hybrid nanopore[67];(C) Schematic representation of bacterial retinoblast (bR) protein inserted into SiNx nanopore to form hybrid nanopore[68]

近年來，隨著DNA 折紙納米技術(shù)的快速發(fā)展，可以精確地人工合成穩(wěn)定的納米通道結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以通過牽引的方式嵌入到固態(tài)納米孔中形成DNA 折紙納米孔。目前，報道較多的用于雜化納米孔構(gòu)筑的DNA 折紙結(jié)構(gòu)有漏斗形和納米板形。Bell 等[69]合成了頂部面積為27.5 nm×27.5 nm、底部面積為7.5 nm×7.5 nm 的漏斗形折紙結(jié)構(gòu)，通過施加正向電壓將其插入到SiNx納米孔中形成DNA 折紙納米孔（圖8A），并對λ-DNA 進(jìn)行了檢測，為DNA 折紙雜化納米孔用作電阻脈沖傳感器開辟了道路。Zhu 等[70]設(shè)計(jì)合成了尺寸約為60 nm×54 nm、中心具有15 nm×14 nm 矩形孔的DNA 納米板，并將其鋪在SiNx納米孔上方形成DNA 折紙納米孔（圖8B），推測了納米板在納米孔中的遷移有平面、正交和隨機(jī)3 種取向，為使用固態(tài)納米孔研究DNA 折紙的機(jī)械剛性和納米結(jié)構(gòu)的易位動力學(xué)提供了可能。Xing 等[71]開發(fā)了一種不同于傳統(tǒng)設(shè)計(jì)DNA 折紙納米孔的方法，將DNA 雙鏈體組裝成模塊化單元，并將這些單元連接成可調(diào)整的形狀，然后利用孔腔的大尺寸和孔壁受體的精確修飾，可以直接對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。

圖8 （A）漏斗形DNA 折紙納米孔形成示意圖[69]；（B）DNA 納米板與SiNx 納米孔相互作用示意圖[70]Fig.8 (A) Diagram of funnel-shaped DNA origami nanopore formation[69];(B) Schematic representation of the interaction of DNA nanoplate with SiNx nanopore[70]

最近，Yan 等[72]通過分子設(shè)計(jì)和有機(jī)合成工藝共價合成了一種新型納米孔結(jié)構(gòu)。該研究構(gòu)建了一種基于喹啉衍生螺旋的新型仿生人工質(zhì)子通道，其管腔直徑為1 ?，只允許質(zhì)子跨膜滲透，有效地過濾了陽離子、陰離子和水分子。將這種有機(jī)螺旋納米通道與其它納米結(jié)構(gòu)器件融合，有望在一些手性分子的鑒別過程中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)和展望

本文針對納米通道制備的材料體系，介紹了典型的生物納米孔、固態(tài)納米孔及雜化納米通道的應(yīng)用研究進(jìn)展。生物納米孔具有結(jié)構(gòu)高度可重現(xiàn)性、通道內(nèi)表環(huán)境均一、噪聲低以及生物相容性好等顯著優(yōu)勢，但孔的單一化尺寸及支撐生物孔的磷脂雙層的穩(wěn)定性仍制約著生物納米孔的規(guī)?；瘧?yīng)用。相較而言，固態(tài)孔的機(jī)械及物化穩(wěn)定性、尺寸可調(diào)及易修飾和兼容集成等優(yōu)點(diǎn)大大拓展了納米孔器件的應(yīng)用范圍。其中，探索制造不同形狀結(jié)構(gòu)的等離基元納米結(jié)構(gòu)，將大大擴(kuò)展基于納米孔傳感在光電聯(lián)合檢測中的應(yīng)用。相對于以上兩種常見類型的納米孔，將兩種或多種材料的優(yōu)勢相結(jié)合構(gòu)建的雜化納米通道能提供性能更優(yōu)越的單分子分析器件平臺，但不同體系的兼容及漏電流等問題也是復(fù)合體系無法規(guī)避的問題。因此，未來的研究將在納米通道新材料開發(fā)、復(fù)合體系的集成策略及傳感原理創(chuàng)新方面尋求更多的突破，以推動納米通道單分子分析走向?qū)嶋H應(yīng)用。

總之，隨著類型各異的納米孔傳感器檢測原理的不斷創(chuàng)新及材料體系的推陳出新，納米孔傳感器已經(jīng)成為一個重要的分析工具。未來的發(fā)展應(yīng)更加多樣化和綜合化，為科學(xué)研究和技術(shù)創(chuàng)新提供更多的可能性。