郭晏汝，丁麗花，葛家春，張曹旸，劉茂松

（1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.中國城市規(guī)劃設(shè)計研究院，山東，青島 266071；3.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；4.江蘇省常州高級中學(xué)，江蘇 常州 213003）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards 又稱河蟹）是一種常見的經(jīng)濟蟹類。河蟹在海水中繁殖，淡水里生長，喜歡棲息于水質(zhì)清新、水草豐富的淡水湖泊中，營穴居生活。在河蟹池塘養(yǎng)殖過程中,要注意病害防治，在蟹苗和幼蟹階段，有單縮蟲和聚縮蟲附生，附生嚴(yán)重時，會影響幼體的正?；顒雍蛿z食；在幼蟹和成蟹階段,有蟹奴蟲和紅絲蟲寄生，蟹奴蟲寄生嚴(yán)重時肉味惡臭，不可食用[1]。河蟹一旦得病很難醫(yī)治，故以預(yù)防為主,放養(yǎng)前要清塘消毒[2]。

目前，我國河蟹養(yǎng)殖常用的清塘劑有三大類型：農(nóng)藥類主要有菊酯類和有機磷類；化學(xué)類主要有生石灰、漂白粉和氨水；植物類主要有茶粨巴豆和魚藤。這些清塘劑均能達到殺死水中魚蝦類、螺螄、水蚯蚓等水生生物的目的[3，4]。

清塘劑具有使用便利、成本低的優(yōu)點。一些河蟹養(yǎng)殖戶大量使用菊酯類農(nóng)藥清塘。姜禮燔等[5]試驗證明：魚類在清塘凈濃度為0.05 mg/L 條件下24 h 內(nèi)死亡；張婷等[6]研究表明：甲氰菊酯影響鯉（Cyprinus carpio）Na+-K+-ATP 酶活性以及損傷組織，表明清塘劑影響水生生物生長。為探究清塘威、清塘凈及甲氰菊酯三種清塘劑對河蟹生長的影響，本試驗通過室內(nèi)模擬野外養(yǎng)殖，依據(jù)河蟹養(yǎng)殖技術(shù)流程中清塘劑的常規(guī)使用劑量、時效及河蟹生長的規(guī)律，進行生長成活統(tǒng)計、耐缺氧測定、趨避行為觀察，以期為生產(chǎn)中清塘劑的使用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹幼蟹體質(zhì)量為（10±2）g，由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中河蟹養(yǎng)殖基地提供。清塘威（主要成分：30%茶皂素+0.5%煙堿+增效劑）；清塘凈（主要成分：氰戊菊酯20 g/mL）；甲氰菊酯（主要成分：20%甲氰菊酯）。餌料（配方見表1），由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所提供。飼養(yǎng)盒規(guī)格為φ=15 cm，h=24 cm，并添加（510±1）g 池塘底泥。

1.2 方法

添加清塘威為A 組、清塘凈為B 組、甲氰菊酯為C 組，無清塘劑的對照組為D 組，每組設(shè)12 個重復(fù)。

1.2.1 生長觀察試驗

按清塘劑說明書的常規(guī)使用量，分別添加各自組別的1.5 mL 清塘劑加水稀釋至1 500 mL。然后傾入有底泥的飼養(yǎng)盒中浸泡1 周，傾去殘液，再在每個飼養(yǎng)盒中加入1 500 mL 曝氣自來水（模擬清塘消毒）。飼養(yǎng)盒置于22℃～25℃實驗室內(nèi)，每盒投放1只蟹種，每組12 個飼養(yǎng)盒，觀察、記錄幼蟹的初始反應(yīng)。每天根據(jù)河蟹實際攝食量投喂飼料，每周換水一次并觀察河蟹的生長情況，50 d 后統(tǒng)計存活數(shù)（N）及最終體質(zhì)量（WT）。

1.2.2 窒息試驗

在野外三種清塘劑環(huán)境下，即清塘劑（按照各組清塘劑0.1 mL/m2）清塘后的河蟹養(yǎng)殖池塘，定期補水以使水位保持為1.0～1.5 m，飼養(yǎng)50 d 后的河蟹各12 個分別于置于500 mL 廣口瓶中，加水并上覆2 cm 液體石蠟油封閉瓶口。當(dāng)河蟹僵硬不動，輕彈瓶壁乃至搖動瓶體仍無反應(yīng)時，即確認(rèn)死亡，記錄個體死亡所經(jīng)歷時間，此值為該河蟹的缺氧耐受時長，取水樣測定其溶解氧含量值，即為該河蟹的窒息臨界點。

1.2.3 趨避試驗觀察

依據(jù)早期試驗觀察，推測河蟹可能回避清塘劑，為定量描述與分析，設(shè)計了趨避試驗。以“一”字型水迷宮為水環(huán)境選擇的試驗裝置如圖1，探究河蟹對不同清塘劑底泥的趨避性行為學(xué)。

圖1 趨避實驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of avoidance experiment

將A、B、C 組的三種清塘劑100 g 底泥放置于水迷宮（長100 cm、寬10 cm）的兩端選擇區(qū)的一端，另一端為D 組100 g 底泥，清塘劑處理的底泥分為早期（試驗初期新配）和后期（50 d 飼養(yǎng)后）的底泥，每組取自無清塘劑的池塘河蟹30 只，以A 組為例，讓河蟹在水迷宮中作出前期A-D、后期A-D 的選擇，B、C 同理。觀察15 min，記錄試驗蟹的首次選擇結(jié)果及猶豫期時長（t），進行顯著性檢驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 各組河蟹的生長

各組河蟹增重與相對增重率采用以下公式計算：

其中，Wt為河蟹最終體質(zhì)量；Wo為河蟹初始體質(zhì)量。

1.3.2 趨避行為試驗參數(shù)計算

統(tǒng)計每組內(nèi)試驗蟹首次選擇及其猶豫時間（t），即從試驗開始到做出選擇之間的時長，據(jù)此計算選擇動機強度值（motivation intensity,MI）。

其中，T 為總觀察時間；t 為猶豫時間，其單位均為秒（s）。

如果15 min 內(nèi)，試驗蟹沒有做出任何選擇（在靜置區(qū)不動或逃逸），則記為未選擇，定義為凍結(jié)行為者（freezing behavior individual）（以下簡稱“凍結(jié)者”，其MI=0）。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。利用SPSS26.0 統(tǒng)計分析，對底泥趨避行為首次選擇、各組河蟹成活率以及成活河蟹雌占比采用卡方檢驗（Chi-square test）進行檢驗，對動機強度指標(biāo)MI 值使用T 檢驗，對河蟹絕對增重與相對增重率、窒息試驗相關(guān)指標(biāo)、趨避行為凍結(jié)者數(shù)采用單因子方差分析（one-way ANOVA）后，用Duncan 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組河蟹的行為表現(xiàn)

試驗初始，A 組（清塘威）和D 組的大部分河蟹大約1～2 d 的較短時間鉆進泥土中，而B 組（清塘凈）和C 組（甲氰菊酯）中的河蟹則身體貼靠在飼養(yǎng)盒的邊緣，大約一周后大部分才鉆進泥土中。

2.2 存活與生長統(tǒng)計值分析

2.2.1 河蟹成活指標(biāo)

試驗期間，個別河蟹自行堆砌底泥逃逸，最終A 組和D 組為12 個重復(fù)，B 組和C 組為9 個重復(fù)。河蟹成活個數(shù)、初始與最終雌雄個數(shù)、成活率以及最終成活雌河蟹占比統(tǒng)計見表2?？ǚ綑z驗結(jié)果表明：組間河蟹成活率差異不顯著，最終成活河蟹雌性占比均無顯著差異，表明清塘劑對河蟹的存活無顯著性影響，對雌雄個體毒性也沒有區(qū)別。

表2 河蟹成活個數(shù)、雌雄個數(shù)、成活率以及成活雌蟹占比統(tǒng)計表Tab.2 Statistics of number of survive,number of males and females,survival rate and female proportion of live crab

2.2.2 體質(zhì)量增長數(shù)據(jù)

各組河蟹體質(zhì)量、相對增重率增長數(shù)據(jù)見表3。由表3 可知：A 組河蟹增重量變異系數(shù)最高，說明A組的河蟹增重量不穩(wěn)定，個體的增長差異較大。而B組和C 組河蟹增重量變異系數(shù)相對較小，說明這2組河蟹增重穩(wěn)定，個體間增重差異較小。檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個試驗組與空白對照組河蟹體質(zhì)量絕對增長和相對增長率的差異顯著，而各試驗組間兩項生長指標(biāo)的差異不顯著。

2.3 窒息試驗

窒息試驗相關(guān)指標(biāo)包括以下8 項（表4）：首個個體死亡時的溶氧值FDDO（First death dissolved oxygen）及所經(jīng)歷時間DFD（Duration of the first death）；試驗半數(shù)個體死亡時的溶氧含量值即半致死溶氧值SDO（Semi-lethal dissolved oxygen）及所經(jīng)歷的時間半致死耐受時長DST（Duration of semi-lethal tolerance）；末尾個體死亡時的溶氧值EDDO（dissolved oxygen level at end death）與所經(jīng)歷時間DED（Duration of the end death）；從第一個死亡至最后一個死亡的缺氧耐受時長和窒息臨界點的平均值為該組整體缺氧耐受時長DHT（Duration of hypoxia tolerance）和整體窒息臨界點SCP（Suffocation critical point）。三個試驗組的窒息溶氧值與所經(jīng)歷時間與空白對照D 組差異顯著（P＞0.05）。清塘劑組間相比，A 組半數(shù)個體死亡時溶氧值顯著低于B和C 組，全部致死所經(jīng)歷時間顯著高于B、C 組（表4）。

表4 窒息試驗相關(guān)指標(biāo)統(tǒng)計表Tab.4 Statistics of related indicators of suffocation experiment

2.4 對底泥的趨避行為

每組試驗蟹中選擇清水對照土壤端和清塘劑浸泡后的前期與后期土壤端的個體數(shù)，以及凍結(jié)者個數(shù)組間差異顯著性檢驗結(jié)果見表5。河蟹對早期的A、B、C 組清塘劑底泥具有顯著回避性，對后期的A 組清塘劑底泥的回避性不顯著，但對后期的B、C底泥依然顯著回避。

表5 首次選擇顯著性檢驗及凍結(jié)者個體數(shù)Tab.5 Significance test of individuals selected for the first time and the number of freezing behavior individuals

各組后期的試驗蟹凍結(jié)者個數(shù)均顯著大于前期，即后期出現(xiàn)了更多的猶豫行為（ambivalent behavior）的個體。動機強度MI 檢驗結(jié)果也與以上結(jié)果相符合（表6）。后期B、C 組對清水底泥的趨性動機強度大于清塘劑底泥。

表6 動機強度MI 值Tab.6 MI values of motivation intensity

3 討論

3.1 清塘劑對河蟹趨避行為的影響

試驗初始，河蟹接觸陌生環(huán)境時具很強的防御性，入飼養(yǎng)盒中立刻鉆進泥土中尋找安全位置。A組和D 組的河蟹一投放馬上鉆進泥土中，而B 組和C 組的河蟹貼著飼養(yǎng)盒，不立即鉆進泥土中，可能是因為河蟹對茶皂素不敏感而對菊酯類藥物很敏感。這與張小俊等[7]通過漁藥毒性試驗得出菊酯類藥物溴氰菊酯對河蟹的毒性為劇毒的結(jié)論相符。當(dāng)土壤中有殘留的菊酯類藥物時，河蟹會排斥，所以貼著飼養(yǎng)盒壁而不立即鉆進泥土中。據(jù)此現(xiàn)象設(shè)置了趨避試驗加以驗證。已有研究報道，甲殼動物通過化學(xué)感受器獲得其生存環(huán)境的信息，表現(xiàn)出攝食、逃避捕食者等行為反應(yīng)[8]。趨避試驗結(jié)果表明，后期的A 組底泥與空白對照組底泥對河蟹產(chǎn)生相同的化學(xué)刺激效果；其他試驗組的底泥較對照組而言仍為消極信號，即各清塘劑毒性隨時間下降，其中清塘威毒性下降最明顯。

3.2 清塘劑對河蟹成活的影響

在檢測河蟹成活率以及最終成活雌性占比差異顯著性時得到的結(jié)果是：三個試驗組和空白對照組無顯著差異。這是由于試驗數(shù)據(jù)為小樣本數(shù)據(jù)，但可以看出三種清塘劑對河蟹的成活率均低于空白對照組，說明清塘劑對河蟹成活有一定影響。羅毅志等[9]研究表明：在茶皂素濃度為25 mg/L 時，麥穗魚（Pseudorasbora parva）、鯽（Carassius auratus）等魚類死亡；陶滕州等[10]試驗表明，氰戊菊酯對仿刺參（Apostichopus japonicus）幼參為高毒物質(zhì)；尹伊偉等表明甲氰菊酯對于魚類毒性較高且對魚類鰓組織造成病理學(xué)損傷[11]，表明清塘劑影響水生生物成活，與上述結(jié)論一致。

3.3 清塘劑對河蟹生長的影響

添加茶皂素和煙堿的A 組河蟹的體質(zhì)量變異系數(shù)較高，說明清塘威響體質(zhì)量增長上差異顯著，而添加菊酯類清塘劑組河蟹的體質(zhì)量增長變異系數(shù)較低，說明菊酯類清塘劑對河蟹體質(zhì)量增長抑制作用有普遍性。0.005 μg·L-1溴氰菊酯處理14 d 產(chǎn)生不可逆組織病理損傷[7]，可進一步解釋抑制體質(zhì)量增長的原因。

清塘威清塘的原理是煙堿起主要作用，茶皂素起增效劑作用，是通過選擇性控制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，使之由興奮、痙攣到麻痹而死亡[13,14]。其作用過程中會使部分個體提高抗逆性，產(chǎn)生具有抵抗力的個體，這可能是A 組河蟹的體質(zhì)量變異系數(shù)相對較高的原因。

甲氰菊酯在水中溶解度較小，難以揮發(fā)，受土壤的吸附性極強，主要吸附在土壤表層，降解緩慢，后期降解的速度取決于土壤中可降解菊酯類微生物的含量和氧氣含量。微生物含量越多，菊酯降解速度越快；氧氣越充足，降解速度越快[15]。本試驗中使用的土壤主要為粘性土壤，氧氣含量少，減緩了甲氰菊酯降解的速度，使甲氰菊酯殘留在土壤中，長期使用，殘留蓄積抑制了河蟹的生長[16,17]。

3.4 清塘劑對窒息相關(guān)指標(biāo)的影響

以往對河蟹的窒息研究主要關(guān)注窒息點與耗氧量。周立紅等[19]試驗得出了不同大小及發(fā)育階段的河蟹幼體耗氧、窒息臨界溶氧點以及半致死溶氧點。本試驗測定各類窒息點所經(jīng)歷的時間，以時間為評估耐缺氧的主要指標(biāo)，在另一種尺度上衡量河蟹的耐缺氧體能。有些物種的甲殼類研究已經(jīng)得出社群狀態(tài)對河蟹可能存在著社會促進（social facilitation）或者社會抑制（social inhibition）影響的結(jié)論[20]。本試驗在單養(yǎng)河蟹條件下進行，以消除社群互動對試驗結(jié)果的誤差。清塘劑顯著抑制河蟹耐缺氧體能，清塘劑試驗組之間相比，A 組半數(shù)個體死亡時溶氧值顯著低于B、C 組，全部致死所經(jīng)歷時間顯著高于B、C 組，這與趨避行為試驗結(jié)果相符合，表明清塘凈、甲氰菊酯對河蟹的毒性大于清塘威。

3.5 結(jié)論

研究結(jié)果表明，清塘劑對河蟹種群具有普遍而明顯的抑制生長作用。生產(chǎn)中，清塘威對河蟹種群生長抑制作用較小，靜置后毒性下降更明顯，更適合應(yīng)用。而耐缺氧試驗表明，清塘劑顯著抑制河蟹耐缺氧體能力，說明清塘劑的使用不可避免對河蟹種群生長造成不利影響。綜上所述，出于環(huán)保與健康化養(yǎng)殖的角度，建議慎用農(nóng)藥類清塘劑。本試驗探究了清塘威、清塘凈、甲氰菊酯三種清塘劑對河蟹種群各項指標(biāo)的影響，但這三種清塘劑對河蟹的安全劑量和有效劑量的平衡參數(shù)仍需進一步探究。