劉益莎，王榮華，梁丹，符艷純，張潤春，陳中元，羅玉雙，楊星

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院水生動(dòng)物重要疫病分子免疫技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；2.常德市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南 常德 415000；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025）

黑斑蛙（Rana nigromaculata）是一種高蛋白、低脂肪、低熱量、低膽固醇的營養(yǎng)保健品，具有滋補(bǔ)解毒和治病功效，市場前景廣闊[1]；黑斑蛙養(yǎng)殖投入少、產(chǎn)出高、周期短，備受養(yǎng)殖戶青睞。目前黑斑蛙養(yǎng)殖覆蓋了我國大部分地區(qū)，湖南、湖北、江蘇等是主養(yǎng)殖區(qū)。隨著蛙類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，小規(guī)模、高密度的蛙類養(yǎng)殖模式，加上管理不善，導(dǎo)致蛙類疾病頻發(fā)，嚴(yán)重阻礙黑斑蛙的健康養(yǎng)殖。歪頭病在牛蛙（Rana catesbeiana）[2]、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）[3,4]、虎紋蛙（Rana tigrina rugulosa）[5]、棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）[6]和豹蛙（Lithobates pipiens）[7]等蛙類中時(shí)有報(bào)道，目前已成為限制蛙類健康可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。蛙類歪頭病的典型癥狀呈現(xiàn)兩種表現(xiàn)形式：腦膜炎及白內(nèi)障，其癥狀只表現(xiàn)一種或兩種形式同時(shí)呈現(xiàn)[8]。近年來針對(duì)黑斑蛙歪頭和白內(nèi)障病癥的報(bào)道頻率越來越高，感染蛙類同時(shí)誘發(fā)歪頭癥和白內(nèi)障的病原菌有藤黃葡萄球菌（Micrococcus luteus）[9]、淺黃假單胞菌（Pseudomonas mendocina）、腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）[10,11]及米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）[7,12,13]等。由于此類疾病病原誘因復(fù)雜，目前尚沒有較好的方法進(jìn)行治療與預(yù)防。

近年來，每年6—9 月湖南常德多家養(yǎng)殖戶的黑斑蛙暴發(fā)歪頭病，主要癥狀為病蛙膚色發(fā)黑，厭食，脖子歪斜朝向一邊，腹部膨大，身體失去平衡，在水中游動(dòng)時(shí)腹部朝上并打轉(zhuǎn)；解剖觀察，病蛙腹部充滿腹水，肝腫大充血；腸內(nèi)無食物，充滿黃色黏液；肺、腎充血等。死亡率50%以上，部分養(yǎng)殖池死亡率高達(dá)70%，嚴(yán)重制約了黑斑蛙養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。本研究通過分離與鑒定湖南常德地區(qū)黑斑蛙歪頭病的病原菌，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，觀察致病菌感染黑斑蛙后的組織病理學(xué)變化，以期為常德地區(qū)黑斑蛙歪頭病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病蛙平均體質(zhì)量（20±3）g 來源于常德市賀家山、臨澧縣及桃源縣等地黑斑蛙養(yǎng)殖場，健康黑斑蛙購自賀家山黑斑蛙養(yǎng)殖基地未發(fā)病養(yǎng)殖池，平均體質(zhì)量（25±4）g，在水族箱中暫養(yǎng)7 d，無異常后用于人工感染實(shí)驗(yàn)。

1.2 病原菌分離與保存

取具典型歪頭病癥狀、瀕死的黑斑蛙，體表消毒后，于無菌條件下解剖，從肝、腹水等部位于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基中劃線分離培養(yǎng)，28℃恒溫下培養(yǎng)48 h，挑取優(yōu)勢單菌落于LB（Luria Bertani）瓊脂培養(yǎng)基劃線分離，純化3 次后，接種純化單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h，于1.5 mL離心管中，按體積比1∶1 加入50%的滅菌甘油，-80℃保種備用。

1.3 菌落和細(xì)菌形態(tài)觀察與生理生化特性研究

取活化菌株，用無菌水洗下菌落，結(jié)合菌液OD600和平板計(jì)數(shù)法將菌液濃度調(diào)整為1×108CFU·mL-1，經(jīng)10 倍梯度稀釋后，取10-5和10-6稀釋濃度涂布LB 瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)72 h 后，觀察菌落形態(tài)特征。革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

生理生化特性分析采用杭州微生物試劑有限公司的生理生化微量鑒定管。無菌條件下，用滅菌牙簽挑取少許細(xì)菌，接種到生理生化微量管內(nèi)，28℃培養(yǎng)24～36 h 觀察結(jié)果，具體結(jié)果觀察時(shí)間與方法參照杭州微生物試劑有限公司提供的說明書操作。

1.4 16S rDNA 測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

挑取單菌落于100 μL 無菌水中制備菌懸液，水浴煮沸5 min 后，10 000 r/min 離心1 min，取上清液作為PCR 反應(yīng)模板。PCR 反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，Taq PCR Master Mix（2×blue dye）25 μL，細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F（10 μmol·L-1）和1492R（10 μmol·L-1）各1 μL，加無菌ddH2O 補(bǔ)齊50 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)分析測序結(jié)果的序列同源性，選擇同源性較高細(xì)菌及部分金黃桿菌屬（Chryseobacterium）細(xì)菌的16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用ClustalX2.1 進(jìn)行多序列比對(duì)分析，使用MAGE 6.0 軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1 000 次的自檢分析檢測置信度。

1.5 人工感染實(shí)驗(yàn)

將純化菌株HJS0526 接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r/min 離心5 min，收集菌體，PBS 清洗1 次后，無菌PBS 稀釋至濃度為1×106CFU·mL-1、1×107CFU·mL-1和1×108CFU·mL-1的菌液備用。將健康黑斑蛙隨機(jī)分為4 組，每組16 尾，實(shí)驗(yàn)組黑斑蛙分別每尾腹腔注射濃度為1×108CFU·mL-1、1×107CFU·mL-1、1×106CFU·mL-1的菌液0.2 mL，對(duì)照組注射等量無菌PBS。實(shí)驗(yàn)中氣溫保持在（28±1）℃，每天觀察記錄患病癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察14 d，對(duì)死亡黑斑蛙及時(shí)剖檢并取肝臟進(jìn)行病原菌的再分離純化與鑒定，以確定致病菌。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn)

1.6.1 抗生素藥物敏感試驗(yàn)

采用常規(guī)紙片瓊脂擴(kuò)散法測定常用9 種抗菌類藥物的敏感性，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。取100 μL 1×107CFU·mL-1的優(yōu)勢菌株均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，將藥敏紙片均勻布置于平板上，紙片間的距離不小于2 cm，28℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司公布的藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷藥物敏感性。

1.6.2 中草藥藥物敏感試驗(yàn)

采用常規(guī)紙片瓊脂擴(kuò)散法測定常用25 種中草藥藥物的敏感性。中草藥醇提取液參照文獻(xiàn)制備[14]。中草藥敏感性試驗(yàn)操作方法同抗生素藥敏試驗(yàn)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在平板上均勻布置制備好的中草藥藥敏紙片，對(duì)照組布置含等量的95%乙醇的藥敏紙片。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑菌圈直徑≥20 mm 為極度敏感，以“+++”表示；抑菌圈直徑15～20 mm 為高度敏感，以“++”表示；抑菌圈直徑10～15 mm 為中度敏感，以“+”表示；抑菌圈直徑＜10 mm 為低度敏感或無抑制效果，以“-”表示[15,16]。

1.7 組織病理學(xué)觀察

取人工感染發(fā)病黑斑蛙的肝、脾、腎、肺和肌肉等組織于4%的多聚甲醛固定后，經(jīng)30%～100%酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度4～5 μm），蘇木精-伊紅染色，中性樹脂封片，使用徠卡（Leica）高級(jí)顯微系統(tǒng)（DM3000）觀察組織病理變化并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床表現(xiàn)與剖檢變化

感染病蛙的臨床癥狀主要表現(xiàn)為頭歪向一側(cè)，部分黑斑蛙表現(xiàn)白內(nèi)障，眼珠渾濁，表面似覆白膜（圖1-A）；腹腔膨大，四肢腫脹、有出血點(diǎn)，后蹼局部充血（圖1-B）。解剖后，腹腔有透明積液，肝臟充血出血，脾臟輕度腫大，腸胃充氣、鼓脹，內(nèi)含帶血黏液，腸表面有深色粘附物（圖1-C、D）。

圖1 黑斑蛙歪頭病自然發(fā)病體表和內(nèi)臟表現(xiàn)癥狀Fig.1 Symptoms of body surface and viscera of frog with torticollis disease

2.2 病原菌的分離純化及菌落形態(tài)觀察

無菌操作下從患病黑斑蛙肝臟中分離到優(yōu)勢菌株HJS0526，經(jīng)28℃恒溫箱培養(yǎng)72 h 后，在LB瓊脂培養(yǎng)基上形成直徑約為2～3 mm，表面光滑、邊緣整齊、圓形、隆起、有折光性、不透明的淡黃色或乳白色菌落（圖2-A）。該菌為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀（圖2-B）。

圖2 HJS0526 菌株的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 The colonial morphology and gram's stain of HJS0526

2.3 分離菌生理生化鑒定

生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果顯示，菌株HJS0526 的葡萄糖、β-半乳糖苷、七葉苷、尿素、葡萄糖產(chǎn)氣等生化檢測結(jié)果呈陽性，木糖、麥芽糖、氧化酶、山梨醇、棉子糖、苯丙氨酸等生化檢測結(jié)果呈陰性（表1）。

表1 病原菌HJS0526 生化特性測定結(jié)果Tab.1 Biochemical characteristics of pathogenic bacterium HJS0526

2.4 菌株HJS0526 16S rDNA 測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過16S rDNA 通用引物PCR 獲得了大約1 500 bp 條帶，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序獲得1 384 bp 片段，用Blast 對(duì)HJS0526 菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)選取同源性較高的菌株，以及金黃桿菌屬（Chryseobacterium）作為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，分離菌株與米爾伊麗莎白菌同源性最高，達(dá)99.3%，HJS0526 菌株和米爾伊麗莎白菌聚為一支，而后和按蚊伊麗莎白菌（Elizabethkingia anopheles）聚為一大簇（圖3）。

圖3 基于菌株HJS0526 的16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain HJS0526 based on 16S rRNA sequences

2.5 人工感染實(shí)驗(yàn)

人工感染所致癥狀和自然發(fā)病癥狀基本一致（圖4），腹腔注射感染24 h 后，1×108CFU·mL-1濃度組開始出現(xiàn)死蛙，主要癥狀為急性充血，出血。感染后14 d，1×106CFU·mL-1、1×107CFU·mL-1和1×108CFU·mL-1濃度組累計(jì)死亡率分別達(dá)到50%、63%和88%（圖5），實(shí)驗(yàn)組歪頭癥狀表現(xiàn)率均高于90%。從死亡的黑斑蛙肝臟中進(jìn)行細(xì)菌再分離鑒定，16S rDNA 測序結(jié)果和菌株HJS0526 一致。對(duì)照組黑斑蛙體表和內(nèi)臟均無明顯癥狀，無死亡現(xiàn)象。

圖4 黑斑蛙感染HJS0526 后體表和內(nèi)臟表現(xiàn)癥狀Fig.4 Symptoms of body surface and viscera of frog infected with HJS0526

圖5 人工感染實(shí)驗(yàn)中不同濃度組黑斑蛙的累積死亡率Fig.5 Cumulative mortality rate of frogs exposed to different concentrations in the artificial infection test

2.6 藥物敏感試驗(yàn)

抗生素藥物敏感性試驗(yàn)表明，菌株HJS0526 對(duì)環(huán)丙沙星和氟苯尼考高度敏感；對(duì)慶大霉素中度敏感；對(duì)卡那霉素、多粘菌素B、青霉素、克林霉素和妥布霉素具有耐藥性（表2）。中草藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花和魚腥草醇提取液對(duì)HJS0526 菌株具有極好的抑制效果；五倍子、黃連、野菊花、紫蘇葉、牡丹皮、蒲公英等中草藥醇提取液對(duì)菌株HJS0526 具有高度抑制效果；連翹、烏梅、穿心蓮、苦參、白鮮皮、柴胡、五味子、陳皮、黃芩、秦皮、艾葉、貫眾等中草藥醇提取液對(duì)HJS0526 菌株有較好抑制效果；而菌株HJS0526 對(duì)板藍(lán)根、馬齒莧、蘇木、紫花地丁、黃柏等中草藥醇提取液呈低度敏感或不敏感（表3）。

表2 菌株HJS0526 對(duì)抗生素藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic susceptibility test of the strain HJS0526

表3 菌株HJS0526 對(duì)中草藥藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Chinese herbal medicine susceptibility test of the strain HJS0526

2.7 組織病理學(xué)觀察

病理組織學(xué)觀察顯示：米爾伊麗莎白菌感染后，導(dǎo)致黑斑蛙全身多器官組織損傷，尤其是肝、脾、腎和肺等損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)出明顯的變性、壞死、充血、出血和炎癥反應(yīng)。主要病理變化表現(xiàn)為：肝細(xì)胞排列紊亂，大量細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞核偏向細(xì)胞一側(cè)，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞的浸潤（圖6-B）；腎小球充血腫脹，細(xì)胞空泡壞死，腎小囊腔縮小，少數(shù)腎小球崩解，結(jié)構(gòu)消失，伴隨有炎性細(xì)胞浸潤（圖6-D、E）；脾細(xì)胞間隔內(nèi)充血、出血，淋巴細(xì)胞減少（圖6-G）；肺泡內(nèi)淤血，上皮細(xì)胞空泡化，炎性細(xì)胞浸潤（圖6-I）；肌纖維壞死溶解，呈玻璃樣壞死，橫紋模糊、消失，肌纖維溶解、斷裂排列紊亂，水腫（圖6-K、L）。

圖6 感染病蛙的組織病理變化Fig.6 Histopathological observation of infected frogs

3 討論

米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）屬于伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia spp.），黃桿菌科（Flavobacteriaceae），最早于2003 年從俄羅斯和平號(hào)空間站的凝結(jié)水中分離[18]，是一種新興的條件致病菌，可引起人類菌血癥、敗血癥和腦膜炎等[19,20]。2008 年首例人類感染見于美國[21]，目前米爾伊麗莎白菌感染呈增多趨勢[22]。米爾伊麗莎白菌除感染人外，目前僅在蛙類（黑斑蛙[12]、棘胸蛙[13]等）中有感染的報(bào)道。本研究從患歪頭病的黑斑蛙肝臟中分離到優(yōu)勢菌株米爾伊麗莎白菌，經(jīng)人工感染試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)黑斑蛙具有強(qiáng)致病性。發(fā)病蛙頭頸斜向一側(cè)、白內(nèi)障和水中打轉(zhuǎn)等典型癥狀與自然感染類似。綜合細(xì)菌鑒定和人工感染實(shí)驗(yàn)，確定了常德地區(qū)黑斑蛙歪頭病的病原菌為米爾伊麗莎白菌。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑斑蛙感染米爾伊麗莎白菌后實(shí)質(zhì)性器官（如肝、脾、腎等）嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞空泡壞死及充血出血等，與自然條件下患歪頭病的棘胸蛙表現(xiàn)病理相似[13]。米爾伊麗莎白菌感染后，可引起肝、腎中淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，脾內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，提示米爾伊麗莎白菌感染可激活黑斑蛙的適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，具體激活與損傷機(jī)制有待進(jìn)一步研究。通過疫苗免疫可能是預(yù)防黑斑蛙歪頭病暴發(fā)的重要方法途徑。感染后黑斑蛙肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量空泡壞死，合成白蛋白減少，血漿膠體滲透壓下降，同時(shí)肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)器官靜脈淤血，血流回路受阻，導(dǎo)致血管中的液體在壓力作用下通過組織間隙進(jìn)入腹腔，這可能是黑斑蛙歪頭病出現(xiàn)腹水的原因[23]。

米爾伊麗莎白菌具有大量與抗生素耐藥相關(guān)的基因（β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷6-腺苷轉(zhuǎn)移酶、磺胺、四環(huán)素和氯霉素耐藥基因），屬于多重耐藥菌[19]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的米爾伊麗莎白菌僅對(duì)環(huán)丙沙星和氟苯尼考敏感，但對(duì)青霉素、克林霉素等其他抗生素產(chǎn)生了抗性，與秦振陽等[17]的研究結(jié)果類似，而和Lei 等[13]結(jié)果略有不同，從患病棘胸蛙中分離的米爾伊麗莎白菌對(duì)環(huán)丙沙星具有耐藥性，可能是物種和地域的原因引起；Trimpert 等[7]使用不同濃度的恩諾沙星、氟苯尼考和四環(huán)素等通過皮膚藥浴法治療米爾伊麗莎白菌感染的豹蛙，發(fā)現(xiàn)無療效，提示通過抗生素治療歪頭病的效果不佳，篩選與研制新型抗菌藥物防治黑斑蛙歪頭病迫在眉睫。中草藥具有天然性、無毒副殘留性、無抗藥性、可增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫機(jī)能和對(duì)致病菌的抵抗力等諸多優(yōu)點(diǎn)。王永芬等[24]還發(fā)現(xiàn)，中草藥具有消除大腸桿菌致病菌質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)耐藥性逆轉(zhuǎn)的作用。近年來，中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中受到越來越多的關(guān)注。吳興鎮(zhèn)[10]發(fā)現(xiàn)柯子和烏梅兩種中藥組成的中草藥復(fù)方制劑對(duì)米爾伊麗莎白菌具有良好的抑菌效果。本研究中金銀花、魚腥草、五倍子、黃連、野菊花等中草藥醇提取液對(duì)米爾伊麗莎白菌具有高度抑制效果；因而，金銀花、魚腥草、五倍子、黃連、野菊花等中草藥具有研制成防治黑斑蛙歪頭病藥物的潛力，可進(jìn)行深入研究開發(fā)。

結(jié)論

本研究確定了常德地區(qū)黑斑蛙歪頭病的病原為米爾伊麗莎白菌，其對(duì)黑斑蛙具有很高的致死率，感染可激活黑斑蛙適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起多組織器官衰竭而致死。米爾伊麗莎白菌對(duì)多數(shù)抗生素表現(xiàn)出耐藥性，生產(chǎn)實(shí)踐中亟須研發(fā)新型治療藥物，提高養(yǎng)殖成活率，減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。