任廣明，林玉杰，徐黎明，趙景壯，邵軼智，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding proteins，F(xiàn)abps）是一類分子量14～15 kDa 的脂質(zhì)伴侶蛋白，隸屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白（lipid-binding proteins，Lbps）超家族[1,2]。Fabps 不僅廣泛分布在哺乳動物的所有組織中，也存在于鳥類、魚類、昆蟲的腦、心臟、腸、脂肪等組織中[3]。不同動物的Fabps 組織特異性不同，在國際上通常以Fabps 被分類或鑒定的第一個組織進(jìn)行命名。至今為止，已命名為9 種組織特異性的胞質(zhì)Fabps，分別為腦型（brain Fabp，B-Fabp）、肝臟型（liver Fabp，L-Fabp）、腸型（intestinal Fabp，I-Fabp）、心臟型（heart Fabp，H-Fabp）、脂肪細(xì)胞型（adipocyte Fabp，A-Fabp）、回腸型（ileum Fabp，I-Fabp）、睪丸型（testis Fabp，T-Fabp）、表皮型（epidermal Fabp，E-Fabp）和髓磷脂型（myelin Fabp，My-Fabp）[4,5]。

Fabps 作為重要的脂質(zhì)信號，對脂肪酸具有高的親和力，能夠以非共價鍵形式結(jié)合疏水性配體，如飽和長鏈脂肪酸、不飽和長鏈脂肪酸、類花生酸、血色素、類視黃醇等[6]。Fabps 與這些脂肪酸結(jié)合后可被攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行信號傳遞與膜的合成；攜帶至胞質(zhì)進(jìn)行酶活性的調(diào)控；攜帶至線粒體和過氧化物酶體中進(jìn)行氧化功能；攜帶至核內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[7,8]。Fabps 與配體有效結(jié)合后，一方面提高了脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，被運(yùn)送到各個細(xì)胞器中參與脂質(zhì)的存儲、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化、脂化與合成以維持細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸較低的濃度，緩解高濃度脂肪酸對細(xì)胞的損傷；另一方面可與JAK2、C36 和PPARγ 等因子直接作用，調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號通路，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)過程[9-11]?？梢?，F(xiàn)abps 通過參與調(diào)節(jié)脂肪酸和胞內(nèi)重要的信號通路來影響宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝、能量代謝和炎癥反應(yīng)。

Fabp10 是一種只在非哺乳脊椎動物的肝臟中檢測到，在哺乳動物肝臟中未被檢出的脂肪酸結(jié)合蛋白[3]。目前，關(guān)于虹鱒fabp10 基因的序列、結(jié)構(gòu)功能、不同組織中分布等的研究還較少，其參與調(diào)節(jié)虹鱒機(jī)體脂肪酸代謝與炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建fabp10 真核表達(dá)載體，研究其結(jié)構(gòu)、功能及在虹鱒各組織中的轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步探討fabp10 基因在虹鱒脂質(zhì)代謝及機(jī)體炎癥過程中的作用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集健康虹鱒腦、肝臟、心臟、脾臟、頭腎、腸和肌肉組織用于RNA 的提取。轉(zhuǎn)染用細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存的EPC 細(xì)胞系。

1.2 主要試劑

TrizoL 試劑、Premix Taq 酶、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒、RT-PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA 連接酶等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫公布的河鱒（Salmo trutta）fabp10 基因CDS 序列（XM _029737487.1），利用premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對基因克隆引物和2 對熒光定量PCR 引物。其中，基因克隆引物由吉林庫美生物有限公司合成擴(kuò)增全長引物，并分別在上、下游引物的5'端添加BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。所有引物均由吉林庫美生物有限公司合成，引物信息見表1。

表1 虹鱒fabp10 基因引物信息Tab.1 Primers of rainbow trout fabp10 gene

1.3.2 虹鱒fabp10 基因CDS 序列全長擴(kuò)增

采用Trizol 法提取虹鱒肝臟總RNA，利用RTPCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：Taq 酶1 μL、buffer 12 μL，上、下游引物（100 pmol/μL）各1 μL、模板5 μL、ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：50℃30 min，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72℃徹底延伸10 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗(yàn)證。

1.3.3 虹鱒fabp10 基因克隆載體構(gòu)建

采用膠回收試劑盒膠回收fabp10 基因PCR 產(chǎn)物，回收后的目的片段與pMD-18-T 載體16℃過夜連接。其中連接體系：pMD-18-T 1 μL，膠回收產(chǎn)物4.0 μL，Solution I 5.0 μL。采用熱激法將過夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布到含氨芐抗性的LB 培養(yǎng)基固體平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)。隨機(jī)挑取單個陽性菌落接種于含氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁。提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定質(zhì)粒，將酶切鑒定成功的質(zhì)粒送至吉林庫美生物有限公司測序。測序鑒定后與河鱒fabp10 基因CDS 序列進(jìn)行序列比對，匹配度高的克隆載體將其命名為pMD-18-T-fabp10。

1.3.4 虹鱒fabp10 基因真核表達(dá)載體構(gòu)建

使用BamHⅠ和EcoRⅠ對pMD-18-T-fabp10和pcDNA3.1（+）進(jìn)行雙酶切，膠回收fabp10 基因片段和線性化pcDNA3.1（+）。利用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，其中連接體系：T4 DNA 連接酶1 μL，fabp10 基因片段7 μL，線性化pcDNA3.1（+）1 μL，10×Buffer 1 μL，16℃連接過夜。隨后過夜連接的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、酶切鑒定（參照1.3.3），經(jīng)測序鑒定后與河鱒fabp10 基因CDS 序列進(jìn)行序列比對，匹配度高的真核表達(dá)載體命名為pcDNA3.1-fabp10。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫中Blast 功能對虹鱒fabp10基因編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對；使用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）和ProScale（https://www.expasy.org/resources/protscale）分 析fabp10 基因的基本理化性質(zhì)，包括基因理論分子質(zhì)量、編碼的氨基酸組成、等電點(diǎn)、疏水性等；利用在線軟件NetPhos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析Fabp10 蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)；采用在線分析軟件TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測Fabp10 蛋白跨膜區(qū)；利用TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和PSORT Ⅱ（https://psort.hgc.jp/form2.html）預(yù) 測Fabp10 蛋白的亞細(xì)胞定位；利用在線分析軟件SOPMA（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測虹鱒Fabp10 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)。

1.3.6 陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染EPC 細(xì)胞

將EPC 細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度為7.5×105個/孔。轉(zhuǎn)染前將6 孔板中培養(yǎng)液更換成無抗生素的培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作轉(zhuǎn)染EPC 細(xì)胞。試驗(yàn)設(shè)置pcDNA3.1-fabp10 轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1（+）處理組，分別在轉(zhuǎn)染24 h、36 h、48 h 后收集細(xì)胞，利用RT-qPCR檢測fabp10 基因的表達(dá)情況。

1.3.7 fabp10 在虹鱒組織中的分布與表達(dá)

采用Trizol 法提取虹鱒各組織中的總RNA，利用RT-qPCR 技術(shù)檢測不同組織fabp10 基因的轉(zhuǎn)錄活性，每個樣本重復(fù)3 次，以內(nèi)參β-actin 矯正個體之間的差異，采用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad prism 5.0 繪圖，利用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著性水平P ＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 虹鱒fabp10 基因擴(kuò)增

以虹鱒肝臟組織提取的RNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，條帶大小約378 bp。測序結(jié)果經(jīng)Blast 比對，目的片段與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫公布的預(yù)測的河鱒fabp10 基因CDS 區(qū)同源性高達(dá)100%，說明成功擴(kuò)增出虹鱒fabp10 基因CDS 序列。與O.mykiss L-fabp 基因CDS 區(qū)同源性達(dá)99.47%，這一結(jié)果證實(shí)虹鱒fabp10 是一種肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白。

2.2 虹鱒fabp10 基因克隆載體與真核表達(dá)載體構(gòu)建

經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，使用BamHⅠ和EcoRⅠ對虹鱒fabp10 基因的克隆載體pMD-18-T-fabp10 和真核表達(dá)載體pcDNA3.1-fabp10 進(jìn)行雙酶切鑒定（圖1）。結(jié)果表明，酶切條帶符合預(yù)期片段大小，約為378 bp。

圖1 pcDNA3.1-fabp10 雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Double enzyme digestion of pcDNA3.1-fabp10

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)預(yù)測

虹鱒fabp10 基因分子式為C612H1003N163O194S6，總原子數(shù)1978，分子量為13.94 ku，理論等電點(diǎn)為8.53，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）為23.29，平均親水性（GRAVY）水平為-0.36，脂肪系數(shù)（Alippahtic index）為80.40。這一結(jié)果說明Fabp10 蛋白為相對穩(wěn)定的脂溶性蛋白。

Fabp10 蛋白共包含18 種氨基酸，其中賴氨酸數(shù)量最高，為11.10%，其次是蘇氨酸（10.30%）、甘氨酸（7.90%）和絲氨酸（7.90%）。虹鱒Fabp10 蛋白中天冬氨酸與谷氨酸（負(fù)電荷氨基酸）總數(shù)量為16，精氨酸與賴氨酸（正電荷氨基酸）總數(shù)量為18（表2）。ProtScale 軟件預(yù)測分析，F(xiàn)abp10 蛋白整個肽鏈中含有親水性和疏水性氨基酸，其中得分最大值為1.43（第116 氨基酸處）；最小值為-1.96（第43 個氨基酸處），氨基酸的負(fù)值分值相對較大，根據(jù)得分判定Fabp10 蛋白為疏水性蛋白（圖2）。通過TMHMM軟件分析預(yù)測，F(xiàn)abp10 蛋白的1～126 位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，其他位氨基酸未形成跨膜螺旋區(qū)。

表2 Fabp10 蛋白氨基酸組成Tab.2 Amino acids composition of Fabp10 protein in rainbow trout

圖2 虹鱒Fabp10 蛋白親水/疏水性分析Fig.2 Hydrophilic/hydrophobic analysis of Fabp10 protein in rainbow trout

2.3.2 蛋白磷酸化位點(diǎn)與亞細(xì)胞定位

運(yùn)用在線軟件在虹鱒Fabp10 蛋白中共預(yù)測到23 個磷酸化位點(diǎn)，均為蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。TargetP軟件預(yù)測Fabp10 蛋白的分泌信號作用位點(diǎn)占比8.15%，其他占比91.85%。Fabp10 蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，其次分布在細(xì)胞核內(nèi)，在線粒體、過氧化物酶體和液泡中也有分布（表3）。

表3 Fabp10 蛋白亞細(xì)胞定位Tab.3 Sub-cellular localization of Fabp10 protein in rainbow trout

2.3.3 Fabp10 二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA 在線分析軟件預(yù)測虹鱒Fabp10 蛋白18.25%可能性形成螺旋，38.89%可能性形成延伸鏈，8.73%可能性形成轉(zhuǎn)角，34.13%可能性形成無規(guī)則卷曲。該蛋白無二硫鍵的形成，且無特殊的二級結(jié)構(gòu)。SWISS-MODEL 對Fabp10 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤繞、折疊，依靠次級鍵形成了具有空穴的高級結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)有利于與其配體分子結(jié)合，即可能是某些分子的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。

圖3 虹鱒Fabp10 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Tertiary structure prediction of Fabp10 protein in rainbow trout

2.4 氨基酸序列同源性對比

基于20 個物種Fabp10 氨基酸序列，采用MEGA 6.0 軟件，利用N-J 法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示（圖4），虹鱒Fabp10 氨基酸序列與褐鼠（Rattus norvegicus）、人（Homo sapiens）Fabp 氨基酸序列同源性分別為29.10%和30.08%。進(jìn)化樹中所有魚類聚為一大支，虹鱒Fabp10 氨基酸序列與大麻哈魚（Oncorhynchus kisutch）Fabp10 氨基酸序列、虹鱒（O.mykiss）L-Fabp氨基酸序列、大鱗大馬哈魚（O.tshawytscha）Fabp10 氨基酸序列、鯡形白鮭（Coregonus clupeaformis）Fabp10 氨基酸序列和白斑狗魚（Esox lucius）Fabp10 氨基酸序列聚為一支，其氨基酸序列同源性高達(dá)96%以上；與奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、鱖（Siniperca chuatsi）、斑馬魚（Danio rerio）、鯉（Cyprinus carpio）等聚為一大支，其氨基酸序列同源性在80%以上。

圖4 不同物種Fabp10 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of Fabp10 amino acid sequences among different species

2.5 pcDNA3.1-fabp10 的轉(zhuǎn)染

與對照組（pcDNA3.1 處理組）相比，轉(zhuǎn)染24 h、36 h、48 h 后虹鱒fabp10 基因的表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。其中，在轉(zhuǎn)染36 h 時EPC 細(xì)胞中fabp10基因的表達(dá)量相對最高，為對照組的1848 倍。轉(zhuǎn)染48 h 后其表達(dá)量與36 h 相比顯著下降（P＜0.05）（圖5）。

圖5 不同轉(zhuǎn)染時間fabp10 基因的表達(dá)分析Fig.5 Analysis of fabp10 gene expression during the different transfection time

2.6 fabp10 在虹鱒組織中的分布與表達(dá)

如圖6 所示，除腸與脾臟fabp10 基因表達(dá)量差異不顯著外，各組織中fabp10 基因的相對表達(dá)量均差異顯著（P＜0.05）。fabp10 基因在肝臟中表達(dá)豐度最高，為84 798.03，隨之為腎臟、肌肉、腸、脾臟、心臟，在腦中表達(dá)量最低，而肝臟中fabp10 高水平的表達(dá)與肝臟行使虹鱒機(jī)體脂肪酸代謝密切相關(guān)。

圖6 虹鱒組織中fabp10 基因的表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of fabp10 gene expression levels in rainbow trout

3 討論

20 世紀(jì)70 年代早期在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了能與長鏈脂肪酸結(jié)合的脂肪酸結(jié)合蛋白（Fabp）[12,13]。Fabps 家族成員眾多，具有一定的組織特異性，但種間同型的Fabps 具有較高的同源性，尤其是三維結(jié)構(gòu)上的高度保守性[2]。本研究中系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，哺乳動物Fabp10 蛋白聚為一大支，魚類聚為一大支，且虹鱒Fabp10 氨基酸序列與大麻哈魚、鯡形白鮭等硬骨魚類其氨基酸序列同源性較高。結(jié)合蛋白三級機(jī)構(gòu)分析顯示，fabp10 基因在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。Fabps 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和組織器官的特異性決定了Fabps 在不同細(xì)胞內(nèi)的生物功能?；蚝桶被嵝蛄斜葘Y(jié)果表明，虹鱒Fabp10 蛋白是一種肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白，推測其具有與L-Fabp相近的生物學(xué)功能。與其他類型脂肪酸蛋白不同，L-Fabp一般通過與兩個配體分子結(jié)合而行使其生物學(xué)功能[14]。例如，雞fabp10 基因通過與兩個配體分子結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)脂肪酸的作用[7]。而Pietro等[15]發(fā)現(xiàn)，鯰（Rhamdia sapo）fabp10 基因則是與一個配體分子結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)活性，這種差異極有可能與蛋白的三級結(jié)構(gòu)有關(guān)[16]。對蛋白的磷酸位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)abp10 蛋白有23 個磷酸化位點(diǎn)，而蛋白磷酸化對細(xì)胞信號傳導(dǎo)具有著重要作用。這說明Fabp10 很可能通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)來影響宿主的生命過程。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了虹鱒fabp10 真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染EPC 細(xì)胞，在不同轉(zhuǎn)染時間其表達(dá)量均顯著高于對照組，表明載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究Fabp10對脂肪酸的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。虹鱒fabp10 基因在肝臟中表達(dá)豐度最高，這可能與其具有調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的功能有關(guān)。L-Fabps 負(fù)責(zé)脂質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、減少細(xì)胞氧化應(yīng)激和影響細(xì)胞生長分化中發(fā)揮重要作用[17,18]。L-Fabp主要負(fù)責(zé)從血漿中攝取脂肪酸，快速在肝細(xì)胞內(nèi)將其脂化成三?；视秃土字瑸樗拗魈峁┠芰縖19]。在細(xì)胞核中L-Fabp可直接與PPARα/PPARγ 等核受體相互作用[20]，通過激活A(yù)kt/mTOR/、Src/FAK/cdc42 等通路參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝與炎癥反應(yīng)[21]?？梢姡琪Vfabp10 基因具有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞脂質(zhì)沉積和肝臟代謝的作用。此外，L-Fabp還可介導(dǎo)脂肪酸由胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至多種細(xì)胞器中，直接影響脂肪酸在線粒體或過氧化物酶體的β-氧化比率，調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化水平[22]。定位分析發(fā)現(xiàn)，虹鱒Fabp10 不僅分布在細(xì)胞質(zhì)中，還存在于細(xì)胞核、線粒體、過氧化物酶體等細(xì)胞器中，說明虹鱒Fabp10 具有緩解機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的能力。而Fabp10 的抗氧化水平主要與其蛋白結(jié)構(gòu)中富含的半胱氨酸、甲硫氨酸有關(guān)。這些殘基具有調(diào)節(jié)巰基氧化還原反應(yīng)，可提高谷胱甘肽的生成率[23]。綜上所述，fabp10 基因在虹鱒脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要的作用。本研究在虹鱒fabp10 基因序列信息及其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了初步研究，但fabp10 基因在虹鱒代謝與炎癥等反應(yīng)中的作用仍需深入地探索與研究。