李盼盼， 張秀秀， 向玉婷， 唐大春， 黃嬋， 常華， 慕容紅梅**

(1.黔西南州人民醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心, 貴州 興義 562400； 2.吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 吉林 長春 130000)

地中海貧血(簡稱地貧)是人類珠蛋白基因遺傳缺陷所致的慢性溶血性貧血[1]，是由于珠蛋白基因的缺失或點(diǎn)突變使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少、或不能合成，導(dǎo)致肽鏈?zhǔn)Ш舛荒苄纬烧５乃木垠w(ααββ)，使血紅蛋白量或質(zhì)發(fā)生改變、進(jìn)一步導(dǎo)致紅細(xì)胞的壽命縮短與過早破壞的貧血[2]。地貧是一種單基因遺傳病，其遺傳規(guī)律遵循孟德爾遺傳法則[3-4]，目前無有效治愈的方法，是引起胎兒出生缺陷、圍產(chǎn)期死亡、孕產(chǎn)婦死亡的常見原因之一[5]。因此，通過父母雙方的基因攜帶者篩查及孕期產(chǎn)前檢查等手段，預(yù)測后代的患病幾率和發(fā)病的嚴(yán)重程度，是做好防止重型地貧患兒的出生及出生后有效早期干預(yù)的有效途徑。黔西南布依族苗族自治州位于貴州省西南部，2019年1月—2020年10月對黔西南州孕婦提供產(chǎn)前地貧基因篩查(508種類型高通量二代測序技術(shù)測序)，分析地貧基因型分布、基因頻率及特有基因型數(shù)據(jù)等，為建立黔西南州基因篩查-遺傳咨詢-產(chǎn)前診斷的防控體系提供科學(xué)參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2019年01月—2020年10月黔西南州地區(qū)2市、6縣、1區(qū)共20 209名孕婦產(chǎn)前的地貧基因篩查數(shù)據(jù)，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[2016倫審第(01)號]，所納入病例均獲得患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1樣本采集 采集年齡為16～55歲、平均(29.23±5.21)歲，孕11～38周、平均(17.20±2.44)周的孕婦外周靜脈全血5 mL，送深圳華大臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行地貧基因檢測。

1.2.2地貧基因檢測 對孕婦EDTA-K2抗凝外周靜脈全血進(jìn)行地貧基因檢測，由深圳華大臨床檢驗(yàn)中心提供試劑和高通量二代測序技術(shù)(NGS)結(jié)合跨越斷裂點(diǎn)的PCR技術(shù)(Gap-PCR)，該技術(shù)可檢測4種(--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI) α-地貧缺失型、3種(βchineseGγ+(Aγδβ)0、βSEA-HPFH、臺灣型)β-地貧缺失型、超過153種α-地貧突變型以及超過348種β-地貧突變型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和分析，計數(shù)資料結(jié)果用率(%)來表示。

2 結(jié)果

2.1 總體情況

20 209例樣本中共檢出地貧基因突變體(含新發(fā)現(xiàn)且致病性不清楚的基因型，統(tǒng)稱為未確定型)2 854例，地貧基因的人群攜帶率為14.122%(2 854/20 209)。其中檢出α-地貧基因突變體1 954例，即α-地貧基因人群攜帶率為9.668%(1 954/20 209)，占檢出地貧基因變異體例數(shù)的68.465%(1 954/2 854)，β-地貧基因突變體749例，即β-地貧基因人群攜帶率為3.706%(749/20 209)，占檢出地貧基因變異體例數(shù)的26.244%(749/2 854)，αβ-復(fù)合型地貧基因突變體151例，即αβ-復(fù)合型地貧基因人群攜帶率為0.747%(151/20 209)，占檢出地貧基因變異體例數(shù)的5.291%(151/2 854)。見表1。

2.2 α-地貧基因型及分布

1 954例α-地貧基因突變體中，常見基因型為 αα/-α3.7(767，39.253%)、αα/--SEA(499，25.537%)、αCSα/αα(256，13.101%)、αα/-α4.2(163，8.342%)、αWSα/αα(79，4.043%)；檢出未確定型共36例，構(gòu)成比為1.84%；檢出其他多種突變類型，如ααCD 27 GAG>GAT[Glu>Asp]/αα等(表2)?；蝾l率從高到低依次為 -α3.7(896，39.646%)、--SEA(574，25.398%)、αCS(320，14.159%)、-α4.2(209，9.248%)、αWS(112，4.956 %)等。見表2和表3。

表2 α-地貧基因型及分布Tab.2 Genotype and distribution of α-thalassemia

續(xù)表

表3 α-地貧基因頻率分布情況Tab.3 Distribution of α-thalassemia gene frequency

2.3 β-地貧基因型及分布

749例β-地貧基因突變體中，常見基因型依次為βCD 17 (A>T)/βN(276，36.849%)、βCD 41/42 (-TTCT)/βN(217，28.972%)、βIVS-II-654 (C>T)/βN(62，8.278%)、βCD 26 GAG>AAG[Glu>Lys]/βN(39，5.207%)、β-50 (G>A)/βN(26，3.471%)，以及其他多種突變類型，如β-28 (A>G)/βN等(表4)?；蝾l率從高到低依次為βCD 17 (A>T)(368，40.529%)、βCD 41/42 (-TTCT)(252，27.753%)、βIVS-II-654 (C>T)(65，7.159%)、未確定型(50，5.507%)、βCD 26 GAG>AAG[Glu>Lys](49，5.396%)、β-50 (G>A)(33，3.634%)等(表5)。

表4 β-地貧基因型及分布Tab.4 Genotype and distribution of β-thalassemia

表5 β-地貧基因頻率分布情況Tab.5 Distribution of β-thalassemia gene frequency

2.4 αβ-復(fù)合型地貧基因型及分布

151例αβ-復(fù)合型地貧基因突變體中，常見基因型以αα/-α3.7& βCD 17 (A>T)/βN多見(36，23.841%)，其次為αα/--SEA&βCD 17 (A>T)/βN(17，11.258%)。見表6。

表6 αβ-復(fù)合型地貧基因型及分布Tab.6 Genotype and distribution of αβ-thalassemia

3 討論

地貧是我國長江以南各省發(fā)病率高、影響力大的遺傳病之一[6]，在兩廣、海南、福建、重慶等地區(qū)的發(fā)病率較高[7-9]。以往研究顯示，地貧具有顯著的地域性和高度異質(zhì)性，與人群分布密切相關(guān)，各地域間的突變類型及頻率各具特點(diǎn)[10]。黔西南布依族苗族自治州地處滇黔桂三省結(jié)合部，緊鄰云南、廣西等我國地中海貧血高發(fā)區(qū)，從地域上推論該地區(qū)同樣可能有較高地貧基因攜帶率。然而，貴州省僅有局部地區(qū)有地貧分子流行病學(xué)的研究，尚無對黔西南州地區(qū)地貧基因進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的報道，而且目前開展的地貧篩查，主要采用血常規(guī)血紅蛋白電泳檢查進(jìn)行初篩，確診仍依賴地貧基因的分析[11]，但是常規(guī)基因檢查只能檢測已知的基因位點(diǎn)突變，不能檢出未知突變，會造成一定量的漏診、誤診風(fēng)險[12]。

NGS測序是目前比較先進(jìn)的方法，它將地貧HBA1、HBA2、HBB基因全長進(jìn)行擴(kuò)增后測序，且結(jié)合Gap-PCR實(shí)驗(yàn)可同時檢測地貧基因突變型與缺失型，覆蓋了99%以上地貧基因突變類型，能檢測到常規(guī)方法不能檢測到的罕見突變，并可發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變類型，降低漏檢風(fēng)險[13]。譚梅等[14]、王珂等[15]用 NGS 技術(shù)進(jìn)行的地貧基因檢測，其結(jié)果均與Sanger測序結(jié)果完全符合，靈敏度、特異性均為100%。近年來，分子診斷技術(shù)成為了實(shí)施人群篩查及診斷準(zhǔn)確可靠的技術(shù)，2013年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會已將NGS技術(shù)列入了臨床應(yīng)用指南[16]。

本研究正是采用了NGS技術(shù)結(jié)合Gap-PCR進(jìn)行大樣本的普篩，得出黔西南州地區(qū)地貧基因人群攜帶率為14.122%。α-地貧基因攜帶率為9.667%，α-地貧基因頻率從高到低依次是 -α3.7、--SEA、αCS、-α4.2、αWS等；β-地貧基因攜帶率為3.706%，β-地貧基因頻率從高到低依次為βCD 17 (A>T)、βCD 41/42 (-TTCT)、βIVS-II-654 (C>T)、βCD 26 GAG>AAG[Glu>Lys]、β-50 (G>A)等；αβ-復(fù)合型地貧基因型以αα/-α3.7&βCD 17 (A>T)/βN為主，與我國南方地區(qū)常見的地貧基因型別較一致。但在常見基因突變類型的排序上，本次研究與楊宇航等[17]專門針對貴州省8個地區(qū)7 866例樣本基因檢測結(jié)果中α-地貧突變頻率從高到低為--SEA、-α3.7、-α4.2以及β-地貧突變頻率以 βCD41-42(-CTTT)、βCD 17 (A>T)、βIVS-II-654 (C>T)、βCD 26 GAG>AAG[Glu>Lys]、β-50 (G>A)的結(jié)果不完全一致，但常見的基因突變類型基本相符，這可能是因?yàn)榍髂现菖徳颇鲜『蛷V西省，尤其是望謨縣和冊亨縣緊鄰廣西省的百色市，興義市緊鄰云南省的昆明、羅平等地，與兩個地區(qū)通婚交往密切，而這兩個省區(qū)是我國地貧高發(fā)區(qū)所致。本研究結(jié)果還與國內(nèi)學(xué)者報道的其他南方地區(qū)(廣東、廣西、福建、海南等)α-地貧以--SEA頻率最高、β-地貧以βCD41-42(-CTTT)頻率最高和αβ-復(fù)合型地貧以--SEA/αα&βCD41-42(-CTTT)/βN基因型最高不一致[18-23]，均表明了地貧基因存在一定的地域性特點(diǎn)，可依據(jù)不同省區(qū)和群體的自身變異特點(diǎn)采取不同的篩查方式，以避免地貧防治中人力物力的不必要浪費(fèi)和減輕患者的負(fù)擔(dān)。值得注意的是：在本研究中共發(fā)現(xiàn)了29種致病性尚不清楚的新發(fā)基因突變，其中單純α-地貧基因突變不確定類型有12種共36例，單純β-地貧基因突變不確定類型有17種共45例，αβ-復(fù)合型地貧基因突變不確定型8例，其致病性有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)了其他如疑似HKαα/--SEA、αCD 16 AAG>GAG[Lys>Glu]α/αα等多種罕見突變類型，同時可豐富我國地貧基因數(shù)據(jù)庫。

綜上所述，本研究采用了基因診斷技術(shù)對貴州黔西南州地區(qū)地貧基因突變類型進(jìn)行大樣本的普篩，得出本地區(qū)特有的基因型數(shù)據(jù)，為黔西南州地區(qū)地貧的產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供準(zhǔn)確可靠的依據(jù)，為做好該地區(qū)地貧防治工作提供保障。