田杰， 米娜， 呂之勇， 楊春濤， 劉尊鴻

(1.荊門市第二人民醫(yī)院 麻醉科， 湖北 荊門 448000； 2.荊門市康復(fù)醫(yī)院 麻醉科， 湖北 荊門 448000)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)是指冠狀動(dòng)脈部分或完全急性阻塞后，在一定時(shí)間內(nèi)重新獲得再通時(shí)，雖然缺血心肌獲得恢復(fù)正常灌注、但是心肌組織損傷反而呈現(xiàn)出進(jìn)行性加重的病理過程[1]。MIR的缺血期可誘發(fā)心肌超危結(jié)構(gòu)、心功能、能量代謝、電生理等一系列損傷性變化，因此血管再灌注后的表現(xiàn)突出、甚至可能誘發(fā)重度心律失常而導(dǎo)致患者猝死[2-3]。有學(xué)者對(duì)MIR犬模型進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)缺血前吸入最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration,MAC)異氟醚65 min后再洗出5 min，能夠發(fā)揮一定的心肌保護(hù)作用，減小心肌梗死面積，因此提出了麻醉藥預(yù)處理概念[4-5]。目前已有越來越多的臨床研究證實(shí)，吸入麻醉藥預(yù)處理對(duì)多種動(dòng)物模型均有一定的作用，可減輕MIR損傷，減小心肌梗死面積[6-7]。MIR損傷發(fā)生后所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)促進(jìn)腎上腺興奮、促使機(jī)體各類炎性因子水平升高，參與機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下認(rèn)知功能的損害過程，因此MIR可能會(huì)損傷患者腦的認(rèn)知功能[8-9]。七氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑，能夠促進(jìn)血管擴(kuò)張、減少心肌氧化、抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)能夠激活線粒體通路，發(fā)揮腦組織保護(hù)效果[10-11]，但其濃度與S100鈣結(jié)合蛋白B(S100 calcium-binding protein B,S100B)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase ,NSE)等中樞神經(jīng)細(xì)胞因子的關(guān)系還有待深入研究。因此，本研究探討不同濃度七氟醚對(duì)MIR大鼠S100B蛋白和NSE水平的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來源 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)健康雄性SD大鼠50只，3月齡，體質(zhì)量為(204.38±5.94)g，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(贛)2015-0001]，所有大鼠分籠飼養(yǎng)在恒溫標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，自由飲食、飲水，每日更換墊料，保持動(dòng)物房清潔，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑與儀器 七氟醚(英國(guó)Abbott)，三苯基四唑氯化物(上海Abbott Laboratories S.A)，氯化鈉、戊巴比妥鈉、硫代巴比妥酸、黃嘌呤氧化酶、0.25%胰酶(上海麥克林生物)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(武漢默沙克生物)；麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(深圳元特)，動(dòng)物呼吸機(jī)(友誠生物)，組織切片機(jī)(杭州富陽康華)，高速組織搗碎勻漿機(jī)(上海舍巖)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫爾特)。

1.2 研究方法

1.2.1造模 腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉。經(jīng)口插入16 G動(dòng)脈留置針管行機(jī)械通氣，設(shè)置潮氣量為3 mL，吸入氧濃度50%，使用燈泡加熱維持大鼠體溫為37 ℃，持續(xù)監(jiān)測(cè)心電圖。常規(guī)備皮，使用碘伏消毒，大鼠采取平臥、稍向右側(cè)傾斜，依次打開心包膜，暴露心臟，明確冠狀動(dòng)脈走向。對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，心肌表現(xiàn)出紫紺、發(fā)白，心電圖出現(xiàn)ST段變化，提示MIR造模成功[12]；松開線結(jié)后心肌缺血區(qū)域紫紺消失，出現(xiàn)充血反應(yīng)，再灌注2 h后，對(duì)大鼠手術(shù)野依次縫合，麻醉清醒后將其放回飼養(yǎng)箱內(nèi)。最終成功構(gòu)建MIR模型大鼠50只。

1.2.2分組及處理 50只MIR模型大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、1%七氟醚+O2組(A組)、2%七氟醚+O2組(B組)、3%七氟醚+O2組(C組)及4%七氟醚+O2組(D組)，每組10只。各組大鼠禁食8 h，置于麻醉誘導(dǎo)箱內(nèi)，行MIR前按照2 L/min的體積流量吸入不同氣體6 h，模型組大鼠吸入O2、A組吸入1%七氟醚和O2、B組吸入2%七氟醚和O2、C組吸入3%七氟醚和O2、D組吸入4%七氟醚和O2；吸入氣體過程中持續(xù)使用烤燈加熱，確保大鼠肛門處溫度維持在(37.0±0.5)℃。

1.2.3心肌危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)面積測(cè)量 “1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠再灌注2 h，再次阻斷左前降支(left anterior descending，LAD)，取心臟安裝在Langendorff裝置上，鹽水持續(xù)沖洗1 min，分離左心室并稱重；左心室置于-20 ℃冰箱冷凍15 min，切成2 mm橫切片，使用含0.2 mmol/L 磷酸鹽(phosphate buffer solution，PBS)緩沖液的1%三苯基四唑氯化物37 ℃水浴切片5 min，取出觀察缺血梗死區(qū)域呈現(xiàn)蒼白色、缺血非梗死區(qū)域?yàn)榧t色，分離缺血梗死區(qū)域、缺血未梗死區(qū)域及正常區(qū)域，并分別稱重，計(jì)算危險(xiǎn)左心室面積(危險(xiǎn)左心室面積=非梗死區(qū)面積+梗死區(qū)面積)和梗死面積(梗死面積=缺血梗死區(qū)重量/危險(xiǎn)左心室面積重量)。

1.2.4血清炎性因子檢測(cè) “1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠再灌注2 h，抽取尾靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液，以ELISA試驗(yàn)檢測(cè)血清核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuclear transcription factor kappa B,NF-kB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平。

1.2.5心肌組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonyl dialdehyde,MDA)檢測(cè) 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠左心室前壁心肌組織1 g，置于預(yù)冷的0.9 %氯化鈉溶液，制備10%的組織勻漿，分別使用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定心肌組織SOD活性和MDA活性。

1.2.6心肌損傷指標(biāo)檢測(cè) (1)心肌磷酸化蛋白激酶 B(phosphorylation of kinase B,p-Akt)、總蛋白激酶 B(total kinase B,t-Akt)表達(dá)量：取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠左心室前壁心肌組織1 g提取組織蛋白，使用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)蛋白含量。取蛋白樣品50 μg，電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)移法使其置于硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane,NC)膜上，封閉2 h，依據(jù)1 ∶100配比加蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抗體，4 ℃過夜，使用PBS洗膜3 次、5 min/次，加二抗，置于37 ℃下反應(yīng)2 h，PBS洗膜3次、5 min/次，顯色，使用電泳成像儀掃描獲得灰度值，記錄心肌p-Akt、t-Akt表達(dá)量。(2)B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B cell lymphoma protein2,Bcl-2)表達(dá)量檢測(cè)：取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠心肌組織切片置于烤箱內(nèi)，60 ℃放置24 h，脫蠟至水；制備濃度為3%過氧化氫，室溫放置10 min，水洗3次、3 min/次；取0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，加熱至沸騰，10 min后再次加熱至沸騰，自然冷卻，洗3次、3 min/次；封閉20 min，去掉多余液體，加1 ∶100配比的兔抗鼠抗體，置于37 ℃保溫箱2 h，PBS洗3次、3 min/次；加山羊抗血清抗兔IgG，置于37 ℃保溫箱20 min，PBS洗3次，3 min/次；加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)，置于37 ℃保溫箱20 min，PBS洗4次、3 min/次；使用蒸餾水洗滌殘留染色劑，加蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片，觀察。(3)心肌細(xì)胞凋亡率：取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠心肌組織，使用0.25%胰酶處理心肌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡心肌細(xì)胞。

1.2.7血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) “1.2.2”項(xiàng)下各組大鼠再灌注2 h后，采用動(dòng)物無創(chuàng)血壓計(jì)BP-2006A測(cè)量心率(heart rate,HR)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)、心率與收縮壓乘積(rate-pressure product,RPP)水平。

1.2.8腦組織NSE、S100B蛋白檢測(cè) 取“1.2.3”項(xiàng)下各組大鼠腦組織勻漿，2 000 r/min離心5 min，取上清液置于-20 ℃冰箱。(1)酶法測(cè)定NSE：取出組織復(fù)溫，稀釋標(biāo)本為100 μL，混勻覆膜，置于37 ℃下反應(yīng)2 h，棄液體，甩干，加生物素標(biāo)記抗體100 μL，置于37 ℃下反應(yīng)1 h，重復(fù)上述操作1次；取辣根過氧化物酶工作液100 μL，置于37 ℃下反應(yīng)1 h，棄液體，甩干，洗板5次，加洗滌緩沖液350 μL，甩干；取底物溶液90 μL加入各孔，置于37 ℃下避光顯色30 min，可見梯度藍(lán)色；各孔均加終止液50 μL，藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，15 min后使用酶聯(lián)儀測(cè)定各孔光密度(optical density,OD)值、乘稀釋倍數(shù)，得NSE濃度。(2)酶法測(cè)定S100B蛋白：取出酶法試劑盒，室溫下放置30 min，每孔均加標(biāo)準(zhǔn)品液體100 μL和酶標(biāo)記溶液50 μL，封口，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h；沖洗酶標(biāo)板5次，拍干，各孔內(nèi)分別加顯色劑A 和顯色劑B各50 μL，避光15 min，加終止液50 μL，停止反應(yīng)后測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得S100B蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)面積

各組大鼠心肌危險(xiǎn)區(qū)域面積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌梗死區(qū)域面積均減少，且隨著七氟醚濃度的升高而減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠心肌危險(xiǎn)區(qū)域和梗死區(qū)域面積Tab.1 Area of myocardial risk zone and infarct zone of

2.2 血清炎性因子水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠血清NF-kB、TNF-α及IL-6水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平Tab.2 Levels of serum inflammatory factor of rats in each

2.3 心肌組織SOD和MDA水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠的心肌組織SOD水平升高，MDA水平降低，且隨著七氟醚濃度的升高SOD水平升高、A組B組>C組>D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠心肌組織SOD和MDA水平Tab.3 Levels of SOD and MDA in myocardial tissue of rats in each

2.4 心肌損傷指標(biāo)

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、p-Akt、t-Akt及Bcl-2水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠心肌損傷指標(biāo)水平Tab.4 Levels of myocardial injury index of rats in each

2.5 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

模型組及A、B、C、D組大鼠HR、MAP、RPP水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表5)。

表5 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)Tab.5 Hemodynamic index of rats in each

2.6 腦組織NSE和S100B蛋白水平

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠腦組織NSE、S100B蛋白水平均降低，且隨著七氟醚濃度的升高而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表6)。

表6 各組大鼠腦組織NSE和S100B水平Tab.6 Levels of NSE and S100B in brain tissue of

3 討論

目前臨床中常規(guī)心臟手術(shù)和移植期間，給予患者必要的缺血和再灌注能夠發(fā)揮一定的心臟保護(hù)作用，具有較佳的臨床意義，但這項(xiàng)措施也可能在一定程度上造成心臟功能障礙，表現(xiàn)為心肌輕度驚厥至心臟不可逆壞死，因此臨床上常使用鈣通道阻滯劑以減少缺血和再灌注損傷，近年來已經(jīng)有大量研究顯示給予MIR患者缺血預(yù)處理可發(fā)揮內(nèi)源性心臟保護(hù)機(jī)制[13-14]。綜合分析既往文獻(xiàn)中MIR的發(fā)生機(jī)制，認(rèn)為MIR時(shí)活性氧生成增多，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，再灌注誘發(fā)的炎癥介質(zhì)和趨化因子及細(xì)胞凋亡等因素均為其發(fā)生機(jī)制[15-16]。因此目前臨床關(guān)注于緩解炎性反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)效果及減少M(fèi)IR所造成的損傷[17]。七氟醚常用于吸入和靜脈麻醉聯(lián)合的全身麻醉中，作用效果短，患者蘇醒快，且不會(huì)過度影響血流動(dòng)力學(xué)，毒副效果小，且不同濃度的七氟醚對(duì)大鼠的記憶和認(rèn)知功能均有一定影響，提示七氟醚可能對(duì)MIR有一定的作用，具有心肌保護(hù)和腦神經(jīng)保護(hù)效果[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌梗死區(qū)域面積均縮小，血清NF-kB、TNF-α及IL-6水平均降低，后者為臨床常用的炎性指標(biāo)，其水平升高提示機(jī)體呈現(xiàn)炎性反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生大量中性粒細(xì)胞，促進(jìn)蛋白水解酶釋放和神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷；予MIR大鼠不同濃度七氟醚預(yù)處理后，大鼠體內(nèi)的各炎性因子水平明顯降低，且隨著七氟醚濃度的升高炎性反應(yīng)緩解效果更佳，避免了對(duì)心肌組織造成損傷，發(fā)揮了心肌保護(hù)效果[20-21]。

與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌組織SOD水平升高，MDA水平降低。SOD和MDA含量變化能夠反映出組織氧化和損傷的程度，其中SOD具有抗氧化作用，其能夠?qū)C(jī)體內(nèi)自由基進(jìn)行清除，而MDA則能夠反映脂質(zhì)過氧化程度，可反映機(jī)體內(nèi)自由基受共計(jì)的程度[22-23]，因此本結(jié)果提示七氟醚能夠降低MDA活性，提高SOD活性，提示其發(fā)揮了較佳的心肌保護(hù)作用。

此外，與模型組相比，A、B、C及D組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、p-Akt、t-Akt及Bcl-2水平均降低，腦組織NSE、S100B蛋白水平均降低，且呈現(xiàn)劑量反應(yīng)。有研究顯示，異丙酚可激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)-Akt信號(hào)通路來發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，其中Akt為該信號(hào)通路中的一員，Bcl-2為其靶分子，具有抗凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活的功效[24]。本研究中給予MIR模型大鼠七氟醚也取得了相似的結(jié)果，提示七氟醚可能通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路發(fā)揮了抗心肌細(xì)胞凋亡和心肌保護(hù)的效果。NSE為臨床常用的腦損傷標(biāo)志物，其水平越高提示腦組織損傷越重；S100B為腦特異性蛋白，其能夠調(diào)節(jié)腦細(xì)胞能量代謝，當(dāng)出現(xiàn)腦損傷時(shí)腦神經(jīng)細(xì)胞損壞，釋放S100B，導(dǎo)致腦組織內(nèi)其含量升高[25]。本研究中給予MIR模型大鼠七氟醚后抑制了鈣離子流入腦組織，減輕了神經(jīng)元鈣超載，修復(fù)了顱腦損傷，且七氟醚具有抗氧自由基功能，可改善腦組織微循環(huán)、提高局部血流、緩解腦水腫、降低腦代謝率，進(jìn)而發(fā)揮了腦組織保護(hù)效果，調(diào)控了NSE和S100B蛋白的含量。

本研究中雖然不同濃度的七氟醚對(duì)MIR模型大鼠均發(fā)揮了一定的作用，但隨著七氟醚濃度的升高作用效果越顯著，呈現(xiàn)一定劑量反應(yīng)，因此將七氟醚應(yīng)用于MIR中的最佳濃度仍需要進(jìn)一步探究，以發(fā)揮最佳效果。

綜上所述，不同濃度七氟醚均能夠改善MIR大鼠的炎性反應(yīng)，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌損傷，縮小心肌梗死面積，保護(hù)大腦神經(jīng)功能，且隨著七氟醚的作用效果呈現(xiàn)劑量反應(yīng)，隨著濃度的升高而作用顯著。