扈進(jìn)冬，李紅梅，吳遠(yuǎn)征，魏艷麗，李紀(jì)順

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生態(tài)研究所 山東省應(yīng)用微生物重點實驗室,山東 濟(jì)南 250103)

山東是蔬菜種植和生產(chǎn)大省，蔬菜播種面積達(dá)200萬公頃，產(chǎn)量達(dá)1.1 億噸[1]，設(shè)施蔬菜栽培面積保持在86.7萬公頃以上，約占全國的四分之一[2]。但連年種植模式以及不合理的施肥、用藥，耕作土壤板結(jié)、酸化、堿化、土傳病害等問題嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。姜、大蔥、黃瓜和草莓是重要的蔬菜品種，萊蕪大姜、章丘大蔥、曲堤黃瓜還是當(dāng)?shù)靥禺a(chǎn)和全國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品，均存在連年栽培、土壤環(huán)境質(zhì)量下降問題，制約著這些作物的健康和可持續(xù)生產(chǎn)。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量、種類及群落結(jié)構(gòu)等與地理位置、土壤類型、作物類型、土壤肥力等密切相關(guān)，并在一定程度上反映了土壤的環(huán)境質(zhì)量。真菌是微生物群落的重要組分，有些真菌具有促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、營養(yǎng)元素循環(huán)、作物生長、控制作物病害等有益作用，也有些真菌會導(dǎo)致植物病害并影響植物產(chǎn)量和質(zhì)量。受溫度、酸堿度、水分和養(yǎng)分等多種土壤環(huán)境因子的影響[3-4]，單一作物連作模式下土壤病原真菌會不斷累積，有益真菌的相對含量則不斷降低，減弱了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，造成土壤真菌群落生態(tài)失衡和作物產(chǎn)量降低[5-7]。本文選用姜和大蔥、黃瓜和草莓分別作為露地蔬菜和設(shè)施蔬菜的典型代表，通過熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和擴(kuò)增子測序技術(shù)，檢測并分析了這些作物土壤中真菌群落組成及多樣性狀況，結(jié)合土壤理化性質(zhì)測定，分析了土壤真菌群落與環(huán)境相關(guān)因子間的關(guān)系，以期闡釋不同真菌群落多樣性與蔬菜土壤環(huán)境質(zhì)量關(guān)系，為土壤環(huán)境質(zhì)量的改善提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣與處理

1.1.1 取樣位點概況

土壤采樣點分別位于濟(jì)南市歷城區(qū)張而鎮(zhèn)、萊蕪區(qū)、濟(jì)陽區(qū)曲堤鎮(zhèn)、章丘區(qū)。隨機(jī)選取草莓大棚樣品10個、黃瓜大棚樣品10個、大蔥種植區(qū)樣品10個、大姜種植區(qū)樣品10個，每個采樣點間隔大于1 000 m以上。

1.1.2 采樣方法與處理

土壤樣品采集時間為2021年9月中旬，使用土壤采集器采集土壤樣品，取樣時去除表層土，鉆取0～20 cm土壤，每個采樣點隨機(jī)5點取樣混合后作為1個土壤樣品，置入冰盒內(nèi)低溫保存。樣品均勻混合后過20目細(xì)篩去除石塊和植物殘體，-80 ℃保存?zhèn)溆?。剩余土?約200 g)置于室內(nèi)自然風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)測定，包括：pH、電導(dǎo)率、全氮(TN)、堿解氮(AN)、速效磷(RP)、速效鉀(RK)測定。

每個土樣準(zhǔn)確稱取0.3 g冷凍土壤，使用DNeasy PowerSoil Kit (QIAGEN, USA)土壤微生物DNA提取試劑盒提取土壤基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量后-20 ℃保存。

1.2 實時熒光定量 PCR

以土壤基因組 DNA 為模板，采用引物 ITS1F (5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′)和 ITS2R(5′- GCTGCGTTCTTCATCGATGC -3′ )[8]進(jìn)行實時qPCR，測定土壤真菌 ITS 序列拷貝數(shù)。以含有釀酒酵母的18SrRNA基因的質(zhì)粒的10倍稀釋液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(基因拷貝數(shù)范圍從3.0×103到3.0×107)。采用三步方案進(jìn)行qPCR反應(yīng)：在95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)反應(yīng)；循環(huán)結(jié)束后，樣品加熱到95 ℃，立刻降至60 ℃保持5 s，每5 s提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。qPCR反應(yīng)體系(20 μL)包括10 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix預(yù)混液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，20 μmol/L正向和反向引物各1 μL，DNF Buffer 2 μL，5 μL分子級水和1 μL土壤樣品DNA。每樣本均三次重復(fù)，結(jié)果表示為每克土壤目標(biāo)拷貝數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本中總真菌ITS 序列拷貝數(shù)。

1.3 真菌ITS基因的Illumina MiSeq測序

每種作物分別選擇了10個DNA樣本用于土壤真菌群落分析。PCR擴(kuò)增選取真菌ITS基因的ITS2區(qū)，使用帶Barcode序列的引物對ITS3(CCAGCASCYGCGGTAATWCC)和ITS4(ACTTTCGTTCTTGATYRA)[9]進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后對其產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物Qubit2.0定量，根據(jù)測定DNA濃度將樣品等比例混合均一化形成測序文庫，在上海生工生物工程股份有限公司Illumina MiSeq測序平臺PE300進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

土壤理化性質(zhì)檢測數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism (ver.8.0)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法分析數(shù)據(jù)差異顯著性；高通量測序完成后經(jīng)過數(shù)據(jù)處理獲得在97%相似水平下的OTU表，采用R語言(windows版v.4.1.0) vegan、picante包計算香農(nóng)指數(shù)和操作分類單元數(shù)、使用FunGuild數(shù)據(jù)庫(http://www.stbates.org/guilds/app.php)[10]進(jìn)行真菌功能預(yù)測分析，ggplot2包繪制真菌群落豐度、α-多樣性和土壤真菌FunGuild功能分類組成的相對豐度(單因素方差分析(single-way ANOVA)在P<0.05的概率水平下確定最小顯著差異)[11]。使用STAMP軟件分析不同作物土壤中真菌群落和功能的相對豐度[12]；使用深圳微生態(tài)科技有限公司提供的生物信息云平臺進(jìn)行RDA分析(https://www.bioincloud.tech)。

2 結(jié)果

2.1 不同作物土壤的理化性質(zhì)

表1顯示不同作物土壤中6種環(huán)境因子組間存在明顯差異(P<0.05)，露地蔬菜土壤與設(shè)施蔬菜土壤之間差異明顯，其中露地蔬菜作物姜和大蔥土壤中的全氮含量與電導(dǎo)率大大低于設(shè)施蔬菜作物黃瓜和草莓土壤，黃瓜土壤的全氮、有效磷、速效鉀、堿解氮以及電導(dǎo)率均顯著高于其他作物土壤，而大蔥土壤中的全氮、有效磷、速效鉀、堿解氮相對較低。

表1 四種蔬菜作物種植土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of different crops’ soils

2.2 不同作物土壤中真菌群落的豐度

以真菌ITS拷貝數(shù)為指標(biāo)，采用qPCR檢測了不同作物土壤真菌群落豐度，如圖 1 所示，四種作物土壤中，大蔥土壤中真菌群落豐度最低，姜土壤真菌群落豐度最高，且有顯著差異(P<0.05)；黃瓜和草莓土壤真菌群落豐度介于大蔥和大姜土壤之間，二者沒有顯著性差異。

注：圖中數(shù)字表示采用t檢驗計算的兩種作物土壤之間的具有差異的概率值。圖1 不同作物的土壤真菌群落豐度Fig.1 Abundance of soil fungal communities in different crops

2.3 不同作物土壤中真菌群落α-多樣性

測序后40個土壤樣本共得到高質(zhì)量序列1 476 130條。在97%的相似性水平下聚類操作分類單元(OTU)，同時過濾豐度低于萬分之一的OTU，并按照最少序列數(shù)樣本整體抽平到13 563條序列，經(jīng)UNITE數(shù)據(jù)庫比對后40個樣本共聚類得到541個真菌OTU。

圖2顯示，大蔥土壤真菌群落多樣性最豐富，草莓土壤真菌群落多樣性最差(香農(nóng)指數(shù))；與黃瓜、草莓設(shè)施蔬菜土壤相比，露地作物大蔥和大姜的土壤真菌群落豐富度更高(香農(nóng)指數(shù)，但黃瓜和姜之間差異不顯著，P<0.05)。姜土壤真菌群落豐富度最高，黃瓜土壤真菌群落豐富度最低；與設(shè)施黃瓜、草莓土壤相比，露地大蔥和姜土壤真菌群落豐富度更高(操作分類單元數(shù)OTUs，P<0.05)。露地作物大蔥和姜之間，設(shè)施黃瓜和草莓之間的真菌群落豐富度和群落多樣性差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同作物土壤中真菌群落α多樣性Fig.2 Alpha-diversity of fungal communities in the soils of different crops

2.4 不同作物土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)物種注釋結(jié)果，對不同作物土壤樣本的物種進(jìn)行分類，得到不同作物土壤樣本在門水平下的物種相對豐度柱狀堆積圖。如圖3所示，子囊菌門(Ascomycota)是不同作物土壤中最主要的真菌門類，占比73.36%～84.61%；其次擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)也是含量比較豐富的優(yōu)勢菌門，但在不同作物土壤中占比有明顯差異，如擔(dān)子菌門在黃瓜和草莓土壤中相對豐度低于1%，而大蔥和姜土壤中擔(dān)子菌門相對豐度均大于6%。通過STAMP差異比較不同作物土壤樣本之間物種在門水平上的相對豐度，發(fā)現(xiàn)草莓土壤與大蔥土壤的子囊菌門、壺菌門和擔(dān)子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；草莓土壤與姜土壤的子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；草莓土壤與黃瓜土壤的擔(dān)子菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；黃瓜土壤與大蔥土壤的子囊菌門和壺菌門相對豐度差異顯著(P<0.05)；黃瓜土壤與姜土壤的被孢霉門相對豐度差異顯著(P<0.05)；其余組合之間無顯著性差異。

注：縱軸表示真菌門類群，每一列表示對應(yīng)門類的平均相對豐度，不同顏色表示不同作物土壤，最右邊是對應(yīng)的P值。圖3 不同作物土壤真菌群落在門水平上的差異檢驗Fig.3 Difference test of phylum level of soil fungal communities for different crops

2.5 不同作物土壤中功能真菌類群的豐度分析

圖4顯示了不同作物土壤中功能真菌類群的相對豐度，在姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤的功能真菌類群中排泄物腐生菌、植物腐生菌、土壤腐生菌等營腐生真菌相對豐度分別為37.05%、12.26%、32.97%、43.68%，是土壤真菌的重要功能類群；草莓土壤中營腐生真菌占比最高，顯著高于黃瓜、大蔥土壤中營腐生真菌類群豐度(P>0.05)。姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤中植物病原菌相對豐度分別為3.21%、0.72%、4.24%和2.24%；黃瓜土壤中植物病原真菌類群占比最低，但與其余三種作物土壤中植物病原真菌類群豐度無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同作物土壤中功能真菌的組成Fig.4 Composition of functional fungi in the soils of different crops

2.6 不同作物土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

不同作物土壤理化性質(zhì)與土壤真菌群落間的冗余分析(redundancy analysis，RDA)如圖5所示。結(jié)果展示了不同作物土壤真菌群落與pH、總氮、堿解氮、有效磷、速效鉀、電導(dǎo)率6種環(huán)境因子的相關(guān)性，排序軸RDA1和排序軸RDA2方差變量解釋分別為31.76%和22.17%，累計解釋了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)累積方差變量的53.93%，說明RDA排序結(jié)果是比較可靠的，在不同作物土壤中6種環(huán)境因子對其真菌群落組成有顯著性影響(P<0.05)；排序軸RDA1與堿解氮的正相關(guān)性最大，相關(guān)性系數(shù)為0.999 2；排序軸RDA2 與pH的正相關(guān)性最大，相關(guān)性系數(shù)為0.300 8；與電導(dǎo)率值的負(fù)相關(guān)性最大，相關(guān)性系數(shù)為-0.806 9(表2)，6種環(huán)境因子中pH和RP與土壤真菌群落的相關(guān)程度最大，分別為0.438 7和0.367 3。

從真菌群落組成上看，在土壤中相對豐度大于0.5%的真菌門類中，子囊菌門受pH的影響最大，呈正相關(guān)，而與電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)；捕蟲霉門(Zoopagomycota)受電導(dǎo)率影響較大、呈正相關(guān)；被孢霉門受RP影響最大，呈負(fù)相關(guān)；毛霉門(Mucoromycota)受RK影響較大，呈負(fù)相關(guān)；壺菌門受全氮和堿解氮影響較大，呈負(fù)相關(guān)；擔(dān)子菌門受電導(dǎo)率影響較大、呈負(fù)相關(guān)(圖5)。

表2 排序軸RDA與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系Tab.2 Correlation between the sorting axes RDA and environmental factors

圖5 不同作物土壤真菌群落組成及門水平真菌類群與環(huán)境因子的RDA分析Fig.5 Redundancy analysis of the relationship between crop soil fungal community composition or phylum level fungal groups and environmental factors

3 討論

通過土壤DNA的高通量測序結(jié)果可以看出，子囊菌、擔(dān)子菌、被孢菌門、壺菌門、捕蟲霉門等真菌類群相對豐度占比較高，是土壤真菌的主要真菌組分，在總的土壤真菌中平均占比大于1%；毛霉門和捕蟲霉門也是重要的真菌門類，占比次之。多樣性分析表明大蔥和姜土壤中真菌群落香農(nóng)指數(shù)高，OTU數(shù)多，多樣性更為豐富；黃瓜和草莓土壤樣品取自大棚，香農(nóng)指數(shù)低，OTU數(shù)低，多樣性較低。此外，本項研究發(fā)現(xiàn)露地蔬菜土壤子囊菌含量低于設(shè)施蔬菜土壤子囊菌含量，分別為72.37%、73.45%、93.28%和83.61%；被孢霉門含量相對較高，分別為3.08%、5.83%和1.91%和0.92%。有研究表明在發(fā)病土壤中子囊菌Ascomycota的相對豐度更高，而在健康土壤中被孢霉門Mortierellomycota卻更多[13]，還有文獻(xiàn)報道，在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中被孢霉豐度很高，是土壤碳及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵真菌類群[14]。上述結(jié)果說明露地蔬菜土壤微生物生態(tài)狀況優(yōu)于設(shè)施蔬菜土壤微生物生態(tài)。究其原因，從土壤理化性質(zhì)分析結(jié)果可以看出，農(nóng)戶在設(shè)施蔬菜種植過程施用比露地蔬菜更多的化學(xué)肥料，使得設(shè)施蔬菜土壤中N、P、K營養(yǎng)成分明顯高于露地蔬菜土壤，土壤電導(dǎo)率值偏高，土壤板結(jié)，從而造成了土壤微生物群落失衡。

依據(jù)FunGuild數(shù)據(jù)庫在線比對結(jié)果獲得姜、黃瓜、大蔥和草莓土壤中植物病原菌相對豐度，姜和大蔥的相對豐度更高，似乎其土壤真菌群落變得比設(shè)施蔬菜更不適宜，但將高通量測序獲得的相對豐度乘以qPCR定量獲得的土壤總真菌絕對量則發(fā)現(xiàn)，黃瓜和草莓土壤中病原真菌ITS序列拷貝數(shù)分別為每克土壤1.84×106和8.54×106，而大蔥和姜土壤中的病原真菌ITS序列拷貝數(shù)分別為每克土壤5.67×105和2.78×107上述結(jié)果顯示，不同作物土壤中病原真菌相對豐度無明顯差異，但伴隨土壤真菌總豐度的增加病原真菌絕對量會同比大幅升高，大大增加了作物病害發(fā)生幾率，這與當(dāng)前萊蕪姜種植區(qū)莖基腐病、姜根腐病等土傳病害頻發(fā)相一致[15]，需要引起高度重視。因此，需從改善土壤質(zhì)量入手，增施木霉、芽孢桿菌等有益菌，減施化學(xué)肥料，配施有機(jī)肥，降低土壤真菌豐度，改善真菌群落結(jié)構(gòu)，為作物營造健康土壤環(huán)境。

真菌是土壤的重要組分，與細(xì)菌、原生動物等微生物共同參與土壤的養(yǎng)分和水分的生物地球化學(xué)循環(huán)[15]，并在多方面影響作物生長、控制作物疾病發(fā)生[4-5]，其豐度和組成可作為土壤健康評估的重要指標(biāo)[16-17]，本研究分析了不同作物土壤真菌群落組成和多樣性，并探討了其與環(huán)境因子相互關(guān)系，為土壤環(huán)境質(zhì)量的改善、提升提供了理論依據(jù)。