余郭芳，田麗偉，趙晨玲，吳夢(mèng)婷，楊文明，董婷*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，安徽合肥230031)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是一類以記憶功能下降和認(rèn)知受損為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，多發(fā)病于老年人[1]。有調(diào)查報(bào)道AD在60歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)為2.22%[2]，已嚴(yán)重威脅老年人的生活質(zhì)量。但時(shí)至今日，AD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，化學(xué)藥物抗AD的效果仍不顯著，且不良反應(yīng)多，因此研發(fā)安全有效的藥物刻不容緩。

安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院以黨參、黃精、川芎、石菖蒲為主要藥材，研發(fā)了智腦膠囊[3]。君藥為黨參，起養(yǎng)血生津、榮養(yǎng)腦竅之效，臣藥為石菖蒲和黃精，行益精填髓、益智化痰之功，佐用川芎活血行氣，共湊補(bǔ)腎益髓、益智化瘀、健脾豁痰之效[4]。此復(fù)方抗AD作用在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均已證實(shí)[5-6]。但智腦膠囊治療AD的作用機(jī)制在分子層面上缺乏系統(tǒng)的生物學(xué)分析，故本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步分析藥物與疾病的相互關(guān)系，對(duì)智腦膠囊治療AD的可能機(jī)理進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 篩選智腦膠囊有效成分和AD靶點(diǎn)

在TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)中，以智腦膠囊中各單味中藥的名稱(黨參、川芎、黃精、石菖蒲) 為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，確定口服生物利用度( oral bioavailability，OB) ≥30% 和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.Uniprot.org/)幫助下，將篩選出的每種中藥有效成分和相對(duì)應(yīng)的可能靶點(diǎn)進(jìn)行修正，并轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)的基因名，設(shè)置限定物種為人類，由此獲得了智腦膠囊活性成分靶點(diǎn)。

在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中檢索“Alzheimer′s disease”，在獲得AD相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)后,再對(duì)每個(gè)靶位進(jìn)行合并去重。

1.2 構(gòu)建智腦膠囊與AD相關(guān)靶標(biāo)的交集

為了深入研究智腦膠囊與AD之間的關(guān)系，本文采用Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取AD和智腦膠囊活性成分的交互靶標(biāo)，最后運(yùn)用軟件Cytoscape3.7.1制作中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型。

1.3 構(gòu)架蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

導(dǎo)入AD的潛在作用靶點(diǎn)至STRING (https://string-db. org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，定義物種為人類，獲取蛋白與蛋白之間的交互信息，接著把獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件 Cytoscape3.7.1，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。最后通過CytoNCA 插件分析度數(shù)中心性(degree centrality，DC)、間隔中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)等內(nèi)容，根據(jù)多次中位數(shù)篩選獲得核心基因。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

運(yùn)用 Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org)對(duì)交集基因?qū)嵤?GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes )富集分析?；蚬δ芊謩e從細(xì)胞組成(cell composition，CC)，生物過程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)等多個(gè)層面進(jìn)行注釋。過濾條件為P<0.05，輸出分析結(jié)果。然后借用微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)將結(jié)果可視化處理，并繪制相應(yīng)的條形圖與氣泡圖。

1.5 分子對(duì)接

為檢驗(yàn)上述分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用分子對(duì)接計(jì)算出1.2節(jié)得到的智腦膠囊關(guān)鍵活性成分與AD認(rèn)知障礙的核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能，評(píng)價(jià)其結(jié)合活性。首先選取度值前3的核心靶點(diǎn)，找到其對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵成分，再在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載關(guān)鍵成分的小分子配體文件，使用AutoDockTools 1.5.6加氫處理后輸出為pdbqt格式。大分子受體文件首先在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋核心靶點(diǎn)，經(jīng)已驗(yàn)證及人類物種篩選后，復(fù)制核心靶點(diǎn)的基因ID，利用基因ID在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載對(duì)應(yīng)的大分子，輸出為pdb格式，同樣使用軟件AutoDockTools 1.5.6進(jìn)行脫水加氫處理，以pdbqt格式輸出。將配體受體文件經(jīng)利用 Autodock Vina進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算各靶點(diǎn)之間的結(jié)合能，最后利用Pymol 2.4.2軟件將結(jié)果可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 收集智腦膠囊有效成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的收集篩選并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，去重整理后共得到智腦膠囊活性成分24個(gè)，主要活性成分見表1，全表見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。其中黨參10個(gè)，黃精6個(gè)，石菖蒲4個(gè)，川芎3個(gè)，川芎與石菖蒲共同成分1個(gè)。

表1 智腦膠囊主要活性成分信息Table 1 Information on the active ingredients of Zhinao Capsules

2.2 中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將智腦膠囊的有效成分和藥物基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中繪制中藥-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。

該圖由198個(gè)節(jié)點(diǎn)、315個(gè)邊組成，其中包括有效成分24個(gè)，靶點(diǎn)170個(gè)。平均單個(gè)節(jié)點(diǎn)作用1.5個(gè)靶點(diǎn)，單個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)7個(gè)靶點(diǎn)。這也揭示了智腦膠囊治療的AD是采用多成分、多靶點(diǎn)、多路徑方法來發(fā)揮作用的。用CytoNCA 插件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治龊?，選取DC值最高的的木犀草素、山奈酚、黃芩苷，表明這些有效活性成分可能為智腦膠囊關(guān)鍵成分。

2.3 預(yù)測(cè)智腦膠囊治療AD的靶點(diǎn)

以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞在OMIM、GeneCards 、TTD等數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索到相關(guān)靶點(diǎn)1 329個(gè)、 1 735個(gè)、1 844個(gè)，去重后取其交集基因，得到

疾病基因靶點(diǎn)共645個(gè)，最后利用維恩圖，如圖1所示，將上述疾病基因靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得交集靶點(diǎn)58個(gè)。

圖1 疾病與藥物交集靶點(diǎn)圖Fig.1 Matching target between disease and drug

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選出的58個(gè)AD基因靶點(diǎn)和智腦膠囊藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，選擇人類為研究物種，設(shè)置最低置信區(qū)間<0.9，并把無關(guān)聯(lián)的游離點(diǎn)隱藏起來，繪制出靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，最后導(dǎo)入Cytoscape3.7.1可視化處理，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，代表其相關(guān)度越高，根據(jù)度值選取排名前3的靶點(diǎn)，分別為AKT1(degree=49)、IL-6(degree=47)、TNF(degree=46)。

2.5 智腦膠囊治療AD靶點(diǎn)的GO、KEGG富集分析

借助Metaspace數(shù)據(jù)庫(kù)，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入后進(jìn)行生物通路過程分析，得到1 225條BP、65條CC、99條MF，KEGG富集分析得到174條目錄。以P值為篩選條件選取GO功能BP、CC、MF各前10條目錄。如OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3所示，得出智腦膠囊生物功能主要涉及激素反應(yīng)、氮化合物、磷酸化正調(diào)控、活性氧反應(yīng)等，細(xì)胞組分以膜筏、膜小凹、突觸后膜、樹突等為主，分子功能涉及泛素樣蛋白連接酶結(jié)合和磷酸酶結(jié)合等。前20條的KEGG信號(hào)通路主要包含脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化、TNF信號(hào)通路，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

依據(jù)2.2和2.4結(jié)果，選擇度值前三的智腦膠囊關(guān)鍵有效成分木犀草素、山奈酚、黃芩苷以及靶點(diǎn)AKT1、IL-6、TNF，運(yùn)用Autodock Vina軟件將其分別進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能，得到TNF與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-8.0、-7.3、-7.1 kcal/mol(1 cal=4.186 J)，AKT1與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-5.5、-6.7、-6.0 kcal/mol，IL-6與山奈酚、黃芩苷、木犀草素分別為-6.1、-6.2、-6.3 kcal/mol,見表2。選取結(jié)合能前三的山奈酚與TNF、黃芩苷與TNF、木犀草素與TNF利用Pymol軟件將其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步可視化分析，結(jié)果見圖2。

表2 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 2 Binding energy of key active ingredients to core targets

圖2 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接圖Fig.6 Docking diagram of key ingredients and core target molecules

3 討論

AD被認(rèn)為屬于中醫(yī) “呆病”“健忘”等疾病范疇。《素問》云“腎封藏之本，精之處也”?！秱摗酚涊d“……本有久瘀血，故令善忘”。朱丹溪提出“健忘……多亦有痰”。故中醫(yī)以為“腎精虧虛，髓減腦消”是該病病機(jī)基礎(chǔ)，“痰瘀互結(jié)”是病機(jī)關(guān)鍵。智腦膠囊作為本院內(nèi)制劑，善于填精益髓的同時(shí)兼?zhèn)浠硖祷觥ＥR床用于改善患者記憶功能[7]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證明智腦膠囊通過調(diào)控膽堿能通路[8]、下調(diào)淀粉APP mRNA的表達(dá)來改善小鼠記憶功能[9]。

淀粉樣蛋白(Amyloid-β , Aβ)可以激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子和毒性介質(zhì)形成神經(jīng)炎癥，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，這會(huì)進(jìn)一步刺激加重AD患者腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，致使患者病情進(jìn)一步加重。且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AD患者TNF-α和IL-6水平有明顯升高的趨勢(shì)[10]，抗炎也是西藥治療AD的重要手段。因此炎癥反應(yīng)與AD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

(1)山奈酚、黃芩苷、木犀草素是智腦膠囊治療AD的關(guān)鍵有效成分

本研究發(fā)現(xiàn)山奈酚、黃芩苷、木犀草素與AD相關(guān)靶點(diǎn)作用最為密切，相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)其可以通過抗炎抗氧化等途徑來改善記憶功能[11-14]。黃芩苷通過促進(jìn)Beclin1和微管結(jié)合蛋白1輕鏈3分子(LC3)的生成并減少淀粉肽的生成來發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[11-13]。山奈酚可以增強(qiáng)NF-κB、磷酸化 p38 絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)等信號(hào)通路的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)抗炎抗氧化作用[15-17]。作為山奈酚同分異構(gòu)體的木犀草素，同樣具備抗炎抗氧化作用，通過激活A(yù)kt信號(hào)表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平，達(dá)到抗氧化作用[18-20]。因此，可以推測(cè)它們是智腦膠囊治療AD的關(guān)鍵有效成分。

(2)AKT1、IL-6、TNF為智腦膠囊治療AD的核心靶點(diǎn)

依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果， AKT1、IL-6、TNF可能是智腦膠囊治療AD的核心靶點(diǎn)。AKT作為蛋白激酶，AKT1是其中一種亞型，位于PI3k蛋白下游，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，抑制細(xì)胞凋亡等作用[21]。例如當(dāng)AKT蛋白被激活時(shí)，促進(jìn)下游NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞存活[22]；還可以上調(diào)mTOR的表達(dá)來減少Aβ40的生成[23]；此外AKT還可以抑制GSK-3β的表達(dá)，繼而抑制Tau蛋白磷酸化，改善小鼠的記憶能力[24]。TNF分為TNF-α和TNF-β，和IL-6相似，同為促炎癥因子，可以誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，上調(diào)淀粉樣前體蛋白( amy-loid protein precursor，APP)的表達(dá)[25]。因此抑制炎癥通路的表達(dá)可以提升一定的學(xué)習(xí)記憶能力，改善AD癥狀[26]。

(3)智腦膠囊治療AD的可能機(jī)制

GO功能富集分析，結(jié)果表明智腦膠囊通過激素反應(yīng)、磷酸化調(diào)控和氧化應(yīng)激等BP，泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等MF，神經(jīng)細(xì)胞的膜筏、膜小凹、突觸后膜、樹突等CC治療AD。KEGG結(jié)果顯示智腦膠囊治療AD的核心通路涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化、TNF信號(hào)通路。APP通過α 分泌酶和β 分泌酶切割后形成Aβ淀粉樣蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂質(zhì)的降低可以上調(diào)分泌酶的表達(dá)，促進(jìn) Aβ的生成。動(dòng)脈粥樣硬化則可引起腦部缺血，增加腦部淀粉樣蛋白的沉積以及神經(jīng)炎癥因子的釋放。因此抑制脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化通路的表達(dá)，可以減少Aβ的沉積、減輕神經(jīng)炎癥，緩解認(rèn)知障礙[27]。TNF信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生。智腦膠囊的關(guān)鍵成分山奈酚、木犀草素和黃芩苷均具有抗炎能力，由此推測(cè)智腦膠囊主要是通過調(diào)控TNF信號(hào)發(fā)揮抗炎作用，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療AD的效果。分子對(duì)接結(jié)果表明，TNF靶點(diǎn)對(duì)山奈酚、木犀草素和黃芩苷顯示出良好的結(jié)合能力。其中山奈酚結(jié)合能力更佳，結(jié)合能-8.0 kcal/mol。這恰好符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果。

4 結(jié)語

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)智腦膠囊治療AD的作用機(jī)理開展了初步探討。結(jié)果顯示，山奈酚、黃芩苷、木犀草素是智腦膠囊的關(guān)鍵有效成分，并作用核心靶點(diǎn)TNF，并通過脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化和TNF信號(hào)通路抑制Aβ生成，減輕炎癥反應(yīng)。這奠定了大智腦膠囊在臨床使用的理論依據(jù),同時(shí)也為今后更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究打下了基礎(chǔ)。