隆 佩,鄧仁健*,楊 宇,金貴忠,黃中杰,周新河,王西峰,王 闖

銻氧化菌sp. AO-1的分離鑒定及其對Sb(III)的氧化性能

隆 佩1,鄧仁健1*,楊 宇1,金貴忠2,黃中杰1,周新河3,王西峰1,王 闖1

(1.湖南科技大學土木工程學院,湖南 湘潭 411201；2.錫礦山閃星銻業(yè)有限責任公司,湖南 婁底 417500；3.中國煤炭地質(zhì)總局水文地質(zhì)局環(huán)境公司,河北 邯鄲 056001)

采用抗性篩選法從錫礦山篩選出一株銻氧化菌,并利用分子生物學技術對其進行鑒定;考察了其氧化Sb(Ⅲ)的性能和氧化次生礦物的特征.結(jié)果表明:銻氧化菌屬于假單胞菌屬(),將其命名為sp. AO-1(簡稱:AO-1);影響AO-1氧化Sb(III)的因素主要有溶液pH值、溶解氧和鐵錳氧化物(單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2)等; AO-1在好氧和缺氧條件下均能氧化Sb(III),好氧氧化Sb(III)的米門常數(shù)m和最大氧化速率max值分別為393.05mmol/L和0.271mmol/(L·min),體現(xiàn)了較強的銻氧化性;AO-1和鐵錳氧化物的耦合作用能促進Sb(III)的氧化,且鐵錳氧化物促進AO-1氧化Sb(III)的速率依次為:FeCl3> MnO2>單質(zhì)鐵; AO-1和鐵錳氧化物耦合氧化Sb(III)生成含Sb(Ⅴ)的次生礦物,次生礦物會加速Sb(III)的氧化以及影響銻在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化.菌株AO-1的銻氧化性能良好,對于銻的生物化學轉(zhuǎn)化和土壤微生物修復的應用有重要意義.

銻氧化菌；sp. AO-1；Sb(III)；氧化；鐵錳氧化物

銻(Sb)是具有高毒性和潛在致癌性的危險物質(zhì),可通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進入人體對肺、肝臟、皮膚甚至心血管系統(tǒng)造成損害[1],因此Sb被許多國家或組織列入優(yōu)先控制和全球性污染物目錄[2].銻及其化合物的毒性取決于其化學形態(tài)和氧化態(tài),元素銻比鹽類銻毒性大,無機態(tài)銻比有機態(tài)銻毒性大[3-4].銻最常見的形態(tài)是三價(Sb(Ⅲ))和五價(Sb(V)),Sb(Ⅲ)的毒性是Sb(V)的10倍[5], 但Sb(V)在環(huán)境中的穩(wěn)定性和遷移速度遠遠大于Sb(III),且Sb(V)能夠長距離遷移.我國銻礦生產(chǎn)量占全世界的80%以上,這也帶來了嚴重的銻污染[6].在微生物和降雨的耦合作用下[7-8],大量銻礦廢石(Sb2S3、FeSb2S4、Sb2S2O)向環(huán)境中釋放Sb(V)[9-10],導致銻礦區(qū)及周圍的土壤和水體中銻含量嚴重超標,銻污染事件頻發(fā).可見,微生物介導作用是使含銻固廢Sb(Ⅲ)溶解氧化成Sb(V)并向水土環(huán)境擴散的關鍵步驟之一[11-12].

銻氧化菌能夠通過溶解氧化、礦化、生物累積等代謝機制參與到銻的生物地球化學循環(huán)過程中[13],并影響銻在環(huán)境中的化學組分、遷移轉(zhuǎn)化、生物可利用性及最終歸趨[5,14].自從Lialikova[15]首次報道第一株銻氧化細菌以來,約有100余株銻氧化菌已被篩選得到[16],其中31.96%屬于屬,且該屬在湖南錫礦山、貴州大龍、日本市之川等銻礦區(qū)均有發(fā)現(xiàn).因此,研究者推測屬銻氧化菌在含銻固廢Sb(Ⅲ)溶解氧化生成Sb(V)過程中扮演重要的角色[16],但是有關該屬銻氧化菌氧化Sb(III)的性能和過程機理尚不清楚,有待深入研究.與此同時,具有催化和吸附功能的鐵錳氧化物是土壤中常見的礦物[17-18],對Sb(Ⅲ)的氧化和遷移轉(zhuǎn)化具有重要影響[19],其往往與銻氧化菌共存于銻污染土壤中,但是有關兩者耦合作用下氧化Sb(Ⅲ)的行為研究鮮見報道[20-22].

基于此,為了闡明典型銻氧化菌和鐵錳氧化物耦合作用下Sb(III)的環(huán)境行為和過程機理,本文從湖南省錫礦山銻礦區(qū)土壤樣品中篩選出一株高耐銻的菌株,并利用分子生物學技術對其進行鑒定;系統(tǒng)考察其生長特性、銻耐受性、氧化Sb(Ⅲ)的動力學特征及影響因素;探討鐵錳氧化物介導銻氧化菌氧化Sb(Ⅲ)生成的次生礦物對銻遷移轉(zhuǎn)化的影響,以期為解析銻的生物地球化學循環(huán)行為、銻污染防治和低品位銻礦資源化利用奠定理論依據(jù)[23].

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的來源

實驗菌株篩選于湖南省冷水江市錫礦山銻礦區(qū)5～20cm的表層土壤.該土壤物理化學參數(shù)和重金屬含量如下: pH 7.25、總氮(TN) 40.3mg/kg、總碳(TC) 32960mg/kg、總鐵31.7mg/kg、氯離子85.2mg/kg、硫酸根139.96mg/kg、總銻1269.50mg/kg、總砷23.36mg/kg、總鉛44.64mg/kg和總鎘5.35mg/kg.

1.2 銻氧化菌的篩選分離方法

首先,在三角瓶中加入10g過篩后的土壤樣品及100mL無菌水,用磁力攪拌器攪拌30min;靜置30min后, 取1mL上清液加入到100mLCDM液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)時間2～3d,培養(yǎng)條件為有光、30℃、150r/min.其次,取稀釋102～105倍系列培養(yǎng)液0.05mL,均勻涂布在500mg/L的Sb(Ⅲ) CDM固體培養(yǎng)基上, 30℃下恒溫培養(yǎng),觀察菌落的形態(tài)和生長情況.最后,用含Sb(Ⅲ)濃度3000mg/L的CDM固體培養(yǎng)基對初篩選菌落再次劃線培養(yǎng), 獲得單菌落菌株.

CDM固體培養(yǎng)基配方:MgSO4·7H2O, 2.0g; NH4Cl, 1.0g; Na2SO4, 1.0g; K2HPO4, 0.013g; CaCl2·2H2O, 0.067g;酵母膏粉, 5.0g;瓊脂, 15.0g;蒸餾水, 1L; pH 7.2, CDM液體培養(yǎng)基則不加瓊脂.

1.3 銻氧化菌對Sb(III)的耐受性和氧化性測定方法

Sb(III)的耐受性:根據(jù)文獻提供的方法測定純種菌株對Sb(III)的耐受性[24]. Sb(III)的氧化性:取1mL菌液接種于Sb(Ⅲ)濃度為1mmol/L的CDM液體培養(yǎng)基中;取不同培養(yǎng)時間的上清液測定Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)的濃度[25],并計算Sb(Ⅲ)的氧化速率.選取Sb(III)耐受性和氧化性較好的目標菌株作為本文的研究對象.

1.4 銻氧化菌的分子生物學鑒定方法

首先,采用細菌基因抽提試劑盒提取菌株的DNA,并置于-20℃保存?zhèn)溆?具體操作步驟按照試劑盒說明書進行.其次,細菌16S rRNA序列PCR擴增以得到的細菌基因組DNA為模板,采用正向引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和反向引物M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)進行PCR擴增[26].PCR擴增體系為(50μL):基因組DNA 2μL, NS1/NS8引物(10mmol/L)各1.5μL,2×Hieff PCR Master Mix 25μL, ddH2O (10μL). PCR反應條件: 95℃下預變性5min; 94℃下循環(huán)變性1min, 52℃下退火復性1min, 72℃下延伸1min,共進行30個循環(huán);最后在72℃下再延伸10min.取擴增成功的PCR產(chǎn)物送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)測序.最后,將序列結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫,進行BLAST比對分析,利用MEGA7.0軟件和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 銻氧化菌的生長特性實驗方法

將活化的純種銻氧化菌接種至不同Sb(Ⅲ)濃度(0,5,10,50,100,200和300mg/L)的CDM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),并取樣測定其在600nm波長處的吸光值(OD600).培養(yǎng)條件:接種量為1%(體積比)、溫度為30℃和搖床速率為150r/min.取樣時間:0～48h每隔8h取一次樣, 48～144h每隔24h取一次樣.根據(jù)OD600值繪制銻氧化菌在Sb(Ⅲ)脅迫下的生長曲線.

1.6 氧化動力學參數(shù)測定方法

以氧為電子受體,測定目標菌株氧化Sb(III)的動力學參數(shù).該實驗菌株培養(yǎng)條件與測定生長曲線時的實驗條件相同,培養(yǎng)液中Sb(III)的初始濃度控制在0～2500mmol/L之間,實驗過程詳見文獻[27]. Sb(III)的氧化動力學參數(shù)根據(jù)米門方程(式1)計算確定[27].

式中:為實驗菌株對Sb(III)的氧化反應速率,mmol/(L·min); []為Sb(III)初始濃度,mmol/L;max為實驗菌株對Sb(III)的最大氧化速率,mmol/(L·min);m為米門常數(shù).

1.7 銻氧化菌氧化Sb(Ⅲ)的影響因素實驗方法

好氧/缺氧影響實驗:在pH值為7時,將Sb(Ⅲ)濃度為50mg/L的CDM液體培養(yǎng)基分為3組,并在121℃下高溫滅菌30min,冷卻至室溫.其中第一組為敞開體系(有氧)且不加菌液(對照組),第二組為敞開體系(有氧)且接種1mL的實驗菌液,第三組為密閉體系(無氧、50mg/L硝酸鹽)且接種1mL的實驗菌液;然后在溫度為30℃和搖床速率為150r/min的條件下培養(yǎng),每間隔12h取上清液測定OD600值、Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)的濃度.

pH值影響實驗:考察pH值為2～7時對AO-1生長及其氧化Sb(Ⅲ)的影響,每組均設無菌空白對照組,其他實驗操作同好氧/缺氧影響實驗.

應急物流管理系統(tǒng)的本體庫包括兩種領域本體（即“管理”和“應急物流”），任務方法本體以及由此產(chǎn)生的應急物流管理本體，如圖5所示。以上各圖中，實線表示等級關系（即“part of”），虛線表示組合關系（即“uses”），箭頭表示對任務/方法本體的引用。另外，圖中只顯示了類及其之間的關系，然而在實際的應用本體創(chuàng)建時會涉及本體的全部元素，包括類、屬性、約束條件/關系等。

鐵錳氧化物影響實驗:在pH值為7時,考察單質(zhì)鐵、FeCl3、MnO2(濃度均為50mg/L)對AO-1生長及其氧化Sb(Ⅲ)的影響,每組均設無菌空白對照組,其他實驗操作同好氧/缺氧影響實驗.

1.8 分析方法與表征

稱取適量的酒石酸銻鉀(C8H4K2O12Sb2)溶于去離子水中,制備出1.0g/L的Sb(Ⅲ)標準儲備液.取適量儲備液稀釋得到所需濃度的Sb(Ⅲ)溶液.采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜儀(HG-AFS, AF-9600,中國北京科創(chuàng)海光儀器有限公司)對Sb(Ⅲ)和Sb(V)的濃度進行測定,該方法的最低檢測限為1μg/L,銻的回收率達90%以上,誤差率小于1%.所有樣品均在實驗結(jié)束后24h內(nèi)完成測試,試劑均為優(yōu)級純,實驗用水均為去離子水.

實驗結(jié)束后,將有菌組pH值為7未添加鐵錳氧化物和添加了單質(zhì)鐵、FeCl3、MnO2的4組溶液在4℃、10000r/min條件下離心5min后,得到菌體及其代謝產(chǎn)物組成的混合物質(zhì),于60℃烘干并研磨備用.采用掃描電子顯微鏡(SEM,JEOL 7800F,日本電子JEOL公司)對氧化Sb(Ⅲ)的氧化產(chǎn)物形貌特征和結(jié)構(gòu)進行表征;采用X射線衍射儀(XRD, D8ADVANCE Da Vinci,德國Bruker公司)對氧化Sb(Ⅲ)的二次礦物晶體結(jié)構(gòu)進行分析,掃描范圍為5°～90°,掃描速度為6°/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 銻氧化菌的分離與鑒定

目標菌株的菌落形態(tài)呈透明狀,隆起,表面光滑,菌苔粘稠,直徑6～10mm;細胞形態(tài)呈長桿狀、單個分散,直徑為3～5μm,屬于兼性好氧/厭氧菌,為革蘭氏陰性菌.基于16S rRNA的同源性比較和BLAST對比,構(gòu)建目標菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),結(jié)果顯示與其最為接近的菌種是Ps 9-14,二者相似匹配度為99.86%.

依據(jù)《微生物分類學》和《細菌的特征與鑒定手冊》,結(jié)合目標菌株的形態(tài)以及生理生化特征,將其鑒定為假單胞菌(),命名為spAO-1(簡稱AO-1,GenBank number為MN720563). BLAST對比結(jié)果顯示未見與AO-1相似匹配度高于99.90%的菌株,暗示AO-1是假單胞菌屬中一種新報道的銻氧化菌株.目前已報道的銻氧化菌有100余株[16],其中屬占比例最高,達到了32.0%左右,且在湖南錫礦山、貴州大龍、日本市之川等銻礦區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[28-29],可見屬是銻氧化菌中數(shù)量最多、區(qū)域分布廣泛、最具有代表性的一個屬,在銻的生物地球化學循環(huán)中扮演重要的角色[28].因此,以spAO-1為典型銻氧化菌研究其氧化特性可為闡明微生物介導氧化Sb(Ⅲ)提供理論依據(jù).

2.2 Sb(Ⅲ)脅迫下AO-1的生長特征及耐受性

由圖2可知,當Sb(Ⅲ)脅迫濃度￡50mg/L時, AO-1的生長幾乎不受到抑制,且進入對數(shù)生長期的時間<5h;當Sb(Ⅲ)脅迫濃度在100～200mg/L時, AO-1的生長受到了明顯的抑制,對數(shù)期滯后;當Sb(Ⅲ)脅迫濃度達到300mg/L時,最大OD600值只有1.47,僅為無Sb(Ⅲ)脅迫下的65%,生長和對數(shù)增長期受到顯著的抑制.

圖1 菌株AO-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

該發(fā)育樹以DSM30007 (X81660.1)為外枝構(gòu)建;圖中A代表sp. AO-1

圖2 Sb(Ⅲ)脅迫下AO-1生長曲線

實驗表明AO-1在Sb(Ⅲ)含量為8000mg/L的固體培養(yǎng)基中依然能夠生長.可見,AO-1對Sb(Ⅲ)具有極高的耐受性,其Sb(Ⅲ)耐受性遠高于大多數(shù)銻氧化菌及非土著微生物[16],原因可能與長期生存環(huán)境有關系[30],即長期在高濃度銻脅迫下AO-1為了自身生存逐漸進化出抵抗Sb(Ⅲ)的性能和代謝機制[13,16],包括銻的轉(zhuǎn)運、氧化還原、甲基化和螯合解毒等機制,但有待進一步研究確定.

2.3 AO-1氧化Sb(III)的動力學特征

Sb(III)氧化速率是評價銻氧化菌氧化性能的重要指標,也反映其在銻生物地球化學循環(huán)中的作用[31-33].由圖3可知, AO-1氧化Sb(Ⅲ)的米門常數(shù)m和最大氧化速率max分別為393.05mmol/L和0.271mmol/(L·min), 其m值高于sp. SPB-24[34](41mmol/L)、sp. NLS4[20](385.83mmol/L),但低于sp. NLS1[20](479.28mmol/L)、sp. JHS3[21](1280.71mmol/L)、sp. JHW3[20](4210.26mmol/L). 可見,AO-1的m值低于大多數(shù)已報道的銻氧化菌,暗示對Sb(III)具有較大的親和力.AO-1的max值比sp. NLS1[20](0.34mmol/(L·min))、sp. NLS4[20](0.37mmol/(L·min))、sp. JHS3[21](1.07mmol/(L·min))、sp. JHW3[20](1.83mmol/(L·min))、sp. SPB-24[34](19.43mmol/(L·min))的max值低;但鑒于max測定條件和方法有差異,不同銻氧化菌的max直接比較意義不大,故研究者更關注的是銻氧化菌平均氧化速率avg.本文測定AO-1的avg為36.5mmol/(L·d),高于大多數(shù)銻氧化菌的實測值(0.10～300mmol/ (L·d))[16].對比不同銻氧化菌氧化Sb(III)的m、max和avg值表明: AO-1對Sb(III)具有良好的氧化性能,結(jié)合其在環(huán)境中的分布數(shù)量, 可推測屬銻氧化菌在銻的生物地球化學循環(huán)過程中扮演重要角色.

2.4 AO-1介導氧化Sb(III)的影響因素

由圖4(a)可知, AO-1在好氧、缺氧條件下最大OD600值分別為2.19和0.87,且缺氧條件下對數(shù)生長期后移,這表明好氧環(huán)境比缺氧環(huán)境更有利于AO-1的生長.非生物控制條件下, Sb(V)濃度未見上升;缺氧條件下, AO-1在6d內(nèi)能將6.61mg/L Sb(III)氧化成Sb(V),缺氧平均氧化速率為9.05mmol/(L·d);而在好氧條件下, AO-1能將26.64mg/L Sb(III)氧化成Sb(V),好氧平均氧化速率為36.50mmol/(L·d),是缺氧平均氧化速率的4.0倍,這與其他研究者發(fā)現(xiàn)一致[20,35].Loni等[35]發(fā)現(xiàn)XT0.6好氧氧化Sb(III)的速率高達300mmol/(L·d),是缺氧條件下的6.0倍;Nguyen等[20]發(fā)現(xiàn)sp. strain NLS4好氧氧化速率(460.8mmol/(L·d))更是缺氧的6.9倍.此外,大部分銻氧化菌只能在好氧條件下氧化Sb(Ⅲ)[16,29],而strain IDSBO-1只能在硝酸鹽存在時氧化Sb(III) (55.56mmol/(L·d)).可見,好氧、缺氧會影響細菌氧化Sb(Ⅲ)的性能,且大部分銻氧化菌好氧氧化速率遠高于缺氧,原因可能與銻氧化菌有不同的銻代謝途徑和氧化機制有關,好氧條件下, AO-1以氧氣為電子受體將Sb(Ⅲ)氧化成Sb(V);缺氧條件下, AO-1以硝酸鹽為電子受體發(fā)生反硝化反應,速度較緩慢,往往發(fā)生于氧氣稀少的地下環(huán)境中[20].值得關注的是:好氧、缺氧條件下AO-1均能氧化Sb(Ⅲ),這對銻污染防控、微生物修復技術的研發(fā)具有重要意義.

圖5 溶液pH對AO-1生長及其氧化Sb(III)的影響

2.4.2 溶液pH值對氧化Sb(III)的影響 溶液pH值是影響微生物氧化Sb(III)的關鍵因素[35-36].圖5給出了pH=2～7時AO-1氧化Sb(III)的情況,并與無菌時進行了比較. pH=2時, AO-1未見生長; pH值從3升高到5時,最大OD600值從0.51增加到2.11; pH值繼續(xù)升高到6和7時,最大OD600未見增加,這表明pH<5時會抑制AO-1的生長, pH值為5～7時不會對AO-1的生長產(chǎn)生影響.

圖6 溶液pH值與6d內(nèi)Sb(III)氧化率的關系

無菌時, Sb(III)氧化主要屬于化學氧化.由圖5可知,當pH=2～7時,無菌組培養(yǎng)6d后Sb(III)氧化率分別為13.18%、9.08%、12.62%、17.47%、22.41%和28.27%, Sb(III)氧化率隨pH值升高而升高,即pH值升高會促進化學氧化Sb(III),這與其他研究者的結(jié)論一致[37];但是Xi等[38]發(fā)現(xiàn)pH<7.0時,水中的Sb(III) 35d內(nèi)未被氧化,究其原因可能是本實驗過程一直存在光照,誘發(fā)了光催化氧化Sb(III)的反應[39-40].而有菌組培養(yǎng)6d后Sb(III)氧化率分別為11.42%、17.14%、36.13%、51.51%、66.14%和84.32%,可見AO-1氧化Sb(III)的效率隨pH值升高而提高.當pH=3～7時,有菌組Sb(III)氧化率分別比無菌組提高8.06%、23.51%、34.04%、43.73%和56.05%.與此同時,無菌組氧化率、有菌組氧化率及有菌組比無菌組提高量均與pH值呈線性關系(圖6),且有菌組的斜率(15.197)大于無菌組(3.97),這表明在pH值為2～7時, pH值升高對于氧化Sb(III)的促進作用有菌組大于無菌組.以上結(jié)果表明pH值升高會通過化學與生物作用共同促進氧化,分析原因:首先,弱酸性和中性不會影響AO-1的生長和繁殖,為AO-1氧化Sb(III)提供了良好的基礎,這與本文前期研究[41]和Loni[35]的發(fā)現(xiàn)一致;其二,銻氧化菌氧化Sb(III)的酶促和非酶促(H2O2催化反應)反應均受pH值的影響,且在中性條件下反應速率最快[16,31,42-43];第三,銻氧化菌新陳代謝會生成堿性礦物提高微環(huán)境的pH值[35],進而促進Sb(III)氧化,如AO-1會生成NH4Mg (PO4)·6H2O礦物(圖9).綜上, AO-1氧化Sb(Ⅲ)是生物、化學聯(lián)合作用過程,此過程中pH值是影響氧化速率和氧化程度的主導因素,銻氧化速率會隨著pH值的增大而增大.

2.4.3 鐵錳氧化物對氧化Sb(III)的影響 鐵錳氧化物是土壤中常見的礦物[17-18],對銻的生物地球化學循環(huán)過程影響重大.圖7給出了單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2分別對AO-1生長及其氧化Sb(III)的影響.由圖7可知,不同條件下AO-1生長具有類似的規(guī)律且其最大OD600均在2.0左右,暗示了單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2不會影響AO-1的生長.

無菌條件下,單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2均能在120h內(nèi)將0.4mmol/L的Sb(Ⅲ)氧化90.00%以上,遠高于無菌且無鐵錳氧化物時(26.95%,圖5(f)),可見鐵錳氧化物能促進Sb(Ⅲ)的氧化,這與他人研究結(jié)論一致[19,44].Nelson等[19]認為鐵錳氧化物氧化Sb(Ⅲ)包括四個過程:①Sb(OH)3首先被吸附于Fe(OH)3或MnO2等表面; ②Sb(III)轉(zhuǎn)移兩個電子到Fe(OH)3或MnO2上;③將氧化生成的Sb(V)釋放至溶液中; ④Fe(OH)3或MnO2得到電子生成Fe2+或Mn2+釋放至溶液中,加速電子轉(zhuǎn)移[45].江南等[46]認為鐵錳氧化物促進Sb(III)氧化的原因包括:其一,通過促進溶解氧氧化Sb(III)而提升氧化效果;其二,反應過程中存在Fe2+/Fe3+或Mn2+/Mn3+循環(huán)并產(chǎn)生了強氧化性的羥基自由基(?OH),可促進Sb(III)的氧化.AO-1與單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2耦合氧化Sb(Ⅲ)的速率均比對應的單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2單獨氧化Sb(Ⅲ)要快(圖7),可見鐵錳氧化物與AO-1耦合作用能進一步促進Sb(Ⅲ)氧化,究其原因:一是AO-1可直接生物氧化Sb(III);二是AO-1會代謝生成堿性的NH4Mg (PO4)·6H2O次生礦物,提高微環(huán)境的pH值促進Sb(III)氧化[35];三是AO-1代謝生成NaSb(OH)6、CaSb2O5(OH)2和MgSb2O6等難溶性的Sb(V)次生礦物(圖9),促進Sb(III)氧化反應的進行.同時,與無菌組相比,AO-1與單質(zhì)鐵、FeCl3和MnO2耦合氧化90%的Sb(Ⅲ)(0.4mmol/L)所需時間分別縮短至96,72和84h(圖7),可見3種鐵錳氧化物促進AO-1氧化的速率依次為:FeCl3>MnO2>單質(zhì)鐵,原因主要與3種鐵錳氧化物具有不同價態(tài)的鐵錳循環(huán)及生成不同的二次礦物有關.綜上所述,屬銻氧化菌和鐵錳氧化物廣泛共存于銻污染土壤中,兩者耦合作用加速Sb(III)的氧化,進而影響水土環(huán)境中銻的賦存形態(tài)、遷移轉(zhuǎn)化與最終歸趨.

2.5 AO-1氧化Sb(III)的次生礦物特征及對土壤中銻遷移轉(zhuǎn)化的影響

圖8給出了AO-1、AO-1+Fe、AO-1+ FeCl3、AO-1+ MnO2分別氧化Sb(III)后沉淀物的SEM圖像.由圖8(a)可知,AO-1單獨氧化Sb(III)后沉淀產(chǎn)物表面光滑,內(nèi)有凸起的不規(guī)則顆粒狀晶體,推測為Sb(III)氧化后生成了銻酸鹽類結(jié)晶體[47];圖8(b)顯示AO-1+Fe耦合氧化Sb(III)后沉淀物表面粗糙,具有較多的孔洞,原因有待進一步研究,圖8(c～d)顯示AO-1+FeCl3和AO-1+MnO2氧化Sb(III)后沉淀物表面粗糙,成層次鱗狀結(jié)構(gòu),這與沉淀物中含有FeOOH和MnOOH等產(chǎn)物有關.

微生物氧化過程中形成的次生礦物種類對Sb(III)的氧化速率和銻遷移轉(zhuǎn)化有重要的影響[13].由圖9可知,無論AO-1單獨氧化還是與鐵錳氧化物耦合氧化,均生成了NH4Mg(PO4)·6H2O、NaSb (OH)6、CaSb2O5(OH)2和MgSb2O6等次生礦物,其中NH4Mg(PO4)·6H2O屬于堿性礦物,能夠提高微環(huán)境的pH值[35],這也是AO-1能促進氧化Sb(III)的主要原因之一.AO-1+單質(zhì)鐵耦合氧化Sb(III)還生成了FeSb2O4次生礦物(圖9(b)),暗示該反應過程存在Fe0+/Fe2+循環(huán);相關研究表明均相溶液中Fe(II)能夠催化溶解氧氧化Sb(III)[46],使得AO-1+單質(zhì)鐵耦合氧化Sb(III)的速率比AO-1單獨氧化要快.如圖9(c)所示,AO-1+FeCl3耦合氧化Sb(III)還生成了FeOOH和FeSb2O4等次生礦物,暗示反應過程中存在Fe2+/Fe3+循環(huán); Fe2+/Fe3+循環(huán)會加速電子轉(zhuǎn)移和?OH的生成[45],從而促進Sb(III)氧化;且FeOOH對Sb(III)具有良好的吸附再氧化作用[19],因此AO-1+FeCl3氧化Sb(III)的速率比AO-1+單質(zhì)鐵氧化要快.AO-1+ MnO2氧化Sb(III)過程中生成了MnSb2O6和MnOOH等二次礦物(圖9(d)),表明該反應過程中存在Mn2+/Mn3+循環(huán),該循環(huán)可促進電子轉(zhuǎn)移[19],但錳氧化物不能催化溶解氧氧化Sb(III)[46],導致AO-1+ MnO2氧化Sb(III)的速率慢于AO-1+FeCl3, 但比AO-1+單質(zhì)鐵要快.綜上,3種鐵錳氧化物促進AO-1氧化Sb(III)的速率依次為: FeCl3> MnO2>單質(zhì)鐵. AO-1+鐵錳氧化物耦合氧化Sb(III)過程中存在Fe2+/Fe3+或Mn2+/Mn3+循環(huán)、生成了NH4Mg (PO4)·6H2O及多種含Sb(V)的次生礦物均會促進Sb(III)氧化,進而影響銻在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化.值得關注的是NaSb(OH)6、CaSb2O5(OH)2和FeSb2O4等次生礦物均是屬于微溶物,其溶解度分別為0.4[35]、0.038[47-48]和<10-5[14]g/100g H2O,在降雨淋溶等作用下這些次生礦物會緩慢釋放出Sb(V)離子,造成持續(xù)的、低濃度的二次銻污染,尤其在鐵錳氧化物豐富的銻污染土壤中更要引起重視.

3 結(jié)論

3.1 從湖南省錫礦山銻礦區(qū)土壤中篩選得到一株耐銻濃度高達8000mg/L的銻氧化菌,結(jié)合其形態(tài)和生理生化特征,將其鑒定為假單胞菌(sp.),命名為spAO-1;通過16S rRNA的同源性比較和BLAST對比分析,顯示與AO-1最為接近的種是Ps 9-14,二者相似匹配度高達99.86%;未見與AO-1相似匹配度高于99.90%的菌株,因此spAO-1屬于假單胞菌屬中一種新發(fā)現(xiàn)的銻氧化菌株.AO-1氧化Sb(III)的動力學顯示,好氧氧化Sb(III)的m和max值分別為393.05mmol/L和0.271mmol/(L·min),體現(xiàn)了較強的銻氧化性;結(jié)合屬銻氧化菌在環(huán)境中的分布情況,推測其在銻的生物地球化學循環(huán)中扮演著重要的角色.

3.2 影響AO-1氧化Sb(III)的因素主要有溶解氧、pH值和鐵錳氧化物.在好氧和缺氧條件下, AO-1均能氧化Sb(III),且好氧氧化速率大于缺氧; AO-1氧化Sb(Ⅲ)是生物、化學聯(lián)合作用過程,在中性和弱酸性條件下,銻氧化速率會隨著pH值的增大而增大; AO-1和鐵錳氧化物耦合作用會促進Sb(III)氧化,且鐵錳氧化物促進AO-1氧化Sb(III)的速率依次為: FeCl3>MnO2>單質(zhì)鐵; 但兩者耦合氧化機制有待進一步研究.AO-1和鐵錳氧化物耦合氧化Sb(III)會生成NaSb(OH)6、CaSb2O5(OH)2、MgSb2O6、FeSb2O4等次生礦物,加速Sb(III)的氧化和影響銻在環(huán)境中遷移轉(zhuǎn)化.這些次生礦物在降雨淋溶等作用下易造成持續(xù)的、低濃度的二次銻污染,應該引起注意.

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Isolation and identification of antimony-oxidizing bacteriumspAO-1 and its oxidation properties for Sb(III).

LONG Pei1, DENG Ren-jian1*, YANG Yu1, JIN Gui-zhong2, HUANG Zhong-jie1, ZHOU Xin-he3, WANG Xi-feng1, WANG Chuang1

(1.School of Civil Engineering, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan411201, China；2.Xikuangshan Shanxing Antimony Industry Co., Ltd, Loudi 417500, China；3.Environmental company of China National Administration of Coal Geology, Handan 056001, China)., 2023,43(2)：904～914

An antimony-oxidizing bacterium was screened from Xikuangshan by the resistance screening method and identified by molecular biology techniques. And its oxidation properties for Sb(III) and the characteristics of oxidized secondary minerals were investigated. The results showed that the antimony-oxidizing bacterium belonged to the genussp., which was namedsp. AO-1 (AO-1). The main factors affecting the oxidation of Sb(III) by AO-1 were solution pH, dissolved oxygen and iron/manganese oxide (elemental iron, FeCl3and MnO2). In addition, AO-1 could oxidize Sb(III) under both aerobic and anoxic conditions, and the Michaelis-Menten constant and maximum oxidation rate of aerobic oxidation of Sb(III) were 393.05mmol/L and 0.271mmol/(L·min), respectively, presenting strong oxidizing ability to antimony. The combination of AO-1 and iron/manganese oxides could promote Sb(III) oxidation, and the rate of iron/manganese oxides promoting the oxidation of Sb(III) by AO-1 was in the following order: FeCl3> MnO2> elemental iron. Furthermore, the coupled oxidation of Sb(III) by AO-1 and iron/manganese oxides generated secondary minerals containing Sb(V), which accelerated Sb(III) oxidation and affected the migration and transformation of antimony in the environment. AO-1indeed exhibits satisfactory antimony oxidation performance, which is of great significance for the biogeochemical transformation of antimony and the application of soil microbial remediation.

antimony-oxidizing bacteria；sp. AO-1；Sb(III)；oxidation；iron/manganese oxide

X53

A

1000-6923(2023)02-0904-11

隆 佩(1998-),女,湖南長沙人,湖南科技大學碩士研究生,主要從事重金屬廢水處理技術研究.

2022-06-27

湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX20210994);湖南省自然科學基金資助項目(2022JJ30248,2021JJ30243);湖南省教育廳科學研究項目(19B193);國家自然科學基金資助項目(41672350)

* 責任作者, 教授, deng800912@163.com