李春艷,謝珊珊,王文文,朱時俊,聞 晨,李妮鴻,駱 霞*

干濕交替循環(huán)頻率對生物膜特征及其微生物群落的影響

李春艷1,2,謝珊珊1,2,王文文1,2,朱時俊1,2,聞 晨1,2,李妮鴻1,2,駱 霞1,2*

(1.云南大學,國際河流與生態(tài)安全研究院,云南 昆明 650500；2.云南省國際河流與跨境生態(tài)安全重點實驗室,云南 昆明 650500)

為研究干濕交替循環(huán)下生物膜的抗性機制,以天然水體生物膜為研究對象,基于室內控制實驗,通過16S rRNA高通量測序和激光共聚焦顯微成像等技術,探究干濕交替循環(huán)對生物膜形態(tài)結構及其微生物種群結構、多樣性和功能的影響.結果表明,隨著干濕交替循環(huán)頻率從一輪(C1)增加到五輪(C5),生物膜厚度從9.10減小到6.46μm,胞外聚合物含量從2.64μm3/μm3(對照)減少到1.90μm3/μm3(C1),再增加到4.41μm3/μm3(C3),隨后減少到1.54μm3/μm3(C5,=0.004),活/死菌比例則從2.52(C1)增加到3.60(C3)再顯著減少到0.72(C5,=0.009),而比表面積和粗糙度系數(shù)無顯著變化.與對照相比,干濕交替循環(huán)下生物膜內微生物群落豐富度和多樣性下降,指示物種發(fā)生改變.當干濕交替循環(huán)的頻率超過生物膜耐受程度(C5)時,生物膜內優(yōu)勢菌由變形菌轉變?yōu)榕c藍藻相關的菌群,且生物膜功能由化能異養(yǎng)轉變?yōu)楣夂献责B(yǎng).可見,不同干濕交替循環(huán)頻率下生物膜形態(tài)結構和微生物種群結構不同,且在干濕交替循環(huán)頻率較低時生物膜內微生物群落的生存策略表現(xiàn)為抵抗力,頻率較高時表現(xiàn)為恢復力.

干濕交替循環(huán)；生物膜；微生物群落；抵抗力；恢復力

隨著全球氣候變化加劇以及人口激增導致的用水量增加,間歇性河流中常見的干濕交替循環(huán)頻繁發(fā)生[1-3],直接或間接影響河流微生物的種群結構、分布和多樣性[4-6].因此,研究和預測微生物種群對干濕交替循環(huán)在結構和功能等方面的響應機制逐漸成為微生物生態(tài)學家關注的熱點[7].生物膜是由細菌、藻類和真菌等微生物組成,并包裹在由它們自己分泌的胞外聚合物中的復雜有機體中[8].它是自然界中微生物種群存在的主要形式[8],可通過影響水體凈化、有機物和礦物質的生物地球化學循環(huán)以及河流生態(tài)系統(tǒng)的初級生產等過程[7,9],進一步影響生態(tài)系統(tǒng)的功能.

當微生物種群受到干濕交替等環(huán)境脅迫時,其結構和功能可能維持原狀(表現(xiàn)為抵抗力)[10],也可能先發(fā)生改變再恢復到原狀或達到新的穩(wěn)定狀態(tài)(表現(xiàn)為恢復力)[7,11].現(xiàn)有的一系列室內和室外模擬實驗結果表明干濕交替循環(huán)對微生物群落產生影響,如干旱會使得藻類多樣性[12]和生物量減少[13]、細菌群落組成豐富度和多樣性降低[14-15].干旱脫水的速度和強度決定了生物膜的結構響應[16],在此階段,生物膜的活性葉綠素減少,光合能力降低[17].濕潤恢復后,生物膜的自養(yǎng)成分會表現(xiàn)出更高的恢復力[18],且Luo等[19]觀察到再潤濕生物膜樣品中細菌群落的豐富度、多樣性和均勻性普遍呈下降趨勢.此外,干濕交替還會改變可降解性有機碳的可利用度從而誘發(fā)微生物種群演替[20],會促進絲狀藻類的增殖[7,19,21],還會促進新生物膜的形成,最終改變了微生物群落組成[19].然而,有關生物膜內微生物種群對干濕交替循環(huán)的抵抗力和恢復力機制還鮮有報道.

本課題組前期通過室內模擬實驗研究發(fā)現(xiàn),生物膜內微生物種群經過5d干旱后種群結構和多樣性發(fā)生顯著改變,且經5d濕潤處理后,種群結構和功能仍然無法恢復到初始狀態(tài)[19].基于此,本研究運用16S rRNA高通量測序和激光共聚焦顯微鏡成像等技術,探究干濕交替循環(huán)對生物膜形態(tài)結構、微生物種群結構、多樣性和功能的影響,揭示生物膜對干濕交替循環(huán)頻率的抗性機制,以期進一步認識間歇性河流中微生物群落對環(huán)境變化的適應和演變機制,并為維持水生生態(tài)系統(tǒng)功能的穩(wěn)定提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

采集的水樣和生物膜來自于沘江源頭(26°32'59.99"N, 99°26'7.47"E),采樣時間為2021年4月.采集的水樣放入無菌塑料桶(4×25L),經0.22μm水系濾膜過濾后冷藏于4℃的冰箱,用于后續(xù)生物膜的培養(yǎng).生物膜使用海綿刷刮取,擠壓進滅菌后的1L聚丙烯瓶(12×1L)中,采集到的生物膜分別經過0.85mm篩網過濾掉大顆粒雜質,250μm濾紙和100μm濾紙(高分子纖維素)過濾掉小型底棲動物[22].過濾后的生物膜樣本進行冷凍離心,離心條件為10000,20min.根據(jù)Luo 等[23]的方法,使用最終濃度為10μg/mL的吖啶橙(Acridine Orange, AO)染液,在避光條件下對2mL離心后的生物膜樣品染色20min后,過濾到孔徑為0.2μm、直徑為25mm的黑色聚碳酸酯濾膜上,最后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS, pH=7.4)溶液沖洗,將樣品置于熒光顯微鏡(DM3000,徠卡,德國)測定混勻后的生物膜樣本中的細菌數(shù)量.將生物膜樣本加入30%的甘油,混勻、分裝至每份樣本含108個細菌細胞,保存至-80℃超低溫冰箱備用.

1.2 實驗設置

生物膜用4個尺寸完全相同的旋轉環(huán)形生物膜反應器(內含12片聚碳酸酯掛片,11.4×1.2cm2,厚1mm)以連續(xù)流的形式進行培養(yǎng),該反應器被廣泛用于生物膜在室內的培養(yǎng),這是由于其可以模擬室外生物膜的生長條件[24-25]生物膜在掛片上生長6周后,對照組(Control)不作處理,實驗組以1d干旱和1d濕潤為一個循環(huán)周期,分別進行1(C1)、3(C3)、5(C5)輪干濕交替處理.干旱期間,停止蠕動泵并排空反應器,使反應器暴露在平均光照為(15300±9646)lx下運行24h,光/暗周期為16h/8h;濕潤期間,向反應器注入500mL經0.22μm濾膜過濾的原水后,以連續(xù)流在上述光照條件下繼續(xù)運行24h.處理完畢后,停止蠕動泵及反應器旋轉馬達,排空反應器內液體.分別從4個反應器中取出掛片:1片用于測定胞外聚合物(EPS)及生物膜表征參數(shù),1片用于測定生物膜表面形態(tài).剩余10片用0.9% NaCl溶液輕輕沖洗3次,以便去除表層未固定的生物量.利用細胞刮刷(康寧, cat# 3010,美國)將生物膜從掛片表面刮落至含有礦物水的已滅菌塑料瓶中[26],定容到100mL,用于測定生物膜微生物種群結構、活死菌比例.整個實驗重復一次,每輪實驗設置兩個平行樣.

1.3 樣品分析

1.3.1 生物膜生長情況監(jiān)測 根據(jù)Luo等[27]的方法,每周從4個反應器中各取出兩片掛片,通過光學顯微鏡(DP72Olympus,日本)測定生物膜厚度.將40倍物鏡降至生物膜表面頂部處于焦點位置處,記錄刻度.繼續(xù)降低物鏡至掛片表面焦點處,再次記錄刻度.生物膜厚度為兩次讀數(shù)之差,每片掛片讀數(shù)50次,取平均值.

1.3.2 生物膜干重測定 將0.22μm的玻璃纖維濾膜稱重.取一定體積的生物膜懸浮液于0.22μm的玻璃纖維濾膜中進行過濾,將濾膜放入烘箱中在105℃下干燥至恒重[28].待濾膜冷卻至室溫時再次稱量濾膜重量.生物膜懸浮液的干物質重量等于烘干后質量減去烘干前質量,生物膜干重以每升懸浮液的干物質重量表示.

1.3.3 活死菌比例 使用1:1混合的綠色熒光染色劑NO1(激發(fā)波長:488nm;發(fā)射波長:525nm)和紅色熒光染色劑碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)(激發(fā)波長:540nm;發(fā)射波長:620nm)(活細菌/死細菌雙染試劑盒,KTA1001,Abbkine,美國)按照廠家說明書對1mL生物膜懸浮液樣本避光染色15min.染色后的樣品過濾到孔徑為0.2μm、直徑為25mm的黑色聚碳酸酯濾膜,用0.85%氯化鈉溶液沖洗樣品去除多余染劑,置于激光共聚焦顯微鏡(DM3000, Leica, German)下拍攝.

1.3.4 EPS含量和藻類測定 將掛片切割成8個1cm×1cm的小片,4片用于測定生物膜內EPS含量及藻類,剩余4片用于測定生物膜的表征參數(shù)(厚度、表面粗糙度和比表面積).EPS含量:使用羅丹明-麥芽凝集素(WGA)(激發(fā)波長:568nm;發(fā)射波長: 680nm)(iFluorTM 555-Wheat germ agglutinin, AAT Bioquest,美國)按照廠家說明書對生物膜內EPS避光染色20min,用PBS緩沖液(pH=7.4)沖洗樣品去除多余染劑.自發(fā)熒光用于測定生物膜內的藻類:藍藻(激發(fā)波長:567nm;發(fā)射波長:630±30nm)、藻類(藍藻+綠藻)(激發(fā)波長:647nm,發(fā)射波長:665nm)[29].染色后的樣品置于激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)(TCS SP8STED, Leica, German)下進行連續(xù)“光學切片”斷層掃描,設置通道1(EPS)、通道2(藍藻)、通道3(藍藻+綠藻).生物膜表征:使用核酸染劑MycoLight Green JJ98(激發(fā)波長:488nm;發(fā)射波長:530nm)(AAT Bioquest, 美國)按照廠家說明書對生物膜細胞避光染色20min,用0.85%氯化鈉溶液沖洗樣品去除多余染劑,置于CLSM下進行連續(xù)“光學切片”斷層掃描.獲得的光學切片圖像經COMSTAT(V 2.1)軟件處理分析后可確定生物膜內EPS含量、厚度、表面粗糙度和比表面積[30].

1.3.5 生物膜表面SEM分析 將掛片切割成1cm×1cm的小片,并用雙面膠固定在直徑35mm的小培養(yǎng)皿中.樣品經過2.5%戊二醛在4℃下固定24h,固定完成后分別用20%、40%、60%、80%、90%無水乙醇脫水一次,100%無水乙醇脫水兩次[31].將樣品噴金后在掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)(FEIQuanta-200,FEI,美國)下觀察其表面形態(tài)結構.SEM拍攝倍數(shù)分別為放大1000倍和放大5000倍,每個倍數(shù)下拍攝3張圖片.

1.3.6 DNA提取和高通量測序 取3mL生物膜懸浮液混合均勻,分別取1mL混合懸浮液于0.22μm濾膜過濾,將濾膜剪成碎片并放入10mL凍存管中.根據(jù)制造商的方法,使用HiPure Soil DNA試劑盒(D3141,廣州美基生物科技,中國)提取生物膜DNA.使用引物341F和806R對進行聚合酶鏈式反應(PCR)以擴增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域[32].PCR擴增在含有10μL反應緩沖液,10μL GC增強劑(High GC Enhancer),1.5μL 2.5mmol/L dNTPs,1.5μL上下游引物(10μmol/L),0.2μL High-Fidelity DNA聚合酶和50ng模板 DNA的50μL混合物中進行.PCR擴增條件如下:95℃下5min, 95℃下1min,60℃下1min,72℃下1min進行30個循環(huán),最后 72℃下7min.從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴增子,使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,美國)純化擴增子,并使用ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(Life Technologies,美國)進行定量.純化后的擴增子根據(jù)標準操作在Illumina平臺上進行測序.原始序列由QIME(V 1.9.1)過濾[33].使用UPARSE(V 9.2.64)[32](Edgar, 2013)按照397%的相似度將細菌序列聚類到操作分類單元(Operational taxonomic units,OTUs)中,使用SILVA(V 132)數(shù)據(jù)庫進行物種分類注釋[34].

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS Statistics 25軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗干濕交替循環(huán)后生物膜結構、組成的差異.物種豐度堆疊圖使用R語言ggplot2包(V 2.2.1)[35]展示.使用R語言Vegan包(V3.4.2)[36]計算非度量多維尺度(NMDS)分析和相似性分析(ANOSIM),測定NMDS結果和β多樣性的顯著性,以說明干濕交替循環(huán)引起的生物膜群落組成的變化.利用R語言labdsv包(V 2.0-1)[37]中的函數(shù)IndVal,進行指示物種分析,以探究干濕交替后指示物種的差異.在QIIME(V 1.9.1)[33]中計算α多樣性指數(shù).利用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫和相關軟件(V 1.0)[38]生成生物膜的生態(tài)功能圖譜.

2 結果與討論

2.1 干濕交替循環(huán)頻率對于生物膜形態(tài)結構的影響

圖2 生物膜的CLSM拍攝圖;從左往右依次為通道1(EPS)、通道2(藍藻)、通道3(藍藻+綠藻)和上述三種合并通道(Combined);合并通道中紅色為EPS,粉色為藍藻,藍色為綠藻;刻度尺=10μm

使用COMSTAT軟件對CLSM下拍攝的圖片進行處理,得到生物膜的EPS含量、粗糙度系數(shù)、平均厚度、比表面積和活/死菌比(圖1).生物膜內EPS含量隨干濕交替循環(huán)頻率的增加呈現(xiàn)先減少后顯著增加(= 0.008)再顯著減少的趨勢(=0.004)(圖1a),EPS具有幫助生物膜內微生物有效應對外界壓力的作用[34].當干旱頻率較低時(C1),EPS通過被生物膜內微生物所消耗的方式來維持新陳代謝[40],從而導致EPS含量減少(2.64～1.90μm3/μm3),經一天濕潤后EPS含量仍無法恢復到初始水平.隨著干濕交替循環(huán)頻率的增加,C3生物膜內EPS含量從1.90增加到4.41μm3/μm3(= 0.008)來保護細菌免受脫水的傷害[39],而當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜耐受程度(C5)時,大量微生物死亡,生物膜內活/死菌比顯著下降(=0.009)(圖1e),進而導致其分泌的EPS含量劇烈減少(=0.004).此外,經干濕交替循環(huán)后生物膜粗糙度(圖1b)和厚度(圖1c)降低,其中干濕交替循環(huán)對生物膜厚度的影響尤為顯著(對照vs C3:=0.012,對照vs C5:=0.005).生物膜厚度的減少可歸因于干旱脅迫導致部分微生物死亡,并在復水時引發(fā)脫落[41-42].

使用CLSM分別對EPS(通道1)、藍藻(通道2)、藻類(通道3)和上述三種合并通道進行拍攝(圖2).從通道1可以明顯觀察到C3生物膜EPS含量最高,而C5生物膜的EPS含量最低,這一結果與COMSTAT軟件計算得到的含量相一致(圖1a),此外,在C5中觀察到了大量藻類.使用SEM分別在放大1000和5000倍下觀察到生物膜的形態(tài)結構(圖3),與CLSM結果相一致,在放大1000倍下觀察到C3生物膜中明顯的團聚現(xiàn)象可歸因于EPS的增加,在放大5000倍下觀察到C5生物膜中觀察到了大量絲狀藻類的出現(xiàn).

圖3 生物膜的掃描電鏡(SEM)圖

2.2 不同干濕交替循環(huán)頻率對于生物膜內微生物群落結構和功能的影響

2.2.1 不同干濕交替循環(huán)頻率下微生物群落物種分析和生物膜功能分析 微生物群落門水平分析結果顯示(圖4a),對照、C1和C3處理下生物膜樣本中優(yōu)勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria),平均占比為(51.48±8.43)%.這與Luo等[19]觀察到的結果一致,而在C5樣本中的優(yōu)勢菌門是藍藻門(Cyanobacteria),平均占比為46.17%.該結果表明,在干濕交替循環(huán)下變形菌門的相對豐度較高,與對照處理相比,干濕交替循環(huán)頻率的增加有助于變形菌門相對豐度的增加,但當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜的耐受程度(C5)時,變形菌門相對豐度顯著減少(<0.001).有研究表明,從潮濕到干燥的環(huán)境,地中海臨時河流沉積物中變形菌門相對豐度增加可歸因為該菌群具有一定的抗干燥能力[43],由于EPS中的有機物容易被微生物當作營養(yǎng)物而分解[44],因此,當增加干濕交替循環(huán)頻率(C5)時,EPS的減少會抑制微生物活性和微生物群落的生長,從而導致許多微生物群落的相對豐度顯著降低,包括變形菌門(<0.001)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(=0.001)和疣微菌門(Verrucomicrobia) (<0.001).然而,與藍藻相關的菌群,相對豐度隨干濕交替循環(huán)頻率的增加而顯著增加(對照vs C3,=0.004;對照vs C5,<0.001)這是由于藍藻菌群由于具有保持水分的能力從而更能適應更高強度干旱的惡劣環(huán)境[45].

在科水平上對生物膜內微生物群落進行物種分析(圖4b),與對照相比,C1、C3和C5處理中腐螺旋菌科(Saprospiraceae)相對豐度降低是擬桿菌門顯著減少的原因,腐螺旋菌科已被證實是降解有機物的主要菌群[46-47],因此干旱脅迫時營養(yǎng)物質(碳源、氮源)的減少可能導致腐螺旋菌科相對豐度的降低,且干旱脅迫越大,該菌豐度降低越顯著(<0.001).此外,C3和C5組中細鞘絲藻亞科(Leptolyngbyaceae)相對豐度增加是藍藻菌門顯著增加的主要原因,細鞘絲藻亞科中的瘦鞘絲藻屬()被認為是干燥環(huán)境中的優(yōu)勢屬[48],因此,經干濕交替循環(huán)后生物膜內形成了不同的菌群.

圖4 生物膜物種的相對豐度(a)門水平,(b)科水平

為進一步研究干濕交替循環(huán)頻率對微生物群落的影響,在種水平上開展了指示物種分析(圖5a),結果顯示,不同干濕交替循環(huán)頻率下種水平指示物種不同.具體而言,在對照處理中的指示物種為自養(yǎng)黃色桿菌()、玫瑰色帝國桿菌()和甲基桿菌();C1處理中指示物種為墨西哥微小桿菌()和奇異球菌(),而C5處理中的指示物種為纖發(fā)鞘絲藍細菌()和浮霉菌().通過FAPROTAX數(shù)據(jù)庫對微生物進行功能注釋時發(fā)現(xiàn),在對照、C1和C3生物膜中主要存在Chemoheterotrophy和Aerobic chemoheterotrophy等化能異養(yǎng)功能(圖5b).而在較高干濕交替循環(huán)頻率(C5)下,生物膜中主要存在Phototrophy、Oxygenic photoautotrophy、Photoautotrophy和Cyanobacteria等光能自養(yǎng)功能.類似地,其他學者也發(fā)現(xiàn)光自養(yǎng)群落在應對持續(xù)干旱時表現(xiàn)出多種抗性策略[16, 49-50].

圖5 (a)種水平指示物種分析,(b)生物膜的功能豐度

2.2.2 不同干濕交替循環(huán)頻率下微生物群落結構的和多樣性分析多樣性采用Sobs、Shannon、Chao1和ACE等指數(shù)來衡量(表1),數(shù)值越大,表明微生物群落的豐富度和多樣性越高.與對照組相比,C1、C3和C5組的豐富度和多樣性指數(shù)均顯示出整體的下降趨勢,尤其是當干濕交替循環(huán)頻率過高時,生物膜內Shannon指數(shù)的降低最為顯著(C3,=0.012; C5,=0.02).可見,經干濕交替循環(huán)處理后,生物膜內微生物群落多樣性和豐富度會降低.

表1 不同干濕交替循環(huán)頻率下生物膜的Sobs, Shannon, Chao1, ACE指數(shù)

注:*< 0.05;1Sobs:觀察到的物種數(shù)量(OTUs).

多樣性分析使用基于Bray-Curtis距離進行的非度量多維尺度(NMDS)分析(圖6),結果顯示,經干濕交替循環(huán)后生物膜內菌群在NMDS圖中具有明顯的成簇聚集現(xiàn)象,且相似性分析ANOSIM進一步證實四組之間的顯著差異(=0.001),該結果表明不同干濕交替循環(huán)頻率對生物膜內微生物群落的多樣性有顯著影響,且當干濕交替循環(huán)頻率過高(C5)時,生物膜內微生物群落差異更大.

圖6 基于Bray-Curtis差異的NMDS

2.3 生物膜對干濕交替循環(huán)潛在的抵抗和恢復機制

棲息在間歇性河流生物膜中的微生物群落會使用多種抗性機制來使他們能在不利的環(huán)境條件下生存,比如生物膜內的異質組合由于其三維空間和一致性可防止干燥,且可作為捕獲生物膜基質中營養(yǎng)物質和有機物的關鍵點而有利于微生物群落的生存[51].在本研究中我們發(fā)現(xiàn),一定程度干濕交替循環(huán)頻率(C3)下生物膜內微生物群落EPS含量增加,這得益于EPS 層可增強水合作用來緩沖細胞使其抵抗中度干燥[52-53].在不同處理(C1、C3和C5)的干濕交替循環(huán)頻率下,均觀察到群落豐富度和多樣性的降低,這是由于生物膜會通過降低微生物群落多樣性,同時增加抗旱菌群來抵抗干旱.其中,C1和C3處理下變形菌門豐度增加,變形菌已被證實具有一定的抗干燥能力[43],而當干濕交替循環(huán)頻率過高(C5)時,與藍藻相關的細菌成為優(yōu)勢菌,使其在高頻率干濕交替循環(huán)下生存并成為優(yōu)勢菌,一方面是由于藍藻菌群具有保持水分的能力[45],另一方面是由于此類菌群會通過休眠來抵抗干燥[54].此外,我們還發(fā)現(xiàn),當干濕交替循環(huán)頻率過高(C5)時,生物膜功能由原來的化能異養(yǎng)功能轉變?yōu)楣饽茏责B(yǎng)功能,這是由于光能自養(yǎng)群落能在應對持續(xù)干旱時表現(xiàn)出抗性[47].且指示物種分析結果表明,不同頻率的干濕交替循環(huán)下的菌群有所不同,且沒有恢復到初始狀態(tài),這正如Marxsen等[55]所報道的那樣,干濕交替循環(huán)造成的細胞死亡和持久損害降低了微生物群落豐富度、多樣性及其代謝潛力.以上結果表明,當微生物群落受到較低頻率干濕交替循環(huán) (C1)時,其結構和功能會維持原狀,表現(xiàn)為抵抗力,而隨著干濕交替循環(huán)頻率的增加(C3),微生物群落的結構會發(fā)生改變,且當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜耐受程度時,其結構和功能均會發(fā)生改變,并使其達到一種新的穩(wěn)定狀態(tài)來構建其耐旱機制,即表現(xiàn)為恢復力.

3 結論

3.1 干濕交替循環(huán)頻率對生物膜形態(tài)結構的影響主要表現(xiàn)在生物膜厚度、EPS含量和活/死菌比例這幾個方面,而生物膜的比表面積和粗糙度系數(shù)無顯著性變化.具體而言,與對照相比,生物膜厚度隨干濕交替循環(huán)頻率的增加而顯著減少了4.57μm(< 0.05).EPS含量在干濕交替循環(huán)頻率較低(C1)時減少了0.75μm3/μm3,這是由于生物膜內微生物群落會通過消耗自身EPS內的碳水化合物來維持其維持新陳代謝,隨著干濕交替循環(huán)頻率的增加(C3),生物膜通過增加2.51μm3/μm3的EPS含量來保護細菌免受脫水的傷害,生物膜內活/死菌比例相應增大了1.09,而當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜耐受程度(C5)時,大量微生物死亡,生物膜內活/死菌比例下降了2.89,從而導致EPS的劇烈減少2.86μm3/μm3(< 0.05).

3.2 干濕交替循環(huán)頻率對生物膜內微生物種群結構、多樣性和功能的影響主要表現(xiàn)在不同干濕交替循環(huán)頻率(C1、C3和C5)下生物膜內形成了不同的優(yōu)勢菌群,指示物種發(fā)生改變,群落豐富度和多樣性降低.在較低干濕交替循環(huán)頻率(C1和C3)下,生物膜功能沒有發(fā)生改變,均表現(xiàn)為以化能異養(yǎng)功能為主,而當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜耐受程度(C5)時,生物膜功能表現(xiàn)為以光能自養(yǎng)功能為主.

3.3 在低頻率干濕交替循環(huán)(C1)下,生物膜內微生物群落的生存策略以抵抗力為主,優(yōu)勢菌為具有抵抗干燥能力的變形菌;而隨著干濕交替循環(huán)頻率的增加(C3),生物膜內出現(xiàn)明顯的團聚現(xiàn)象,結構發(fā)生改變,且當干濕交替循環(huán)頻率超過生物膜耐受程度(C5)時,生物膜中出現(xiàn)大量絲狀藻類,優(yōu)勢菌由變形菌轉變?yōu)榕c藍藻相關的細菌群落,這是因為與藍藻相關的細菌不僅具有保持水分的能力,而且可通過休眠階段來抵抗干燥,并且在高頻率干濕交替循環(huán)下生物膜功能發(fā)生改變,這表明在高頻率干濕交替循環(huán)下生物膜內微生物群落的生存策略以恢復力為主.

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Effects of alternate drying-wetting cycles on biofilm characteristics and their microbial communities.

LI Chun-yan1,2, XIE Shan-shan1,2, WANG Wen-wen1,2, ZHU Shi-jun1,2, WEN Chen1,2, LI Ni-hong1,2, LUO Xia1,2*

(1.Institute of International Rivers and Eco-Security, Yunnan University, Kunming 650500, China；2.Yunnan Key Laboratory of International Rivers and Transboundary Eco-Security, Kunming 650500, China)., 202343(2)：854～862

The periphytic biofilm was sampled in natural environment and cultivated under indoor controlled conditions to clarify the biofilm resistance mechanisms under the influence of alternate drying and wetting cycles. The morphology, microbial community structure, diversity and function of natural biofilms were examined using 16S rRNA gene high throughput sequencing and confocal laser scanning microscopy. The results showed that biofilm thickness was reduced from 9.10 to 6.46 μm with the increase of alternate drying-wetting cycles from one (C1) to five (C5). The extracellular polymer content decreased from 2.64 μm3/μm3(control) to 1.9 μm3/μm3(C1), and then increased from 4.41 μm3/μm3(C3) to 1.54 μm3/μm3(C5,=0.004). The ratio of live/dead bacteria increased from 2.52 (C1) to 3.60 (C3), and then decreased to 0.72(C5,=0.009). However, the changes in surface area to volume ration and roughness coefficient with the alternate drying and wetting cycles were not significant compared to the control. In contrast to the control, the richness and diversity of the microbial community decreased and the indicator species changed when biofilm exposed to alternate drying and wetting cycles. The dominant bacteria in biofilm shifted from Proteobacteria to Cyanobacteria-related flora when the alternate drying and wetting cycles reached to five (C5). Moreover, functional groups associated with photoautotrophy became the most abundant. Therefore, biofilm morphology and microbial community structure were associated with the alternate drying and wetting cycles. Microbial communities exhibited high degrees of resistance under lower alternate drying and wetting cycles, whereas showed high degrees of resilience to increased alternate drying and wetting cycles.

alternate drying-wetting cycles；biofilm；microbial community；resistance；resilience

X172

A

1000-6923(2023)02-0854-09

李春艷(1997-)女,云南省昭通人,云南大學碩士研究生,主要從事環(huán)境污染監(jiān)測和修復研究.

2022-07-11

國家自然科學基金資助項目(42167053,41807472);云南省基礎研究計劃優(yōu)秀青年項目(202001AW070020);云南省千人計劃“青年人才”項目(YNQR-QNRC-2018-123,C619300A019)

* 責任作者, 副研究員, luoxia@ynu.edu.cn