伊 惠，曹 兵

（1.山東省泰安市畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東泰安 271000；2.滕州市畜牧漁業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，山東棗莊 277500）

貉細(xì)小病毒可以引起貉出現(xiàn)嚴(yán)重的腸炎癥狀，包括嘔吐、排血樣糞便、精神沉郁、厭食等。在幼貉群體中常常出現(xiàn)地方性流行的特點，而在成年貉群體中感染后呈現(xiàn)多種隱性或慢性感染。該病在每年的6—9月多發(fā)，主要的傳染源為患病貉，即使康復(fù)后自身攜帶免疫力，仍然可以向環(huán)境排毒，健康貉通過呼吸道和消化道感染。1988 年，夏咸柱等[1]在不同地區(qū)分離鑒定了3 株貉細(xì)小病毒，首次證實了我國存在貉細(xì)小病毒。近年來在山東地區(qū)貉細(xì)小病毒也有相關(guān)報道。2016，于佳玉等[2]在泰安地區(qū)分離鑒定了3 株貉細(xì)小病毒，系統(tǒng)進(jìn)化分析屬于CPV-2 型；2020 年，葛向平[3]在山東某貉養(yǎng)殖場分離到一株貉細(xì)小病毒，同樣屬于CPV-2 型。本研究通過實驗室診斷，鑒定分離到一株貉源細(xì)小病毒，并為養(yǎng)殖場制定了針對性的防治措施，為貉源細(xì)小病毒的實驗診斷與預(yù)防治療提供參考。

1 病例的發(fā)病情況介紹

在山東省泰安市某貉養(yǎng)殖場，患病貉出現(xiàn)精神沉郁，嘔吐、腹瀉等腸炎癥狀，剖檢后觀察到腸黏膜出血，腸系膜淋巴結(jié)出現(xiàn)水腫充血。根據(jù)患病貉的臨床癥狀結(jié)合剖檢病變，初步懷疑該病例為細(xì)小病毒感染，為進(jìn)一步確定病原，需進(jìn)一步進(jìn)行實驗室診斷。

2 病毒分離培養(yǎng)與鑒定

2.1 病毒分離培養(yǎng)

采集患病貉的糞便加入總體積90%的生理鹽水，制備成懸液。12000r/min 離心10min，取上清加入等體積的氯仿，再次12000r/min 離心10min，吸出氯仿既為病毒液。用0.22mm 濾器進(jìn)行過濾除菌后按照同步接種的方式，以5%比例接種于CRFK 細(xì)胞中，培養(yǎng)72h，觀察是否有病變，若無明顯病變，將細(xì)胞凍融3 次后，從新接入生長良好的細(xì)胞中，按此方法盲傳3 代后觀察病變。F3 代培養(yǎng)48h 后細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、拉絲、脫落等明顯病變，如圖1A 所示。而正常的對照細(xì)胞狀態(tài)良好，如圖1B 所示。

圖1 CRFK 細(xì)胞病變情況

2.2 細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）測定

取病變明顯的F3 代細(xì)胞培養(yǎng)病毒液反復(fù)凍融3次，按照10 倍稀釋法進(jìn)行103～108稀釋，將稀釋好的病毒接種于CRFK 細(xì)胞96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.1mL 病毒稀釋液，每個稀釋度重復(fù)8 個孔，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，觀察病變并記錄有病變的孔數(shù)，按照ReedMuench 法進(jìn)行TCID50 的計算。測得該細(xì)小病毒分離株的TCID50 為10～5.5/0.1mL。

2.3 豬紅細(xì)胞凝集試驗

在血凝板中加入25μL 的PBS，在第1 個孔中加入待測的病毒液，依次倍比稀釋之第11 孔，棄去，第12 孔為陰性對照。在每個孔中加入1%的豬紅細(xì)胞，震蕩混勻后放置到4℃冰箱中，作用1h 后觀察結(jié)果。結(jié)果顯示該細(xì)小病毒分離株3～6 代病毒培養(yǎng)液的血凝效價基本穩(wěn)定在28。

2.4 PCR 擴增試驗

把病毒液煮沸5min，然后冰上放置5min 后以此為DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴增，反應(yīng)體系為：10×PCR buffer：2.5μL；dNTP：2μL；上下游引物：0.5μ L；rTaq：0.5μL；加ddH2O 至25μL。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30 個循環(huán)后72℃延伸10min。取PCR 產(chǎn)物5μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。引物序列如下：F：5'-GCTACTCAGCCACCAACT-3'；R：5'-TAAGCCCAATGCTCTATT-3'。經(jīng)過PCR 擴增后凝膠電泳觀察結(jié)果，如圖2 所示，出現(xiàn)預(yù)期300bp 大小的特異性條帶，結(jié)果表明，該分離毒株為貉細(xì)小病毒。

圖2 PCR 擴增結(jié)果

2.5 間接免疫熒光試驗

將生長狀態(tài)良好的CRFK 細(xì)胞，消化傳代后加入到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mL，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，每孔加入40μL F3 代病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，作用3h 后使用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入100μL 4%多聚甲醛（PFA）固定液，室溫固 定15min，用PBS 洗滌殘留的固定液后，用0.25%Triton X-100 處理細(xì)胞20min，PBS 洗去通透溶液，把抗CPV-2 型VP2 蛋白的一抗按照1∶400 比例稀釋到PBS 溶液中，加入稀釋好的一抗后放置4℃冰箱孵育過夜，用PBS 溶液洗滌細(xì)胞3 次，以去除多余的抗體。再使用TRITC 標(biāo)記的二抗按照1∶500 比例稀釋到PBS 溶液中，加入稀釋好的二抗室溫孵育1h。用PBS 洗滌去除殘留的抗體。進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察。如圖3 所示：在接種F3 代病毒組可以觀察到特異性綠色熒光，而正常的細(xì)胞對照組沒有綠色熒光。

圖3 間接免疫熒光結(jié)果

3 防治措施

3.1 加強養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理

對死亡的貉進(jìn)行無害化處理，對養(yǎng)殖舍、籠具進(jìn)行全面消殺；把患病的貉隔離飼養(yǎng)。

3.2 緊急接種疫苗

對養(yǎng)殖場每只貉接種5mL 水貂腸炎滅活疫苗。

3.3 藥物治療

按照患病貉體重每日兩次皮下注射鹽酸嗎啉4mL，阿托品2mL，慶大霉素5mL；同時飼料中添加維生素C、益生菌輔助治療。連續(xù)治療5d 后，患病貉的病情得到有效控制。

4 討論

貉作為細(xì)小病毒的易感動物，近幾年在山東省、河北省等毛皮動物養(yǎng)殖大省，貉細(xì)小病毒病均有報道[2-5]，細(xì)小病毒已經(jīng)成為威脅毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。實驗室分離鑒定，可以更加準(zhǔn)確的鑒定病原，從而科學(xué)的指導(dǎo)臨床治療。目前防控貉細(xì)小病毒常用的疫苗主要有兩種：一種是水貂腸炎滅活苗，另一種是水貂腸炎與水貂犬瘟熱的二聯(lián)疫苗。雖然水貂腸炎病毒與貉細(xì)小病毒具有很高的基因同源相似性，但在VP2 結(jié)構(gòu)蛋白關(guān)鍵位點上有所不同，因此，研發(fā)有針對貉源細(xì)小病毒的疫苗非常有必要性。